Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Квартира Гора Подготовка к наблюдению и анализу эмбрионов рыбок данио образцами запятнана вся гора Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Данио эмбрион является отличным примером для биологии развития исследований. Во время эмбриогенеза, данио развивать с желтком массы, которая представляет трехмерные проблемы для наблюдения и анализа проб. Этот протокол описывает, как создать двумерные плоские монтирования препараты всей горе на месте (WISH) окрашенные данио образцов эмбрионов.

Abstract

Данио эмбрион настоящее время широко используется для основного и медико-биологических исследований, чтобы исследовать генетического контроля процессов развития и моделировать врожденные аномалии. В течение первого дня жизни, данио эмбриона проходит через множество этапов развития, включая внесение удобрений, расщепление, гаструляции, сегментации, и органогенеза структур, таких как почки, сердце и центральную нервную систему. Анатомия молодой эмбрионов рыбок данио представляет несколько проблем для визуализации и анализа тканей, участвующих во многих из этих событий, потому что эмбрион развивается в связи с круглой массы желтка. Таким образом, для точного анализа и визуализации экспериментальных фенотипов в основной эмбриональных образцов между хвостовой почки и 20 сомитов (10 и 19 часа после оплодотворения (HPF), соответственно), такие как те, окрашивали с использованием установки в целом в гибридизация (по желанию), он Часто желательно удалить эмбрион от желтка бвсе и позиционировать его плашмя на предметное стекло. Однако, выполняя плоскую процедуру монтирования может быть утомительным. Таким образом, успешным и эффективным плоским смонтировать препарат значительной степени способствовать путем наглядной демонстрации техники рассечение, а также помогли с помощью реагентов, которые помогают в оптимальной обработки ткани. Здесь мы предоставляем наш протокол WISH для обнаружения одного или двух цветов экспрессии генов в данио эмбриона, и продемонстрировать, как в квартиру процедура монтажа может быть выполнена на этом примере, окрашенных неподвижного образца. Эта квартира протокол монтаж широко применима к изучению многих эмбриональных структур, которые возникают в период раннего данио развития, и могут быть реализованы в сочетании с другими методами окрашивания, выполненных на образцах фиксированных эмбрионов.

Introduction

Данио, Данио рерио, стала широко использоваться организмом в изучении биологии развития. Данио рерио являются тропические, виды пресноводных позвоночных, принадлежащих к семейству карповых. Данио рерио были первоначально использовались для экологических исследований, чтобы получить информацию об опасности потенциальных загрязнителей воды, так как они были легко доступны, недороги, и просты в обслуживании 1. За последние тридцать лет, данио стал признан как генетически послушный позвоночных модельной системы для хозяина причин. Данио рерио показывают высокий уровень анатомической и физиологической сохранения с высших позвоночных, включая млекопитающих 2,3. Последние аннотации последовательность генома показал, что около 70% генов человека есть хотя бы один данио коллегу 4. Например, многие ортологичных гены, которые играют важную роль во время развития почек были определены между этими видами 5-7. Это драхор степень сохранности в отношении клеточной и молекулярной биологии позволило исследователям создавать модели для широкого круга заболеваний человека в данио 8, и рыбок данио стали ценным инструментом для выявления потенциальных лекарственной терапии с использованием химических генетические экраны 9.

Кроме того, модель данио не только в состоянии повторять разнообразные сложные процессы развития и болезненных состояний, которые замечены у людей, но несколько дополнительных атрибутов также повысить свою привлекательность в качестве модельного организма для эмбриологических исследований. Данио рерио яйцекладущие и воспроизводить через вещания нереста, который обеспечивает исследователей с легким доступом к эмбрионов от начала оплодотворения 10. Другие преимущества включают в себя размер эмбриона, прозрачность и быстрый, внешний развитие 10. Кроме того, данио взрослых обладают высокой плодовитостью и обычно производят относительно большие сцепления размеры, которые могут варьироваться между 200-500в неделю, в конечном счете, позволяет исследователям выполнять высокие эксперименты пропускную способность, такие как фенотипа основе химических экранов, с легкостью 9.

Тем не менее, несмотря на множество преимуществ, которые выставлены на данио модели, существуют проблемы, которые относятся к анализу и коммуникации экспериментальных результатов, полученных из ранних стадий развития. В некоторых случаях, присущие анатомия данио эмбриона может заслонить визуализацию своих данных. После оплодотворения, начальная клетка подвергается несколько событий расщепления по ходу развития 11. После гаструляции, эмбриональная ось возникает на стадии хвостовой почки (10 HPF) так, чтобы он, обернутой вокруг желтка 11. По мере прогрессирования последующее развитие через сегментации период, ствол будет расти в массы, а также удлинить осевым удлинением таким образом, что хвост вместе с частью желтка мешок себе простираются от центральной массы желтка11. Между хвостовой почки и 20 сомитов стадии (19 HPF), попытки наблюдать специфические особенности развития после использования различных протоколов окрашивания, такие как желание, может быть сложным и визуализировать и сфотографировать из-за геометрии эмбриона и непрозрачности желточный мешок. Один из способов устранить эти проблемы заключается в удалении желток, а затем сгладить эмбрион в двумерной образца, который может быть проанализирован в более простым способом.

