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Biology

Appartement Mont Préparation pour l'observation et l'analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Abstract

L'embryon de poisson zèbre est maintenant couramment utilisé pour la recherche fondamentale et biomédicale pour étudier le contrôle génétique des processus de développement et de modéliser les anomalies congénitales. Au cours de la première journée de la vie, l'embryon de poisson zèbre progresse dans de nombreux stades de développement, y compris la fertilisation, le clivage, la gastrulation, la segmentation et la organogenèse de structures tels que les reins, le coeur et le système nerveux central. L'anatomie d'un jeune embryon de poisson zèbre présente plusieurs défis pour la visualisation et l'analyse des tissus impliqués dans un grand nombre de ces événements parce que l'embryon se développe en association avec une masse jaune rond. Ainsi, pour une analyse précise et l'imagerie des phénotypes expérimentales dans des spécimens embryonnaires fixes entre le bourgeon caudal et 20 stade de somite (10 et 19 heures après fertilisation (hpf), respectivement), telles que celles colorées en utilisant l'ensemble de montage d'hybridation in situ (WISH) dans, il est souvent souhaitable d'éliminer l'embryon à partir du jaune btout et pour le positionner à plat sur une lame de verre. Cependant, l'exécution d'une procédure de montage à plat peut être fastidieux. Par conséquent, la réussite et l'efficacité de montage plat préparation est grandement facilitée par la mise en évidence visuelle de la technique de la dissection, et ont également contribué à l'aide de réactifs qui facilitent la manipulation optimale des tissus. Ici, nous offrons notre protocole de souhaits pour la détection d'une ou deux couleurs de l'expression du gène dans l'embryon de poisson zèbre, et montrons comment la procédure de montage à plat peut être effectuée sur cet exemple d'un échantillon fixe colorées. Ce protocole de montage plane est largement applicable à l'étude de nombreuses structures embryonnaires qui se dégagent au cours du développement précoce du poisson zèbre, et peut être mis en œuvre conjointement avec d'autres méthodes de coloration effectués sur des échantillons d'embryons fixes.

Introduction

Le poisson zèbre, Danio rerio, est devenu un organisme largement utilisé dans l'étude de la biologie du développement. Poisson zèbre sont une tropicales, les espèces d'eau douce de vertébrés appartenant à la famille des cyprinidés. Poisson zèbre ont été initialement utilisées pour la recherche environnementale pour obtenir des informations sur les dangers des polluants potentiels de l'eau, car ils étaient faciles à obtenir, peu coûteux et facile à entretenir 1. Au cours des trente dernières années, le poisson zèbre a été reconnue comme un système de modèle vertébré génétiquement docile pour une foule de raisons. Poisson zèbre montrent un niveau élevé de conservation anatomique et physiologique avec les vertébrés supérieurs, y compris les mammifères 2,3. Récente annotation de la séquence du génome ont révélé qu'environ 70% des gènes humains ont au moins un homologue de poisson-zèbre 4. Par exemple, de nombreux gènes orthologues qui jouent un rôle important au cours du développement du rein ont été identifiés entre ces espèces 5-7. Cette dradegré de conservation matic en ce qui concerne la biologie cellulaire et moléculaire ont permis aux chercheurs de créer des modèles pour un large éventail de maladies humaines chez le poisson zèbre 8, et le poisson zèbre sont devenus un outil précieux pour identifier les thérapies médicamenteuses potentielles en utilisant des écrans génétiques chimiques 9.

En outre, le modèle de poisson zèbre est non seulement capable de récapituler une variété de processus complexes de développement et d'états pathologiques qui sont vus dans l'homme, mais plusieurs attributs supplémentaires accroître également son appel comme un organisme modèle pour les études embryologiques. Poisson zèbre sont ovipares et reproduire par la ponte de diffusion, qui fournit aux chercheurs un accès facile aux embryons dès le début de la fécondation 10. D'autres avantages comprennent la taille de l'embryon, la transparence, et le développement rapide externe 10. En outre, les adultes de poisson zèbre possèdent une fécondité élevée et produisent généralement des tailles relativement importantes d'embrayage qui peut varier entre 200-500par semaine, en fin de compte permettre aux chercheurs de réaliser des expériences à haut débit, tels que les écrans chimiques phénotype base, avec la facilité 9.

Même si, malgré la pléthore d'avantages qui sont présentés par le modèle de poisson zèbre, il ya des défis qui se rapportent à l'analyse et la communication des résultats expérimentaux obtenus à partir des stades de développement précoces. Dans certains cas, l'anatomie inhérente de l'embryon de poisson zèbre pourrait occulter la visualisation des données de l'une. Après la fécondation, la cellule initiale subit de multiples événements de clivage au cours du développement 11. À la suite de la gastrulation, l'axe embryonnaire émerge au stade de bourgeon caudal (10 hpf) de telle sorte qu'elle est enroulée autour du jaune 11. Comme le développement ultérieur progresse à travers la période de segmentation, le tronc va croître en masse et aussi de prolonger par allongement axial de telle sorte que la queue le long d'une partie du sac vitellin se prolonger à partir de la masse de jaune central11. Entre le bourgeon caudal et 20 stade de somites (19 HPF), les tentatives d'observer les caractéristiques spécifiques de développement après l'utilisation de différents protocoles de coloration, comme WISH, peut être difficile à la fois de visualiser et de photographier en raison de la géométrie de l'embryon et de l'opacité de le sac vitellin. Une façon d'éliminer ces défis est d'enlever le jaune puis aplatissez l'embryon dans un échantillon à deux dimensions qui peut être analysée de manière plus simple.

Les ressources de protocole et vidéo suivants fournissent un guide pour savoir comment deyolk succès et plat monter un embryon après fixation et coloration, en utilisant l'exemple d'une ou deux couleurs WISH coloration. WISH est une technique largement utilisée qui permet la détection d'acides nucléiques spécifiques dans des échantillons conservés et permet pour le site (s) de l'expression du gène à détecter au sein des tissus ainsi. techniques WISH ont été largement décrits et peuvent être réalisées avec différents substrats de couleurs ainsi que la grippesystèmes de détection orescent 12-20. Ici, nous offrons notre protocole de WISH modifié utilisé pour les embryons de poisson zèbre entre les étapes de bourgeon caudal et la segmentation de développement. Protocoles WISH alternatifs, cependant, sont compatibles avec la procédure plat montage décrit ici, comme indiqué au début du protocole ci-dessous. En outre, montage à plat pourrait être utilisé en conjonction avec un certain nombre de techniques de visualisation existants, comme tout immunohistochimie de montage, ou des étiquettes de suivi de la lignée cellulaire, qui ne sont pas décrites dans ce protocole. Dans l'ensemble, la technique de montage à plat peut mieux permettre une meilleure analyse et la présentation des données obtenues à partir d'expériences avec les premiers stades du développement embryonnaire chez le poisson zèbre.