Следующие ресурсы протоколов и видео обеспечивают руководство о том, как успешно deyolk и помещения смонтировать эмбрион следующее фиксации и окрашивания, на примере одного или окрашивания WISH двухцветной. WISH является широко используемым методом, который позволяет обнаруживать конкретных нуклеиновых кислот в консервированных образцов и таким образом позволяет сайт (ы) экспрессии генов, которые будут обнаружены в ткани. Методы WISH широко описаны и могут быть выполнены с различными цветовыми подложек, а также гриппorescent системы обнаружения 12-20. Здесь мы предлагаем наш модифицированный протокол WISH, используемый для эмбрионов данио между хвостовой почки и сегментации стадиях развития. Альтернативные протоколы WISH, однако, совместимы с плоской процедуры монтирования описанной здесь, как отмечалось в начале следующей протокола. Кроме того, плоская монтажная могут быть использованы в сочетании с любым количеством существующих методов визуализации, таких как всей горе иммуногистохимии или клеточной линии отслеживания меток, которые не описаны в данном протоколе. В целом, методика плоской монтажа может лучше включить превосходную анализ и представление данных, полученных в результате экспериментов с самых ранних этапов эмбрионального развития в рыбок данио.

Protocol

Процедуры для работы с эмбрионов рыбок данио, описанных в этом протоколе были утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете Нотр-Дам на. Примечание: Процедуры, описанные в частях 1-5 были использованы для формирования изображения эмбриона, предусмотренные здесь в представительных результатов. Процедуры, описанные в частях 1-5 можно заменить по желанию с альтернативных процедур WISH 12-16 или других методов визуализации, таких как иммуногистохимического маркировки для специфических белков с использованием специфических антител. При выполнении плоские крепления на эмбрионах рыбок данио WISH с протоколом, описанным в частях 1-5, начальной фиксации эмбриона и заключительных шагов окрашивание фиксации являются основными манипуляции, которые влияют на способность удалять желток гранулы из образца для плоского монтажа. Наилучшие результаты плоским крепления получают, когда первоначальный фиксация осуществляется с недавно талой ледяной 4% параформальдегида (PFA) / 1X PBS и фиксацииКонечную реакционную окрашивание WISH с ледяным 4% PFA/1x PBS (который не должны быть свеже разморозить), и он сообщил, что читатели учитывать это при подставляя альтернативные методы окрашивания в сочетании с частями 6-8.

1. Эмбрионов, фиксация и хранение

  1. Подготовка спаривания клетки путем размещения взрослых данио самца (ы) и самку (ы) в камерах системы водой так, чтобы они разделены разделителем в течение ночи.
  2. Удалить разделители между взрослыми и собирать оплодотворенные яйца с помощью тонкой проволочной сетки ситечко в ~ 15-30 мин спаривания, чтобы собрать муфты, имеющих эквивалентные эмбриональных стадий.
  3. Поверните фильтр с ног на голову и промыть поверхность с тонкой струей E3 освобожден от пульверизатор для передачи эмбрионов в инкубационных блюд, содержащих около 25 мл раствора E3.
  4. После сбора муфты, разделить их на несколько блюд, таких, что примерно 50-60 эмбрионы инкубировалив каждую чашку 25 мл раствора Е3. Примечание: Перенаселенность эмбрионов может привести к резкому асинхронности развития в сцепление и следует позаботиться, чтобы избежать этого, для своевременного сбора нужной стадии (ы).
  5. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° С для проведения оценки с развитием в соответствии с данио стандартной промежуточной серии 11.
  6. С помощью пластиковой пипетки передачи, чтобы аккуратно разместить нужное количество эмбрионов в выбранной временной точки, до стадии 20 сомитов (19 HPF), в плоскую нижнюю микроцентрифужных трубки. Примечание: Будьте внимательны при обращении с молодыми эмбрионов, так как они являются хрупкими и могут быть легко повреждены путем дробления или агрессивное обращение с передачи пипеток. Кроме того, стеклянные пробирки можно использовать для фиксации и обработки эмбрионов. Для всех последующих промывок протокола пластиковые пипетки передачи могут быть использованы, за исключением рибозонд добавления и удаления (этапы 3,11, 3,14).
  7. Замените E3 с ледяным 4% PFA/1x PBS, иисправить эмбрионов в их хорионов в 4% PFA/1x PBS в течение 4 часов при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи. Примечание: будьте внимательны: PFA является токсичным и решения PFA должны быть обработаны на химическом капотом, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки и халате. Кроме того, PFA порошок следует обращаться с исключительной заботой при создании исходного раствора, так как даже гранулированный PFA может, как правило, расходятся через статического заряда. Обычно PFA получают путем нагревания 1X PBS до кипения, чтобы растворить порошок PFA, и затем раствор хранили в аликвотах при -20 ° С. Если мелкие отложения присутствуют в 4% PFA/1x PBS один раз раствор охлаждают, фильтруют стерилизовать охлажденного раствора до аликвоты для хранения вымораживанием путем пропускания его через систему фильтров 0,45 мкм. Только свежеприготовленный или только разморозить PFA используется для этого начального (т.е. первичной) фиксации эмбриона.
  8. Удалить исправление и мыть эмбрионов дважды 1x PBST, а затем перенести вИнкубационный блюдо.
  9. Просмотр эмбрионов под стереомикроскопом и использовать две пары тонких щипцов для удаления хорионов окружающие эмбрионов, например, что одна пара используется, чтобы мягко использовать эмбрион в то время как вторая пара используется для разорвать хориона.

2. Эмбрион Permeablization

  1. Перенесите dechorionated эмбрионов обратно в пузырек микроцентрифужных трубки или стеклянной, затем смойте дважды 1x PBST для удаления остатков хориона мусора.
  2. Снимите 1x PBST и мыть эмбрионов дважды 100% метанола (метанол).
  3. Поместите эмбрионов при -20 ° С в течение по крайней мере 20 мин. Примечание: Эмбрионы можно хранить при -20 ° C в МеОН в течение одного года или больше. Метанол делает хорионов липкими, поэтому не перейти к этому шагу, если только хорионов не были удалены.
  4. Увлажняет эмбрионов путем удаления 100% МеОН и мыть их при комнатной температуре в течение 5 мин каждый в 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, а затем дважды 1x PBST. </ Li>
  5. Приготовьте свежий протеиназы К рабочий раствор (5 мкг / мл), добавляя 25 мкл свежей талой протеиназой К складе (10 мг / мл) в 50 мл 1х PBST.
  6. Снимите 1x PBST из эмбрионов, а затем заменить с протеиназы K рабочего раствора и инкубировать на основе эмбриональной стадии: <= 5 сомиты в течение 1 мин; 10-12 сомитов в течение 1,5 мин; 15 сомиты в течение 2 мин и 20 сомитах в течение 3 мин.
  7. Снимите протеиназы K рабочего раствора и мыть эмбрионов дважды 1x PBST.
  8. Извлеките 1x PBST и заменить ледяной 4% PFA/1x PBS в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре.

3. Riboprobe Синтез, Предгибридизацию, Гибридизация, и удаление зонда

  1. Сборка антисмысловой рибозонд в пробирке реакции транскрипции при комнатной температуре в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, сохраняя при этом ферменты на льду, путем объединения матричной ДНК последовательность, содержащую соответствующий интерес гена (либо 100-200 нг ПЦРпродукт или 1,5 мкг линеаризованной плазмидной ДНК получали, как описано 12,13), 2 мкл дигоксигенином или флуоресцеина меченых рибонуклеотидов, 2 мкл соответствующего РНК-полимеразы (SP6, Т3, Т7 в зависимости от того, какой последовательности включено в ПЦР-продукта или присутствует на ДНК-плазмиды), 2 мкл 10х транскрипции буфера, 0,5 мкл ингибитора РНКазы, и довести до общего объема 20 мкл с молекулярной класса дистиллированной воды (аз, РНКазы). Примечание: 10х буфера транскрипции должны быть предварительно нагретого, поместив трубку в водяной бане 37 ° С в течение 10-20 мин, и после этого перемешивали чтобы гарантировать, что все компоненты в растворе. Если белые хлопья присутствуют, инкубировать пробирку для другого 5-10 мин и вихря снова. Транскрипция реакции может не иметь или плохой выход, если буфер транскрипции не полностью растворяется и тщательно перемешивают.
  2. Смешать компоненты и инкубировать каждый реакцию при 37 ° С в течение 2 ч в водяной бане.
  3. Снимите реакцию ТУбыть (ы) из водяной бани, и разрушают ДНК-матрицы при каждом образце путем добавления 5 мкл 10х ДНКазы I-буфера, 2 мкл ДНКазы I фермента и 23 мкл молекулярный класса дистиллированной воды, чтобы довести общий объем до 50 мкл, и затем каждую пробирку инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин на водяной бане.
  4. Выполнение осаждения этанолом в каждой трубки микроцентрифужных добавлением 5 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2 и 110 мкл охлажденного льдом 100%-ного этанола, а затем 1 мкл гликогена наличии для облегчения осадок РНК визуализацию на последующих этапах, после чего инкубировать Трубка при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
  5. Центрифуга друг микроцентрифужных трубки на максимальной скорости 4 ° C в течение 20 мин, затем снимите 100% этанола супернатант и заменить 100 мкл 70% ледяного этанола.
  6. Центрифуга друг трубки микроцентрифужных при 4 ° С в течение 5 мин, затем снимите 70% этанола супернатант и воздух сухой осадок в течение 5 мин, затем, наконец, добавить 100 мкл месмолекулярного класса дистиллированную воду, чтобы ресуспендируют осадок и количественной оценки рибозонд фондовый концентрацию использованием NanoDrop спектрофотометр. Примечание: После того, как осадок пошла в раствор, рибозонд складе должны храниться на льду и хранили при -20 ° С.
  7. Для подготовки фиксированные эмбрионов для процесса предгибридизационном, снимите 4% PFA/1x PBS из каждого образца и мыть эмбрионов дважды 1x PBST.
  8. Трансфер между 25-40 эмбрионов в 1x PBST в каждом отдельном плоским дном трубки микроцентрифужных. Примечание: Перенаселенность эмбрионов приведет к неравномерному окрашиванию позже, и следует позаботиться, чтобы ограничить размер выборки в каждой пробирке примерно 40 эмбрионов.
  9. Замените 1x PBST в каждой пробирке с 500-1000 мкл HYB +.
  10. Поместите пробирку (ы) эмбрионов в сушильном шкафу при температуре 70 ° C, и инкубируют их при этой температуре в течение 4 часов, чтобы выполнить Предварительную гибридизацию.
  11. Подготовьте рибозонд / HYB + решение, добавив 100-500 нг рибозонд (дигоксигенином и / или fluorescEin-меченых) в 500 мкл свежей HYB + и затем этот раствор инкубируют при 70 ° С в течение по меньшей мере 20 мин перед стадией 3,11 до prewarm его. Примечание: Для обнаружения нескольких стенограммы генов, с помощью одного и / или двойной колориметрического маркировку, каждый из рибонуклеотидных соответствующих этих генов нужно быть объединены в один рибозонд / HYB + коктейль.
  12. Снимите Предгибридизацию HYB + из каждой пробирки эмбрионов и заменить с достаточной рибозонд / HYB + для покрытия эмбрионов. Примечание: Как правило, 200-250 мкл рибозонд / HYB + необходимо покрыть эмбрионов в одной плоской нижней трубки микроцентрифужных. Riboprobe / HYB + добавление и удаление обычно выполняется с помощью пипетки и барьерные советы для предотвращения перекрестного загрязнения между образцами.
  13. Инкубируйте эмбрионов при 70 ° С в течение ночи с ribroprobe / HYB +.
  14. Подготовьте следующий набор моющих растворов и предварительно нагреть их в течение ночи при 70 ° С: 50% formamide/2x ЦФСС, 2x ЦФСС и 0.2x SSCT. Примечание: Это удобно готовить 50 мл альiquots каждого промывочного раствора, так как избыток можно хранить при комнатной температуре, а затем повторно нагревают для будущего использования.
  15. Снимите рибозонд / HYB + с помощью пипетки и барьерные советы и магазин при -20 ° С Примечание: Обычно каждый рибозонд / HYB + смесь может быть использована несколько раз (например, 3 или более) без уменьшения сигнала. В то время как повторно рибозонд / HYB + связано с более низким фоне, однако, иметь в виду, что повторно рибозонд смеси могут быть подвержены деградации.
  16. Вымойте эмбрионов дважды с 50% formamide/2x ЦФСС в течение 30 мин при 70 ° С
  17. Вымойте эмбрионов один раз с 2x ЦФСС в течение 15 мин при 70 ° С
  18. Вымойте эмбрионов дважды 0,2 x ЦФСС в течение 30 мин при 70 ° С
  19. Снимите 0.2x SSCT и мыть эмбрионов дважды MABT при комнатной температуре.