Protocol

Les procédures pour travailler avec embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par l'établissement de soins et d'utilisation des animaux Comité à l'Université de Notre Dame. Note: Les procédures décrites dans les parties 1-5 ont été utilisés pour générer les images d'embryons fournis ici dans les résultats représentatifs. Les procédures décrites dans les parties 1 à 5 peuvent être substitués si besoin avec d'autres procédures WISH 12-16 ou d'autres techniques de visualisation telles que marquage immunohistochimique de protéines spécifiques en utilisant des anticorps spécifiques. Dans l'exercice de supports à plat sur des embryons de poisson zèbre WISH le protocole décrit dans les parties 1-5, la fixation de l'embryon initial et final étapes coloration de fixation sont les principales manipulations qui affectent la capacité d'éliminer les granules de jaune de l'échantillon pour montage à plat. Les meilleurs résultats de montage à plat sont obtenus lorsque la première fixation est réalisée avec de la glace fraîchement décongelé froid 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS 1x et la fixation d'la réaction de coloration finale WISH avec de la glace froide 4% PFA/1x PBS (qui n'a pas besoin d'être fraîchement décongelé), et il est conseillé aux lecteurs de considérer ce cas de substitution de méthodes de coloration en combinaison avec d'autres pièces 6-8.

1. Collecte d'embryons, Fixation et stockage

  1. Préparer des cages d'accouplement en plaçant le poisson zèbre mâle adulte (s) et femelle (s) dans les chambres de l'eau du système de sorte qu'ils sont séparés par un diviseur pendant une nuit.
  2. Retirez les séparateurs entre les adultes et de recueillir les œufs fécondés à l'aide d'un fil à maille fine passoire à thé dans ~ 15-30 min de l'accouplement de recueillir embrayages qui ont stades embryonnaires équivalents.
  3. Tournez le filtre à l'envers et rincer la surface avec un jet fin de l'E3 distribué à partir d'un vaporisateur de transférer les embryons dans des boîtes d'incubation contenant environ 25 ml de solution E3.
  4. Après avoir recueilli les embrayages, les diviser en plusieurs plats tels que environ 50-60 embryons sont incubésdans chaque plat de 25 ml d'une solution E3. Remarque: Le surpeuplement des embryons peut conduire à asynchronisme développement dramatique dans l'embrayage et les soins devraient être prises pour éviter ce pour permettre la collecte en temps opportun de la scène (s) souhaitée.
  5. Incuber les embryons à 28,5 ° C pour permettre une évaluation du développement conformément à la série de mise en scène norme poisson zèbre 11.
  6. Utiliser une pipette de transfert en plastique à placer délicatement le nombre désiré d'embryons au point de temps choisi, jusqu'au stade 20 somites (19 HPF), dans un tube à centrifuger fond plat. Remarque: Faites attention lors de la manipulation des jeunes embryons, car ils sont fragiles et peuvent être facilement endommagés par écrasement ou la manipulation agressive avec des pipettes de transfert. En variante, des flacons en verre peuvent être utilisés pour la fixation et le traitement des embryons. Pour tous les lavages ultérieurs de protocole pipettes de transfert en plastique peuvent être utilisés, à l'exception de l'addition et l'enlèvement de la ribosonde (Etapes 3.11, 3.14).
  7. Remplacer l'E3 avec de la glace froide 4% PFA/1x PBS, etfixer les embryons dans leurs chorions à 4% PFA/1x PBS pendant 4 heures à température ambiante ou à 4 ° C pendant la nuit. Mise en garde: PFA est toxique et solutions PFA doit être manipulé à une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire. En outre, la poudre PFA doit être manipulé avec un soin exceptionnel lors de la solution mère, comme même la PFA granulé peut avoir tendance à se disperser dans la charge statique. Typiquement PFA est préparée par chauffage de la PBS 1x à ébullition pour dissoudre la poudre de PFA, puis la solution est stockée en aliquotes à -20 ° C. Si sédiments fins sont présents dans le PBS à 4% PFA/1x une fois la solution est refroidie, stériliser par filtration la solution refroidie avant d'aliquotage de stockage en congélation en le faisant passer à travers un système de filtre de 0,45 um. Seulement fraîchement préparée ou fraîchement décongelé PFA est utilisé pour ce initial (primaire) fixation de l'embryon.
  8. Retirer le correctif et laver les embryons à deux reprises avec 1x PBST, puis les transférer dansun plat d'incubation.
  9. Voir les embryons sous un stéréomicroscope et utiliser deux paires de pinces fines pour enlever les chorions entourant les embryons, tels qu'une paire est utilisée pour tirer parti doucement l'embryon alors que la seconde paire est utilisée pour déchirer le chorion.

2. Embryon Permeablization

  1. Transférer les embryons dechorionated dans le tube à centrifuger ou flacon en verre, puis rincer deux fois avec 1x PBST pour enlever les débris de chorion restant.
  2. Retirez le 1x PBST et laver les embryons à deux reprises avec 100% de méthanol (MeOH).
  3. Placer les embryons à -20 ° C pendant au moins 20 min. Note: Les embryons peuvent être conservés à -20 ° C dans du MeOH pour un an ou plus. Méthanol rend les chorions collant, par conséquent, ne procédez pas à cette étape à moins que les chorions ont été supprimés.
  4. Réhydrater les embryons en enlevant le 100% de MeOH et lavez-les à température ambiante pendant 5 min chacun dans 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, puis deux fois avec 1x PBST. </ Li>
  5. Préparer une solution de travail de protéinase K frais (5 ug / ml) en ajoutant 25 pi de fraîchement décongelé protéinase K actions (10 mg / ml) à 50 ml de 1x PBST.
  6. Retirez le 1x PBST des embryons, puis remplacez-le par la protéinase K solution de travail et incuber selon le stade embryonnaire: <= 5 somites pendant 1 min; 10-12 somites pour 1,5 min; 15 somites pendant 2 min, et 20 somites pour 3 min.
  7. Retirer la solution de travail de protéinase K et laver les embryons à deux reprises avec 1x PBST.
  8. Retirez le 1x PBST et les remplacer par de la glace froide 4% PFA/1x PBS pendant au moins 20 min à température ambiante.