4. Анти-дигоксигенином антител Инкубационный и обнаружения

  1. Подготовьте свежий блок решение.
  2. Снимите MABT и заменить блок решеТион.
  3. Выдержите эмбрионов в блок решения для 2-4 часов при комнатной температуре. Примечание: Более длинные блок инкубации обеспечить оптимальные результаты с молодыми эмбрионов данио стадиях (<15 сомитах). Для длительной процедуры блок, блок выполнения инкубацию в течение 8-12 часов при комнатной температуре или комбинации комнатной температуре плюс (до ~ 8 часов) последующее 4 ° C инкубации в течение ночи.
  4. Приготовьте раствор анти-дигоксигенином антитела, сделав 5000-кратное разбавление в свежий раствор блока (например, 1 мкл на 5 мл блока).
  5. Снимите блок и добавить антитела / блок решение.
  6. Крышка образца в фольгу и инкубируют в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 часов при комнатной температуре.
  7. Снимите anti-digoxygenin/block и мыть эмбрионов не менее 10 раз с MABT. Примечание: Трансфер эмбрионов к блюдам 12-а для MABT стирок. Это увеличивает скорость, с которой эмбрионы можно стирать, что очень удобно при работе с большими пробные партии,й облегчает контроль за ходом реакции окрашивания (Шаг 4,11) под стереомикроскопа. Примечание: На данном этапе эмбрионов может быть "супер-промывали 'путем инкубации их на ночь в MABT при 4 ° С, прежде чем приступить к этапу 4.8, который является полезным для лечения зондов, которые, как правило, дают высокий фон или пятен, которые требуют длительного мониторинга во время работать день.
  8. Подготовить буфер предварительного окрашивания и искомое решение окрашивания (фиолетовый или красный субстрата).
  9. Извлеките MABT и мыть эмбрионов в предварительно окрашивающего буфера в течение 5 мин при комнатной температуре.
  10. Снимите буфер предварительного окрашивания и добавьте красящего раствора.
  11. Контроль за ходом температуры комнатной реакции окрашивания каждый 15-30 мин, проверяя появление эмбрионов под стереомикроскопа. Примечание: скорость реакции окрашивания может быть замедлен путем передачи образцов до 4 ° С, если это необходимо, чтобы дать больше времени для завершения пятно. Как только охлажденное до 4° C, однако, реакци не может быть ускорен путем нагревания до комнатной температуры.
  12. Когда реакция окрашивания будет завершена, удалите красящего раствора и заменить 1x PBST.
  13. Промыть дважды 1x PBST в течение 5 мин. Примечание: Если не обнаружения других генов с другой подложки, затем исправить образцы в ледяной 4% PFA/1x PBS в течение не менее 20 мин, и перейдите к шагу 6.1. В противном случае перейдите к шагу 5.1.

5. Антифлуоресцеин антител Инкубационный и обнаружения

  1. Извлеките 1x PBST и мыть эмбрионов дважды 0,1 М глицина, рН 2,2 в течение 15 мин каждый при комнатной температуре. Примечание: Время для глицина моет необходимо полностью отключить первую реакцию окрашивания.
  2. Извлеките 0,1 М глицин и мыть эмбрионов дважды MABT в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Приготовьте раствор антифлуоресцеин антитела, сделав 5000-кратное разбавление в свежий раствор блока (например, 1 мкл на 5 мл блока).
  4. Снимите MABT и добавьте антитела / блок решение. Выполните шаги 4.6-4.13 выполнять обнаружение меченого флуоресцеином ribroprobe. Примечание: Когда Конечную реакционную окрашивание завершен, важно, чтобы последний фиксация образца осуществляется в ледяной 4% PFA/1X PBS. Фиксация с более теплыми решений PFA как правило, связаны с липким желтка, который трудно удалить из эмбриона во время вскрытия и deyolking для плоской процедуры монтирования.

6. Эмбрион Вскрытие и Начальный Deyolking эмбриона

  1. Выберите фиксированный, витражи зародыш для плоской монтажа.
  2. Используйте передачи пипетки поместить выбранный семпл эмбриона в пластиковый или стеклянную чашку Петри, содержащей 1x PBST.
  3. Место блюдо под стереомикроскопом,-н-ролл эмбрион, используя пару тонких щипцов или ресниц инструмент так, чтобы вид сбоку получается и концы головная и хвостовая визуализируются.
  4. Используйте одну пару тонких щипцов, чтобы сделать разрез в гое желток в положении, расположенном в центре между головкой и хвостовой части эмбриона, а тем временем использовать вторую пару тонких щипцов для хранения эмбрион так, чтобы обеспечить рычаги для желтка разрез. Примечание: В качестве альтернативы, сделать два основных разрезов в желтке, один близко к голове, а другой рядом с хвостом эмбриона.
  5. Используйте тонкий пинцет и / или плеткой инструмент, чтобы выкопать желток из полости желток клеток.
  6. Промойте эмбрион осторожно 1x PBST для удаления постороннего желток.

7. Изысканные Deyolking эмбриона

  1. Передача эмбриона с плоским стекло с 1-2 каплями 1x PBST.
  2. Используйте ресниц инструмент и тонкий пинцет, чтобы аккуратно разместить эмбрион с брюшной (желток) стороной вверх на стекле.
  3. Drag эмбриона к краю раствора 1x PBST с помощью инструмента ресниц так, что эмбрион остается в плоском положении по отношению к стеклу.
  4. Очистите вентральной поверхности эмбриона мягко, используя плеть, чтобыол, чтобы удалить гранул желтка без копирования эмбриона. Одновременно использовать пару тонких щипцов для закрепления эмбриона в то время как выскабливание с инструментом ресниц. Примечание: Удаление гранул желтка может потребовать повторных соскоб в течение 5-10 мин.
  5. Если PBST решение становится суматоху с избытком желтка или начинает испаряться, добавить 1-2 свежих капель 1x PBST к слайду, используя пластик или стекло пипетки передачи, а затем перетащите эмбрион в область с чистым раствором для дальнейшего желтка гранулы удаление.
  6. Когда желток была удовлетворительно удалить с помощью передачи пипетки осторожно перемещения эмбриона обратно в пластиковый или стеклянную чашку Петри, содержащую 1x PBST для окончательной промывки, чтобы удалить паразитные гранул желтка.
  7. Перенести deyolked эмбриона с помощью пластиковой или стеклянной пипетки передачи в пластиковый или стеклянную чашку Петри, содержащей 100% глицерина.
  8. Выдержите эмбрион в 100% глицерина для ~ 5 мин, чтобы акклиматизироваться эмбрион.

8. Монтаж на предметное стекло

  1. Перенести deyolked эмбриона чистое предметное стекло в 1-2 капли на 100% глицерина.
  2. Расположите эмбрион с брюшной (желток) стороной предметное стекло.
  3. С помощью инструмента ресниц, перетащить эмбриона к краю капли глицерина так, что эмбрион остается в плоском положении по отношению к стеклу. Если эмбриональные оси изогнут, используйте мелкие щипцы, чтобы мягко сделать очень маленькие разрезы в оставшейся мембраны желтка клеток для снятия напряжения, так, что эмбрион может располагаться плоско на слайде с прямой оси.
  4. Поместите небольшие дерн из пластилина на четырех углах 18 х 18 мм покровным стеклом. Примечание: В качестве альтернативы, маленькие капли вакуумной смазки 15 может быть заменен на глиной.
  5. Поместите покровное стекло медленно по эмбриона, ужение покровное, чтобы минимизировать образование пузырьков воздуха в глицерине вокруг образца.
  6. Добавление дополнительного каплю 100% глицеринана стороне покровным стеклом, чтобы заполнить пространство между покровным и стекло.
  7. Надавите медленно и осторожно на четырех углах покровного стекла твердо позиционировать эмбрион между стеклом и устранить дрейфующих. Примечание: Будьте осторожны, чтобы не раздавить эмбрион.
  8. Если эмбрион не позиционируется как хотелось бы, использовать тонкий пинцет, чтобы удалить покровное. Используйте инструмент ресниц, чтобы изменить положение эмбриона и / или тонкий пинцет, чтобы сделать дополнительные разрезы так, что эмбрион может быть повторно. Повторите шаги 8.4-8.7.
  9. Наблюдать и / или изображение образца, используя либо стерео-или сложный микроскоп.
  10. Храните квартиры смонтировать подготовку квартира с картонной держателя слайдов в темноте при 4 ° С в течение нескольких недель или временно при комнатной температуре. Примечание: ЖЕЛАНИЕ пятно исчезнет с течением времени постепенно, особенно красные реакции субстрата, и не может быть сохранена в глицерине на неопределенный срок. Фиолетовый пятна также исчезают с большей готовностью, если хранится в глицерине сравнению сPFA (см. Шаг 8,11). Интересно, что она была опубликована, что монтажные эмбрионы в предметный столик Permount вместо глицерина можно включить неопределенный хранения при комнатной температуре 15.
  11. Для длительного хранения фиолетовый подложки окрашенных образцов, снимите стеклянную покровное и промыть эмбрион промывают дважды в 1x PBST, затем трансфер в микроцентрифужных трубки с 4% PFA/1x PBS для долговременного хранения. Примечание: В качестве альтернативы, эмбрионы в 1X PBST могут быть обработаны для дополнительных анализов, таких как выделения ДНК для генотипирования.