3. Riboprobe synthèse, Préhybridation, hybridation et suppression de la sonde

  1. Assembler la ribosonde antisens in vitro réaction de transcription à la température ambiante dans un tube de 1,5 ml, tout en gardant les enzymes sur la glace, par combinaison d'une matrice d'ADN contenant une séquence correspondant au gène d'intérêt (soit 100 à 200 ng de PCRproduit ou 1,5 pg de plasmide linéarisé d'ADN, préparé comme décrit 12,13), 2 pl de la digoxygénine ou ribonucleotides marqués à la fluorescéine, 2 ul de l'ARN polymerase approprié (SP6, T3, T7 en fonction de la séquence est incorporée dans le produit de PCR ou présent sur le plasmide d'ADN), 2 pl de tampon 10x de transcription, 0,5 pi d'inhibiteur de RNase, et porter à un volume total de 20 ul avec de l'eau distillée de la biologie moléculaire (DNase, RNase). Remarque: Le tampon de transcription 10x doit être préchauffé en plaçant le tube dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 à 20 min, et ensuite agité par tourbillonnement pour garantir que tous les composants sont en solution. Si flocons blancs sont présents, incuber le tube pour un autre 5-10 minutes et tourbillon de nouveau. réactions de transcription peuvent échouer ou avoir des rendements pauvres si le tampon de transcription n'est pas entièrement dissous et mélangés complètement.
  2. Mélanger et incuber les composants de chaque réaction à 37 ° C pendant 2 heures dans un bain-marie.
  3. Retirer la réaction tuêtre (s) à partir du bain d'eau, et de détruire la matrice d'ADN dans chaque échantillon par addition de 5 ul de 10 x DNase I buffer, 2 ul de DNase I enzyme et 23 pi d'eau distillée pour la biologie moléculaire pour porter le volume total à 50 pi, puis incuber chaque tube à 37 ° C pendant 20 min dans un bain-marie.
  4. Effectuer une précipitation à l'éthanol dans chaque tube à centrifuger en ajoutant 5 ul d'acétate de sodium M 3, pH 5,2 et 110 pi de glace froid éthanol à 100%, suivie par 1 pi de stock de glycogène pour faciliter culot d'ARN visualisation dans les étapes suivantes, puis incuber l' le tube à -20 ° C pendant au moins 1 heure ou une nuit.
  5. Centrifuger chaque tube à centrifuger à une vitesse maximum de 4 ° C pendant 20 min, puis retirez le surnageant de l'éthanol à 100% et le remplacer par 100 ul de 70% éthanol glacé.
  6. Centrifuger chaque tube à centrifuger à 4 ° C pendant 5 min, puis retirer le surnageant d'éthanol à 70% et sécher à l'air le culot pendant 5 min, puis finalement ajouter 100 ul de moqualité moléculaire de l'eau distillée pour remettre le culot et de quantifier la ribosonde concentration du stock en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. Remarque: Une fois le culot a passé en solution, la ribosonde le stock doit être conservé dans la glace et stocké à -20 ° C.
  7. Pour préparer les embryons fixes pour le processus de pré-hybridation, retirer les 4% PFA/1x PBS de chaque échantillon et laver les embryons à deux reprises avec 1x PBST.
  8. Transfert entre 25-40 embryons in 1x PBST dans chaque tube unique à centrifuger à fond plat. Remarque: Le surpeuplement des embryons mènera à coloration inégale plus tard, et les soins devraient être prises pour limiter la taille de l'échantillon dans chaque tube à environ 40 embryons.
  9. Remplacez le 1x PBST dans chaque tube 500-1000 pi de HYB +.
  10. Placer le tube (s) d'embryons dans un four réglé à 70 ° C, et les incuber à cette température pendant 4 heures pour effectuer une pré-hybridation.
  11. Préparer la ribosonde / HYB + solution en ajoutant 100-500 ng de ribosonde (digoxigénine et / ou Déessein marqué) à 500 pi de frais HYB + et puis incuber cette solution à 70 ° C pendant au moins 20 min avant l'étape 3.11 Préchauffez il. Remarque: Pour détecter de multiples transcrits de gènes, en utilisant un marquage colorimétrique simple et / ou double, chacune des ribosondes correspondant à ces gènes doivent être combinés en un seul ribosonde / HYB + cocktail.
  12. Retirez le HYB de pré-hybridation + de chaque tube d'embryons et de le remplacer avec suffisamment de ribosonde / HYB + pour couvrir les embryons. Remarque: En général, 200-250 pi de ribosonde / HYB + est nécessaire pour couvrir les embryons dans un tube plat à centrifuger fond. Riboprobe / HYB + ajout et la suppression est généralement effectuées à l'aide d'une pipette et barrière conseils pour prévenir la contamination croisée entre les échantillons.
  13. Incuber les embryons à 70 ° C pendant une nuit avec ribroprobe / HYB +.
  14. Préparer l'ensemble des solutions de lavage et préchauffer les suivre pendant une nuit à 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT, et 0,2 x SSCT. Remarque: Il est commode de préparer 50 ml aliquots de chaque solution de lavage, parce que l'excès peut être conservé à température ambiante, puis chauffé de nouveau pour une utilisation future.
  15. Retirer la ribosonde / HYB + aide d'une pipette et barrière conseils et conserver à -20 ° C. Remarque: En général, chaque ribosonde / HYB + mélange peuvent être utilisés plusieurs fois (par exemple, 3 ou plus) sans diminution de signaux. Bien que réutilisé ribosonde / HYB + est associée à fond inférieur, cependant, garder à l'esprit que réutilisés mélanges Riboprobe peuvent être soumis à une dégradation.
  16. Laver les embryons à deux reprises avec 50% SSCT formamide/2x pendant 30 min à 70 ° C.
  17. Laver les embryons une fois avec 2x SSCT pendant 15 min à 70 ° C.
  18. Laver les embryons à deux reprises avec 0,2 x SSCT pendant 30 min à 70 ° C.
  19. Retirez le SSCT de 0,2 x et laver les embryons à deux reprises avec MABT à la température ambiante.