Representative Results

Процедура протокол плоским монтажа включает в себя преобразование данио эмбриона от его нормальной анатомии, в которой ось тела, обернутой вокруг расположенного в центре шара желтка, в двумерном препарат (фиг.1А). Всего крепление изображений молодого данио эмбриона ограничен природой как эмбриональная ось обернута вокруг желтка. В результате боковые или спинной вид весь крепление окрашенные образцы эмбрион может захватить только часть оси или скрывать частности тканей (рис. 1В). Для сравнения, deyolking и уплощение эмбриона позволяет весь эмбриональных ось для визуализации в одно время (рис. 1В). Эти ограничения продемонстрировали, исследуя желание окрашенных эмбрион, который метили антисмысловых рибонуклеотидных обнаружить irx3b (фиолетовый), который знаменует подмножество почечных клеток-предшественников, расположенных рядом с сомитах 7 по 13 и MyoD1 (красный), который помечаетсомиты (рис. 1b). Поле irx3b + почечных клеток-предшественников скрыта в целом крепление боковой вид, потому что irx3b транскрипты в изобилии в центральной нервной системе, в результате чего почечной поле практически невозможно визуализировать с боковой ракурса; Кроме того, поле irx3b + почечных клеток-предшественников лишь частично видны, когда эмбрион вращается в поле зрения камеры спинного, так как поле обернута вокруг желтка (рис. 1В). Тем не менее, вид спинной того же эмбриона следующие плоской монтажа позволяет все поле irx3b + почечных клеток-предшественников, которые будут проанализированы в простой моды по отношению к сомитах вдоль туловища и других эмбриональных структур (рис. 1б). Таким образом, сложные пространственные домены могут быть идеально документально с этим методом.

Несколько крупных шаги, используемые при успешного выполнения плоской процедуры монтирования. Для выполнения этой techniquе, желток шар должен быть сначала отделены от собственно эмбриона (рис. 2а), что может быть сделано с мелкими инструментами, такими как пары тонких щипцов в то время как эмбрион визуализировали с использованием стереомикроскопа. После сырой удаления желтка мяч, прекрасный инструмент ресниц используется для соскрести желток гранулы, которые остались прикреплены к эмбриона (рис. 2В). Удаление оставшихся гранул желтка помогает облегчить визуализацию эмбриональных тканей. Наконец, deyolked эмбрион манипулировать, чтобы расположить его стабильно на предметное стекло (рис. 2С), что позволяет наблюдения и СПИД документации образца с использованием программного обеспечения визуализации и камеры, подключенной к микроскопу. Ресниц инструменты самодельные устройства, которые могут быть построены путем проставления соответствующего плеть для кончика пипетки с помощью суперклея, которые могут быть установлены на рукоятке при желании (рис. 3А, материалы таблицы). Различные образцы ресниц могут быть приобретены для производстванаброситься инструменты со слегка различными характеристиками с точки зрения длины и конусности (рис. 3В), который каждый пользователь может иметь разные пристрастия для как только они начинают экспериментировать с плоской процедуры монтирования. Примеры ресниц образцов включают естественно пролить человека ресницы, естественно пролить животных жилистый волосы или усы, и, наконец, синтетических сортов коммерчески доступных ресниц найти в розничных косметических отделах.

Локальная окружающих и содержащий образец (ы), расположенную на предметное стекло (фиг.4А) могут быть отображены на анализ с высоким разрешением. Сочетание зондов были использованы для маркировать развития почечной предшественников, которые приводят к почке в дикого типа эмбриона на ранних стадиях развития с двухцветной WISH, а затем плоским смонтировать препараты были выполнены для просмотра образцов (рис. 4B, 4C ). В начале сомитных стадиях, почечные клетки-предшественники разграничены в П-образной картины по гоEIR выражение pax2a транскриптов (фиолетовый), окружающих параксиальной мезодермы, что одновременно выражает дельта C (DLC) (красный) (левая колонка, 4В) 6,7. Для сравнения, когда DLC стенограммы были обнаружены с фиолетовым подложки, и были названы в сочетании с заднего мозга маркера Krox20 (красный), ростральной подобласть почечных предшественников визуализировали, что выражает DLC (правый столбец, Рисунок 4B), как отмечалось ранее 6,7. Плоские крепление препараты могут быть использованы аналогичным образом изучить поздние стадии сомитогенеза. В сомитов 14, мы проанализировали экспрессию почечных маркеров pax2a, slc4a4 и slc12a3 (фиолетовый) вместе с smyhc1 (красный), который знаменует сомиты (рис. 4C). Эти комбинации разрешить отображение всей почечной области предшественников с pax2a, раскрывая, что подмножество клеток в ростральной субдомена выражEssed slc4a4a и отличались неперекрывающийся хвостового поддомен почечных клеток-предшественников, которые выразили slc12a3.

Двухцветный WISH и квартира смонтировать подготовка также являются ценными для изучения клеточных доменов во органогенеза у рыбок данио с генетическими мутациями или других возмущений от воздействия окружающей среды на малых молекул 6,7 (рис. 5). Данио NLS и либерал-мутанты гавань мутации в альдегиддегидрогеназы 1a2 (Aldh1a2, ранее известный как Raldh2), который кодирует фермент, необходимый для биосинтеза ретиноевой кислоты (RA). РА имеет важное значение для правильного развития многих почечных типов клеток, включая формирование подоцитов клеток, которые способствуют сделать фильтр крови эмбриональной почки, известный как клубочек 6,7. ЖЕЛАНИЕ проводили для обозначения подоцитов предшественники с wt1a одновременно с демаркации тон развивается сомиты с smyhc1 и заднего мозга с Krox20 у эмбрионов дикого типа, NLS мутантные эмбрионы, Lib мутантных эмбрионов и эмбрионов, обработанных с ALDH фермент химического ингибитора, DEAB (рис. 5). Эмбрионы с дефицитом выражения Aldh1a2 показали пониженную экспрессию wt1a сравнению с эмбрионами дикого типа, в то время как DEAB обработанные эмбрионы показали отмену wt1a транскриптов (рис. 5, правая колонка). Взятые вместе, эти представительные результаты демонстрируют, как плоская техника крепление может быть использован для анализа и документирования анатомические различия с точностью в ранних эмбрионов, и, таким образом быть реализованы за ценные исследованиях развития.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор плоской монтажа подгоРацион для эмбрионов рыбок данио. A) Процедура плоской монтажа позволяет одновременно вид ткани вдоль эмбриональной оси потому что масса центральной желток удаляется и эмбрион стабильно расположены на плоской поверхности. B) Изображения целого крепления WISH окрашенных эмбриона в боковых и спинной видом, а затем после того, как квартира подготовка крепление было проведено. Эмбрион окрашивали десенсибилизированных проб для выявления генных транскриптов, кодирующих irx3b (фиолетовый) и MyoD1 (красный).

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема плоской процедуры монтирования для эмбрионов рыбок данио. А) Эмбрион сначала грубо deyolked удалить большую часть массы желтка, затем (В) с вентральной мелко deyolked удалить оставшиеся гранулы желтка, ипосле мытья эмбрион является (С) установлен спинной стороной вверх на предметное стекло для визуального анализа и / или фотографического изображения.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фотографии например ресниц инструментов по сравнению с тонким пинцетом. ) Домашнее инструменты ресниц были обследованы вместе стандартной пинцета, расположена рядом с метрической линейки, чтобы обеспечить ссылки. B) увеличенный вид ресниц инструментов рядом с тонким пинцетом, со ссылкой миллиметрового расположенных вдоль верхней части представления . Два различных инструментов ресниц показаны, с звездочкой (*) используется для обозначения плеть, полученный из естественно пролить человеческую ресницу, и две звездочки (**) используется для обозначения плеть, которая была получена от естественно пролить кошачьего уса и обрезается до сделать несколько тупой конец. В каждом оксебе, плеть продет через пипетки и скрепили несколькими слоями суперклея постепенно создать сильную печать для стабилизации / якорь плеть с пипетки, прикрепленной к манипулятора.

Рисунок 4
Рисунок 4. Характеристика изменений в развитии в области почек предшественников в дикого типа эмбрионов рыбок данио. А) Слайд схему с указанием области отображается для анализа в (B, C). Б) эмбрионов дикого типа на 1, 3, и 5 сомитов окрашивали по двухцветной пожелает оценить состав области почек предшественников, что дает подняться на эмбриональной почки, или предпочки. (Левая колонка) Стенограммы кодирующие фактор pax2a транскрипции (окрашенный в фиолетовый) отметить несколько населения в зародыше, в том числе почечной рrogenitor поле, которое выходит из промежуточной мезодермы. Стенограммы кодирующие Notch лиганда DLC отметить сомиты, которые формируют из параксиальной мезодермы (окрашенных в красный цвет). (Правая колонка) Когда выражение DLC транскриптов (окрашенных в фиолетовый) и задний мозг ромбомере маркер Krox20 (окрашенных в красный цвет), рассматриваются в тех же эмбрионов, DLC выражение можно наблюдать в ростральной подобласти почечных клеток-предшественников, расположенных рядом с сомитах 1-5, который был закрыт во время совместного окрашивания DLC с pax2a. С) эмбрионов дикого типа на стадии 14 сомитов были двойной или тройной окрашенных с помощью комбинации почечной маркера (фиолетовый), сомит маркер smyhc1 (красный) и задний мозг ромбомере маркер Krox20 (также красный). (Верхняя панель) На данном этапе pax2a стенограммы продолжать демаркацию почечных клеток-предшественников. (Ближний, нижние панели) На территории почечной предшественников, ростральной поддомен отмеченпо slc4a4 и стенограммы, которые кодируют slc12a3 отметить хвостовой поддомен.