4. Anti-digoxigénine Incubation de l'anticorps et la détection

  1. Préparer la solution de nouveau bloc.
  2. Retirez le MABT et le remplacer par bloc solutiontion.
  3. Incuber les embryons dans une solution de bloc pour 2-4 heures à température ambiante. Remarque: plus longues incubations de blocs fournissent des résultats optimaux avec les jeunes embryons de poisson zèbre étapes (<15 somites). Pour ce faire la procédure de bloc longue, effectuer le bloc d'incubation 8-12 heures à la température ambiante ou à une combinaison de la température ambiante plus (jusqu'à ~ 8 h) une suite de 4 ° C une nuit d'incubation.
  4. Préparer la solution d'anticorps anti-digoxigénine en faisant une dilution d'un facteur 5000 dans une solution fraîche de bloc (par exemple, 1 pi par 5 ml de bloc).
  5. Retirer le bloc et ajouter la solution d'anticorps / séquencé.
  6. Couvrir l'échantillon dans du papier et incuber pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à température ambiante.
  7. Retirez le anti-digoxygenin/block et laver les embryons au moins 10 fois avec MABT. Remarque: Le transfert des embryons de boîtes de 12 puits pour les lavages de MABT. Cela augmente la vitesse à laquelle les embryons peuvent être lavés, ce qui est utile lors du traitement de grandes quantités d'échantillons, une, il est facile de suivre les progrès de la réaction de coloration (étape 4.11) sous un stéréomicroscope. Note: À cette étape, les embryons peuvent être «super-lavé" par incubation pendant la nuit dans MABT à 4 ° C avant de passer à l'étape 4.8, qui est un traitement utile pour les sondes qui ont tendance à accorder une grande arrière-plan ou les taches qui nécessitent une longue surveillance au cours de la travailler jour.
  8. Préparer le tampon de pré-coloration et de la solution de coloration souhaitée (substrat violet ou rouge).
  9. Retirez le MABT et laver les embryons dans un tampon de pré-coloration pendant 5 min à température ambiante.
  10. Retirez le tampon de pré-coloration et ajouter la solution de coloration.
  11. Surveiller la progression de la température ambiante, chaque réaction de coloration de 15 à 30 min en contrôlant l'apparition des embryons sous un stéréomicroscope. Remarque: La vitesse de la réaction de coloration peut être ralentie en transférant les échantillons à 4 ° C, si il est nécessaire de donner plus de temps pour l'achèvement de la tache. Une fois refroidi à 4° C, cependant, la réaction ne peut pas être accélérée par chauffage à température ambiante.
  12. Lorsque la réaction de coloration est terminée, retirez la solution de coloration et le remplacer par 1x PBST.
  13. Laver deux fois avec 1x PBST pendant 5 min. Remarque: Si ce n'est pas la détection d'autres gènes avec un autre substrat, puis fixer les échantillons dans de la glace froide 4% PFA/1x PBS pendant au moins 20 min, et passez à l'étape 6.1. Sinon, passez à l'étape 5.1.

5. Anti-fluorescéine Incubation de l'anticorps et la détection

  1. Retirez le 1x PBST et laver les embryons deux fois avec 0,1 M de glycine, pH 2,2 pendant 15 min chacune à la température ambiante. Remarque: Le temps pour les lavages de glycine est indispensable de désactiver complètement la première réaction de coloration.
  2. Retirer la glycine 0,1 M et le laver deux fois avec des embryons MABT pendant 5 min à température ambiante.
  3. Préparer la solution d'anticorps anti-fluorescéine en faisant une dilution d'un facteur 5000 dans une solution fraîche de bloc (par exemple, 1 pi par 5 ml de bloc).
  4. Retirez le MABT et ajouter la solution d'anticorps / bloc. Suivez les étapes 4.6 à 4.13 pour effectuer la détection de la ribroprobe marqué à la fluorescéine. Remarque: Lors de la réaction de coloration finale est terminée, il est essentiel que la dernière fixation de l'échantillon se fait dans de la glace froide 4% PFA/1X PBS. Fixation des solutions chaudes PFA tend à être associée avec le jaune collante qui est difficile à retirer de l'embryon lors de la dissection et deyolking pour la procédure de montage plat.

6. Embryon Dissection et Deyolking initiale de l'embryon

  1. Sélectionner un embryon teinté fixe pour montage à plat.
  2. Utiliser une pipette de transfert pour placer l'échantillon de l'embryon sélectionné dans un plat en plastique ou en verre de Pétri contenant 1x PBST.
  3. Placez le plat sous un microscope stéréoscopique, et rouler l'embryon en utilisant une paire de pinces fines ou outil cils de sorte qu'une vue latérale est obtenue et les extrémités de tête et de queue sont visualisés.
  4. Utilisez une paire de pinces fines pour faire une incision dans ee jaune à une position située au milieu entre la tête et la queue de l'embryon, et en même temps d'utiliser une deuxième paire de pinces fines pour contenir l'embryon de manière à constituer un levier pour l'incision de jaune d'oeuf. Remarque: Vous pouvez faire deux grandes incisions dans le jaune, l'un près de la tête et l'autre près de la queue de l'embryon.
  5. Utilisez une pince fine et / ou un outil fouet à évider le jaune de la cavité de la cellule jaune.
  6. Rincer l'embryon doucement avec 1x PBST pour enlever le jaune parasite.

7. Beaux Deyolking de l'embryon

  1. Transférer l'embryon sur une lame de verre plat avec 1-2 gouttes de 1x PBST.
  2. Utilisez un outil de fouet et des pinces fines pour positionner doucement l'embryon avec le (jaune) face ventrale vers le haut sur la lame de verre.
  3. Faire glisser l'embryon jusqu'au bord de la solution PBST 1 x à l'aide de l'outil de mèche de sorte que l'embryon reste dans une position à plat contre la lame de verre.
  4. Grattez la surface ventrale de l'embryon doucement à l'aide du fouet àol pour éliminer les granules de jaune sans déchirer l'embryon. Utiliser simultanément une paire de pinces fines pour ancrer l'embryon tout en grattant avec l'outil de cils. Remarque: L'élimination des granules de jaune d'œuf peut exiger raclage répétitive pendant 5-10 min.
  5. Si la solution de PBST devient encombré avec un excès de jaune ou commence à s'évaporer, ajouter 1-2 gouttes frais de 1x PBST à la diapositive à l'aide d'une matière plastique ou le transfert de verre pipette, puis faites glisser l'embryon dans la région avec la solution propre pour plus jaune granule enlèvement.
  6. Lorsque le jaune a été retiré de manière satisfaisante, utiliser une pipette de transfert pour déplacer doucement l'embryon de retour dans un plat en plastique ou en verre de Pétri contenant 1x PBST pour un rinçage final pour éliminer les granules de jaune errants.
  7. Transférer l'embryon deyolked utilisant une pipette de transfert de matière plastique ou de verre dans une boîte de Petri en matière plastique ou en verre contenant 100% de glycerol.
  8. Incuber l'embryon dans 100% de glycérol pour ~ 5 min à acclimater l'embryon.

8. Sur une lame de verre

  1. Transférer l'embryon deyolked sur une lame de verre propre dans 1-2 gouttes de 100% de glycérol.
  2. Positionner l'embryon avec le (jaune) en regard de la face ventrale lame de verre.
  3. L'utilisation d'un outil de cils, faire glisser l'embryon au bord de la goutte de glycérol de sorte que l'embryon reste dans une position à plat contre la lame de verre. Si l'axe embryonnaire est courbe, utiliser les pinces fines pour faire doucement de très petites incisions dans la membrane de la cellule jaune restant pour soulager la tension de sorte que l'embryon peut être placé à plat sur la lame avec un axe droit.
  4. Placer petites mottes de pâte à modeler sur les quatre coins d'une lamelle couvre-objet 18 x 18 mm du verre. Remarque: En variante, les petites gouttes de graisse à vide 15 peut être remplacé par la pâte à modeler.
  5. Placer la lamelle de verre lentement sur l'embryon, inclinant la lamelle couvre-objet, afin de minimiser la génération de bulles d'air dans le glycérol autour de l'échantillon.
  6. Ajouter une baisse supplémentaire de 100% de glycérolsur le côté de la lamelle couvre-objet en verre pour remplir l'espace entre la lamelle et la lame de verre.
  7. Enfoncer lentement et avec précaution sur les quatre coins de la lamelle couvre-objet à positionner fermement l'embryon entre le verre et éliminer la dérive. Remarque: Veillez à ne pas écraser l'embryon.
  8. Si l'embryon n'est pas positionné comme souhaité, utilisez une pince fine pour retirer la lamelle. Utilisez l'outil de fouet à repositionner l'embryon et / ou une pince fine à faire des incisions supplémentaires pour que l'embryon peut être repositionné. Répétez les étapes 8.4 à 8.7.
  9. Observer et / ou l'image de l'échantillon en utilisant soit un microscope stéréo ou composé.
  10. Rangez le plat préparation plat avec un support de diapositives en carton dans l'obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines ou temporairement à la température ambiante monter. Remarque: La tache de WISH va s'estomper progressivement au fil du temps, les réactions de substrat particulièrement rouges, et ne peut pas être conservé dans de la glycérine indéfiniment. Taches pourpres se fanent aussi plus facilement si elles sont conservées dans du glycérol par rapport àPFA (voir l'étape 8.11). Fait intéressant, il a été publié que les embryons de montage dans Permount plutôt que le glycérol peuvent permettre le stockage illimitée à température ambiante 15.
  11. Pour le stockage à long terme de substrat violet échantillons colorés, retirez la lamelle de verre et rincer l'embryon rincé deux fois en 1x PBST, puis les transférer dans un tube à centrifuger à 4% PFA/1x PBS pour le stockage à long terme. Remarque: Vous pouvez également les embryons in 1x PBST peuvent être traitées pour des analyses supplémentaires, tels que l'isolement de l'ADN pour le génotypage.

Representative Results

La procédure de protocole de montage plate implique la transformation de l'embryon de poisson zèbre à partir de son anatomie normale, dans laquelle l'axe du corps est enroulé autour d'un ballon de jaune d'oeuf situé au centre, dans une préparation à deux dimensions (Figure 1A). Tout le montage imagerie du jeune embryon de poisson zèbre est limitée par la nature de la façon dont l'axe embryonnaire est enroulé autour du jaune. En conséquence, une vue latérale ou dorsale de l'ensemble de montage des spécimens d'embryons colorés ne peuvent capter une partie de l'axe ou des tissus particuliers obscurs (figure 1B). Par comparaison, deyolking et aplatissement de l'embryon permet l'ensemble de l'axe embryonnaire de visualiser à la fois (figure 1B). Ces limitations sont mises en évidence par l'examen d'un embryon de WISH souillé qui a été marqué avec ribosondes antisens pour détecter irx3b (violet), qui marque un sous-ensemble des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 7 à 13, et MyoD1 (rouge) qui marque lasomites (figure 1B). Le champ de irx3b + rénales progéniteurs est obscurci dans l'ensemble du montage vue latérale car transcriptions de irx3b sont abondants dans le système nerveux central, ce qui rend le domaine rénale pratiquement impossible à visualiser avec l'angle de caméra latérale; en outre, le domaine de irx3b + progéniteurs rénales n'est que partiellement visible lorsque l'embryon est mis en rotation dans une vue de caméra dorsale parce que le champ est enroulé autour du jaune (figure 1B). Cependant, une vue dorsale du même embryon suivante montage à plat permet l'ensemble du champ de irx3b + progéniteurs rénaux à analyser de manière simple par rapport aux somites sur le tronc et d'autres structures embryonnaires (figure 1B). Ainsi, les domaines spatiaux élaborés peuvent être idéalement documentés avec cette méthode.

Plusieurs étapes majeures sont impliqués dans l'exécution réussie de la procédure de montage plat. Pour effectuer cette technique, la balle de jaune d'oeuf doit être d'abord détaché de l'embryon proprement dit (figure 2A), ce qui peut être fait avec des instruments tels que des fines d'une paire de pinces fines tandis que l'embryon est visualisé en utilisant un stéréomicroscope. Après l'élimination brut de la balle de jaune, un outil de cils amende est utilisé pour gratter granules de jaune qui sont restés attachés à l'embryon (figure 2B). La suppression de granules de jaune d'oeuf restantes permet de faciliter la visualisation des tissus embryonnaires. Enfin, l'embryon deyolked est manipulé pour positionner de manière stable sur une lame de verre (figure 2C), ce qui permet l'observation et des aides à la documentation de l'échantillon en utilisant un logiciel de formation d'image et une caméra fixée au microscope. Les outils cils sont des appareils faits maison qui peuvent être construits par l'apposition d'un coup de fouet adapté à une pointe de pipette à l'aide colle, qui peuvent être montés sur une poignée si vous le souhaitez (figure 3A, table Matériaux). Échantillons de cils différents peuvent être obtenus à produirelash outils avec des caractéristiques légèrement différentes en termes de longueur et conique (figure 3B), qui chaque utilisateur peut avoir différentes préférences pour une fois qu'ils commencent à expérimenter avec la procédure de montage plat. Des exemples d'échantillons cils sont naturellement hangar cils humains, naturellement hangar cheveux ou moustaches nerveux animal, et enfin de variétés synthétiques de cils disponibles dans le commerce ont trouvé dans les départements cosmétiques détail.

La région entourant et contenant l'échantillon (s) placée sur une lame de verre (figure 4A) peut être imagée pour l'analyse à haute résolution. Une combinaison de sondes ont été utilisés pour étiqueter les progéniteurs rénaux développement qui donnent naissance au rein dans le type sauvage embryon à des stades précoces du développement avec deux couleurs WISH, puis plat monter préparations ont été effectuées pour voir les échantillons (figure 4B, 4C ). Au cours des phases précoces des somites, les progéniteurs rénaux sont délimitées dans une courbe en forme de U par eexpression leu de transcriptions (pourpre) de PAX2A entourant le mésoderme paraxial qui exprime de façon concomitante delta C (dlc) (rouge) (colonne de gauche, figure 4B) 6,7. En comparaison, lorsque la transcription de DLC ont été détectées avec un substrat pourpre, et ont été marquées en combinaison avec la Krox20 marqueur cerveau postérieur (rouge), un sous-domaine rostrale des progéniteurs du rein a été visualisée qui exprime dlc (colonne de droite, la figure 4B), comme indiqué précédemment 6,7. Appartement monter préparations peuvent être utilisées de manière similaire à étudier les étapes de somitogenèse plus tard. Au stade de la somite 14, nous avons analysé l'expression de marqueurs rénaux PAX2A, slc4a4, et slc12a3 (violet) avec smyhc1 (rouge), qui marque les somites (figure 4C). Ces combinaisons permettent la cartographie de l'ensemble du domaine de progéniteurs avec PAX2A rénale, tout en révélant que un sous-ensemble de cellules dans une sous-domaine expr rostralEssed slc4a4a et se distinguaient par une caudale sous-domaine non-chevauchement des progéniteurs rénaux qui ont exprimé slc12a3.

WISH deux couleurs et le montage préparation plat sont également précieux pour l'étude des domaines cellulaires pendant l'organogenèse chez le poisson zèbre à des mutations génétiques ou d'autres perturbations de l'exposition environnementale à de petites molécules 6,7 (figure 5). Les nls poisson zèbre et mutants lib abritent des mutations dans l'aldéhyde déshydrogénase 1a2 (aldh1a2, anciennement connu sous le nom raldh2), qui code pour une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l'acide rétinoïque (RA). RA est essentielle pour le bon développement de plusieurs types de cellules rénales, y compris la formation de cellules de podocytes qui contribuent à rendre le filtre de sang du rein embryonnaire, appelée le glomérule 6,7. WISH a été réalisée pour marquer les progéniteurs podocytes avec wt1a en concomitance avec la démarcation de til somites développement avec smyhc1 cerveau postérieur et avec Krox20 dans des embryons de type sauvage, nls embryons mutants, des embryons mutants lib, et les embryons traités avec un inhibiteur de l'enzyme ALDH chimique, DEAB (Figure 5). Embryons avec l'expression de aldh1a2 déficient montré une expression de wt1a réduite par rapport aux embryons de type sauvage, alors que les embryons DEAB-traités ont montré une abrogation de transcriptions de wt1a (Figure 5, colonne de droite). Pris ensemble, ces résultats représentatifs montrent comment la technique de montage à plat peut être utilisé pour analyser et documenter les différences anatomiques avec précision dans l'embryon précoce, et donc être mis en œuvre pour les études de développement de valeur.

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble de la monter préparation platration pour embryons de poisson zèbre. A) La procédure de montage à plat permet l'affichage simultané de tissus le long de l'axe embryonnaire parce que la masse de jaune central est enlevé et l'embryon positionnée de manière stable sur une surface plane. B) Images de toute une montagne SOUHAITENT embryon teinté en vue latérale et dorsale, et puis, après une préparation montage plat a été menée. L'embryon a été coloré avec des sondes antisens pour détecter des transcrits de gènes codant irx3b (violet) et MyoD1 (rouge).

Figure 2
Figure 2. Schéma de la procédure de montage plat pour embryons de poisson zèbre. A) L'embryon est d'abord grossièrement deyolked pour enlever la majorité de la masse de jaune, puis (B) la surface ventrale est finement deyolked pour enlever restants granules de jaune, etaprès lavage de l'embryon est (C) monté côté dorsal vers le haut sur ​​une lame de verre pour analyse visuelle et / ou une image photographique.

Figure 3
Figure 3. Photographies de cils exemple les outils par rapport à une pince fine. A) les outils de cils faits maison ont été imagées à côté d'une paire norme de pinces fines, positionnée adjacente à une règle métrique pour fournir une référence. B) La vue agrandie d'outils cils à côté de la pince fine, avec la référence de millimètre prévu le long du haut de la vue . Deux outils de cils différents sont présentés, avec l'astérisque (*) utilisé pour marquer le fouet obtenu à partir d'un hangar naturellement cils humaine, et double astérisque (**) utilisé pour marquer un coup de fouet qui a été obtenu à partir d'un hangar naturellement félin favori et coupé à faire une fin quelque peu émoussé. Dans chaque casoi, le fouet a été enfilé à travers la pointe de la pipette et fixée à l'aide de plusieurs couches de colle de créer progressivement un joint solide pour stabiliser / ancrer le fouet à la pipette attaché à un dispositif de manipulation.

Figure 4
Figure 4. Caractérisation des changements développementaux dans le domaine de l'ancêtre rénale chez le type sauvage embryon de poisson zèbre. A) Faites glisser schématique indiquant la zone imagée pour analyse (B, C). B) des embryons de type sauvage à la 1, 3 et 5 stade de somites ont été colorées par deux couleurs souhaitent évaluer la composition du champ progénitrices rénale qui donne relever le rein embryonnaire, ou pronephros. (Colonne de gauche) transcrits codant pour le facteur de transcription PAX2A (teinté en violet) marquent plusieurs populations dans l'embryon, dont le p rénalechamp rogenitor qui se dégage du mésoderme intermédiaire. Transcrits codant pour le ligand de Notch dlc marquent les somites qui se forment à partir du mésoderme paraxial (teinté en rouge). (Colonne de droite) Lorsque l'expression des transcrits de dlc (colorées en violet) et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (teinté en rouge) sont examinées dans les mêmes embryons, expression dlc peut être observé dans un sous-domaine rostrale des progéniteurs rénaux situés à côté de somites 1-5, qui a été occulté pendant la co-coloration de dlc avec PAX2A. C) embryons de type sauvage au stade 14 somites sont double ou triple teinté avec une combinaison d'un marqueur rénale (violet), le marqueur smyhc1 somites (rouge) , et le cerveau postérieur rhombomère marqueur Krox20 (aussi rouge). (Panneau supérieur) A ce stade, les transcriptions de PAX2A continuer à délimiter les progéniteurs rénaux. (Moyen-Orient, les panneaux inférieurs) Sur le territoire de l'ancêtre rénale, un sous-domaine rostrale est marquépar slc4a4 et transcriptions qui codent slc12a3 marquer un sous-domaine caudale.

Figure 5
Figure 5. L'utilisation de préparations montées à plat pour caractériser les phénotypes causés par des mutations génétiques ou de perturbations génétiques chimiques qui modulent la biosynthèse de l'acide rétinoïque. Le motif de souhaits expression au stade 15 somites de wt1a (violet) et smyhc1/krox20 (rouge) ont été comparées entre les types sauvages et les embryons présentant des anomalies dans l'acide rétinoïque (RA) de production en raison de défauts de l'aldéhyde déshydrogénase 1a2 (nls et mutations lib) ou l'inhibition chimique de retinaldehyde déshydrogénase avec diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB). La réduction de la production de RA dans lib est légèrement plus sévère que nls, commeque les embryons lib expriment légèrement réduit la coloration des transcriptions de wt1a de mise en scène de la même nls embryons mutants, tandis que le traitement DEAB de types sauvages est associée à l'abrogation complète de l'expression wt1a.

Discussion

Poisson zèbre se sont révélés être un organisme modèle très précieux pour toute la communauté de la recherche au cours des dernières années. Poisson zèbre présentent un degré élevé de conservation génétique avec celui des vertébrés supérieurs, et les avantages relatifs à leur anatomie, l'élevage et cycle de vie font de cette espèce très prêtent à des analyses de laboratoire. Par ailleurs, la promotion des techniques moléculaires applicables au poisson zèbre a également encouragé l'utilisation de cet organisme modèle dans la recherche scientifique. Par exemple, une grande variété de lignes de poisson zèbre transgénique a été générée pour étudier la progression de la maladie et à répondre à de nombreuses questions fondamentales qui sous-tendent les mécanismes clés du développement, y compris l'organogenèse.

En conséquence, sur la base de l'utilisation dynamique de poisson zèbre à la fois la maladie et de la recherche développement, des méthodes de marquage des cellules et le signal de quantification sont un aspect crucial de l'analyse des données. Bien que les méthodes qui emploient un fluorescenttibodies peuvent être utilisés pour détecter l'expression de protéines dans le poisson-zèbre transgénique, les chercheurs s'appuient généralement sur ​​les procédures standard comme WISH 12-16 à examiner la localisation spatio-temporelle de la transcription de gènes dans un échantillon de poisson zèbre transgénique non-fixe. En fait, WISH est l'une des techniques les plus couramment utilisés en biologie 16, et est un outil essentiel utilisé pour caractériser le phénotype des mutations génétiques et des perturbations génétiques chimiques. Néanmoins, WISH est associé à un certain nombre de pièges et défis potentiels. Pour confirmer la spécificité de la ribroprobe antisens, ribosondes de détection peuvent être utilisés en tant que témoin pour évaluer la spécificité des motifs de coloration de ribosonde antisens. Alors que les articles 4 et 5 sont présentés dans l'ordre de marquage et de détection d'une sonde de digoxygenine marqué suivie par la sonde marquée à la fluorescéine, cet ordre peut être inversé. Typiquement, les signaux plus faibles (gènes dont les niveaux d'expression plus faibles) sont mieux détectés avec des sondes marquées digoxygénine-et cette tachedéveloppée avec un premier substrat pourpre, suivie de la détection et de la coloration du signal plus fort (gène plus abondamment exprimée) en utilisant le substrat rouge. Cependant, si des réactions en deux couleurs vont être effectuées, il est recommandé que diverses combinaisons d'étiquettes et de substrats sont testés pour trouver la procédure qui est le plus adapté pour la collecte et l'analyse des données. En outre, les délais prévus pour le blocage, l'incubation des anticorps et laver prévues aux articles 4-5 sont adaptés pour les embryons de moins de 24 heures après la fécondation; longs intervalles de ces mêmes étapes avec des embryons âgés peuvent conduire à l'accumulation de sel sur l'échantillon. Conseils étendus pour le dépannage embryon de poisson zèbre WISH norme ont déjà été documentées dans la littérature 12-16. Sans doute le problème le plus commun est une grande arrière-plan. Nous recommandons d'augmenter le nombre de lavages MABT à l'étape 4.7 à 15-20 lavages si nécessaire, même si, dans notre expérience la plus de la nuit MABT «super-lavage»donne d'excellents résultats lorsqu'il est utilisé en conjonction avec 10 ou plusieurs lavages de MABT courts avant de procéder à l'étape 4.8. Un autre exemple dilemme est mauvaise infiltration de la sonde, qui peut se produire avec de longues ribosondes. Cisaillement de la ribosonde suivant l'étape 3.6 par hydrolyse alcaline peut contrecarrer cela. Dans notre expérience avec les jeunes des échantillons, la sonde cisaillement n'est généralement pas nécessaire. Cependant, il faut garder à l'esprit que les paramètres de ce genre peut être des facteurs contributifs dans le résultat d'une expérience de WISH, et nous suggérer l'examen de ces instructions de dépannage utiles déjà disponibles publiquement dans la communauté afin d'affiner les paramètres expérimentaux pour la WISH dans votre propre recherche 12.

En plus des techniques traditionnelles WISH 12-16, il ya eu une émergence continue de progrès dans les méthodes de WISH et protocoles alternatifs qui ont été formulées. Il s'agit notamment de nouvelles façons de détection de signal, comme par l'utilisation de fluorescencecence 17-19, les méthodes qui permettent la localisation des microARN 20. Même si, en dépit des nombreuses améliorations qui ont été apportées aux méthodes de marquage des cellules actuelles, l'efficacité de ces procédures sont annulées si la tache (s) ne peut pas être facilement visualisés dans l'échantillon d'intérêt à un point de temps souhaité. Cette limitation est problématique pour les chercheurs en particulier quand il se rapporte à des stades embryonnaires de l'ontogenèse du poisson zèbre, ce qui pourrait entraîner des lacunes dans notre compréhension des différents processus de développement qui se posent à ces moments. Au cours du développement de poisson zèbre normal, le sac jaune diminuera progressivement à mesure que les embryons de 11 ans. Par conséquent, à ces stades de développement ultérieurs (> 24 heures après la fécondation), WISH coloration est assez simple à analyser car l'embryon est plus grande par rapport à sa attenant jaune sac. Cependant, ce n'est pas le cas de la scène queue de bourgeon de somitogenèse tôt (lorsque le embryonnairemasse est positionné autour du jaune) lorsque le sac vitellin opaque peut parfois occulter la visualisation de la tache. Par conséquent, la méthode de montage à plat a été conçu pour aider à alléger les problèmes d'imagerie et d'analyse de données associées à la caractérisation d'échantillons d'embryons de poisson zèbre précoces (schématisés à la Figure 1 et Figure 2), et a été largement utilisé depuis le phénotypage systématique des mutations génétiques isolés des premiers grands écrans génétiques 21.

Depuis l'avènement de la technique de montage à plat, l'analyse des premiers stades de développement a été considérablement renforcée. Une fois que le jaune d'oeuf est retiré de l'embryon, il est possible de fixer la plate embryonnaire sur une lame de verre dans l'orientation souhaitée pour l'imagerie. Cette position bidimensionnelle permet la visualisation de l'ensemble de l'embryon à la fois, ce qui élimine la nécessité de faire tourner l'échantillon. De nombreux tissus sont situées dans de larges domaines de l'embryon, tels queles précurseurs qui forment le sang et les reins. En outre, on peut avoir besoin de comparer plusieurs différents tissus en développement à la fois. Montage à plat permet au chercheur de visualiser simultanément l'ensemble du domaine de ces groupes de cellules, et peut donc grandement aider quantifications telles que des mesures d'aire pour un tissus ou de cellules chiffres. Cette technique a finalement contribué à faire de nombreuses découvertes concernant une variété de mécanismes de développement importants qui sous-tendent l'hématopoïèse, la neurogenèse et l'organogenèse. Ainsi, une fois maîtrisé, les applications de cette technique simple pour les chercheurs sont très importantes.

Par exemple, dans une étude sur le choix de la lignée au cours de l'hématopoïèse, monter plat préparations d'embryons de poisson zèbre à des étapes 14 et 18 somites (ss) ont été utilisés pour illustrer les changements survenus dans le profil d'expression de la PU.1 zinc facteur doigt de transcription entre de type sauvage et GATA1 morpholino injecté embryons 22.Cette méthode a permis la détection d'un domaine de PU.1 élargi à 18 ss, indiquant que GATA1 est probablement régulation de l'expression de PU.1 dans la masse cellulaire intermédiaire (ICM) autour de ce point de temps. Embryons plat supplémentaires montés colorées pour différents gènes érythroïdes y compris gtpbp1 et Epsin démontré une perte de l'expression de ces gènes mutants vlt qui étaient GATA1 - / -. D'autres analyses ont montré aucun changement dans l'expression de gènes tels que erythoid biklf testhymin et qui étaient connus pour être indépendante de l'activité de gata. Par conséquent, conjointement avec leurs autres résultats expérimentaux, il a été révélé que GATA1 est essentiel dans la régulation de la différenciation des cellules au sein de la lignée de myélo-érythroïdes. Dans une étude du développement de la crête neurale, supports plats ont été utilisés pour examiner l'expression de Crestin à Mont Blanc (mob) M610 mutants dans une étudel'examen des rôles du Mont-Blanc et de la fonction du gène TFAP2A 23. À 10 et 20 ss, l'expression de Crestin a été entièrement abrogé dans la tête et a diminué dans la région de tronc de mutants M610 mob par rapport à l'expression normale de type sauvage, en fin de compte aider ce groupe à conclure sur l'importance du Mont-Blanc et TFAP2A règlement pendant la formation de la crête neurale. En outre, en termes de l'organogenèse, montures plates ont permis la découverte de la présence de domaines distincts dans le champ de progéniteur rénale précoce au cours du développement du rein embryonnaire du poisson zèbre, connu sous le nom pronephros. L'embryon de poisson zèbre fournit un système conservé et encore anatomiquement simple pour étudier comment les progéniteurs rénaux donnent lieu à des unités fonctionnelles de néphrons qui composent les pronephros, un processus connu sous le nom néphrogenèse 6,7 (figure 4). Appartement monter analyse a été utile pour documenter les domaines de la reprogéniteurs internes et à disséquer le résultat de changements dans la signalisation de RA pendant pronephros structuration 6,7 (figure 5), qui était auparavant inconnu. Pris ensemble, ces exemples montrent qu'il existe effectivement de nombreuses applications générales pour cet appartement protocole de montage dans l'étude des divers processus qui se produisent au cours du développement normal et états pathologiques.

Conceptuellement, cette procédure de montage plat est assez simple dans son ensemble. Cependant, les manipulations et le degré de finesse requis pour maîtriser cette méthode peut être assez difficile à maîtriser en l'absence de démonstration visuelle. Par conséquent, ce protocole a été établi pour permettre aux chercheurs, en particulier ceux qui découvrent le modèle de poisson zèbre, la possibilité de mieux comprendre comment effectuer cette technique et partagez nos conseils sur les réactifs qui permettent d'optimiser le traitement des tissus. Nous espérons que ce protocole permettra à terme d'autres dans la communauté pour affiner les conditions d'échantillonnage les plus idéal pour être used pour l'imagerie haut de gamme, l'analyse des données et la communication de leurs résultats dans les publications. En fin de compte, ce qui devrait permettre aux chercheurs de surmonter les obstacles anatomiques du poisson zèbre au cours de l'embryogenèse précoce, qui peut obscurcir la présentation des résultats expérimentaux, et les résoudre grâce à l'utilisation de cette technique simple mais importante.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été financé en partie par le financement de RAW de chacun des éléments suivants: subventions des NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar octroi d'une subvention # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l'Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques. Nous tenons tout particulièrement à remercier Elizabeth et Michael Gallagher, avec toute la famille Gallagher, qui donnait un don généreux à l'Université de Notre Dame de favoriser recherche de cellule souche. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Enfin, nous remercions les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et idées à propos de ce travail,ainsi que Marigold (Maripooka) et Zinnia Wingert pour fournir hangar naturellement moustaches félines à faire plus d'excellents outils de cils pour notre recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

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References

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Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

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