Рисунок 5
Рисунок 5. Использование плоских установленных препаратов для характеристики фенотипа, вызванные генетическими мутациями или химических генетических возмущений, которые модулируют биосинтез ретиноевой кислоты. Характер экспрессии WISH на стадии 15 сомитов из wt1a (фиолетовый) и smyhc1/krox20 (красный) сравнивали между дикими типов и эмбрионов с недостатками в ретиноевой кислоты (RA) производства из-за дефектов в альдегиддегидрогеназы 1a2 (NLS и либерал-мутации) или химического ингибирования ретинальдегида дегидрогеназы с diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Снижение производства РА в Lib немного более серьезными, чем NLS, напримерчто Лив эмбрионы выразить немного уменьшен окрашивание wt1a транскриптов, чем же в постановке NLS мутантные эмбрионы, а DEAB лечение диких видов связано с полной отменой выражения wt1a.

Discussion

Данио рерио оказались чрезвычайно ценным модельный организм в течение всего исследовательского сообщества в последние годы. Данио рерио проявляют значительную степень сохранения генетических ресурсов с тем из высших позвоночных, и преимущества, связанные с их анатомии, разведения и жизненного цикла сделать этот вид очень поддаются экспериментальных исследований. Кроме того, продвижение молекулярных методов, применимых к данио еще больше способствовало использование этого модельного организма в научных исследованиях. Например, большое разнообразие трансгенных данио линий были получены для изучения прогрессирования заболевания и ответить на многие фундаментальные вопросы, которые лежат ключевые механизмы развития, включая органогенеза.

Соответственно, на основе динамического использования данио как в болезни и исследований развития, маркировки клеток методологии и сигнал количественное являются одним из важнейших аспектов анализа данных. В то время как методы, которые используют люминесцентные апtibodies может быть использован для обнаружения экспрессии белка в трансгенных данио, исследователи, как правило, полагаются на стандартные процедуры, как WISH 12-16 изучить пространственно-временной локализации транскриптов гена в фиксированном, нетрансгенной данио образца. На самом деле, ЖЕЛАНИЕ является одним из наиболее широко используемых методов в биологии 16, и является жизненно важным инструментом используется для характеристики фенотип генетических мутаций и химических генетических возмущений. Тем не менее, жаль, что связано с рядом потенциальных ловушек и проблем. Чтобы подтвердить специфичность антисмысловой ribroprobe, смысловые рибозонды могут быть использованы в качестве контроля для оценки специфичности антисмысловой рибозонд шаблонов окрашивания. В то время как разделы 4 и 5 представлены в порядке маркировки и обнаружения дигоксигенином-меченного зонда с последующим флуоресцеина-меченным зондом, этот порядок может быть отменено. Как правило, более слабые сигналы (гены с более низкими уровнями экспрессии) лучше всего обнаружены с дигоксигенином-меченных зондов и этого пятнаразработан первый с фиолетовым подложке, после чего обнаружения и окрашивания более сильным сигналом (с избытком выразил генов) с помощью красную подложку. Однако, если двухцветные реакции будут выполнены, то рекомендуется, что различные комбинации этикеток и субстратов проверяются, чтобы найти процедуру, которая больше всего подходит для сбора и анализа данных. Кроме того, раз это предусмотрено блокирование, инкубацию антител и промывки, представленную в разделах 4-5 приспособлены для эмбрионов в возрасте до 24 ч после оплодотворения; длительные интервалы этих же шагов со взрослыми эмбрионов может привести к накоплению солей на образец. Обширные советы по устранению неполадок стандартный данио эмбрионов WISH уже описаны в литературе 12-16. Вероятно, наиболее общие дилеммы является высокий фон. Мы рекомендуем увеличить количество MABT моет в шаге 4,7 до 15-20 стирок при необходимости, хотя, по нашему опыту добавление ночной MABT 'супер-стирки "дает выдающиеся результаты при использовании в сочетании с 10 или более коротких MABT моет перед переходом к шагу 4.8. Другой пример дилемма плохое проникновение зонда, который может произойти с длительным рибонуклеотидных. Стрижка в рибозонд следующем шаге 3.6 через щелочного гидролиза может противодействовать этому. По нашему опыту с молодыми образцов, зонд сдвига обычно не требуется. Тем не менее, следует иметь в виду, что такие параметры, как это может быть способствующие факторы в исходе эксперимента желание, и мы предлагаем экспертизу этих полезных инструкций по устранению неполадок уже публично доступных в сообществе по мере необходимости для уточнения экспериментальные параметры для WISH в свой собственный Исследование 12.

В дополнение к традиционным методам WISH 12-16, имело место постоянное появление достижений в WISH методологий и альтернативных протоколов, которые были сформулированы. Они включают новые способы обнаружения сигнала, например, с использованием флуоресценциилюминесценции 17-19, к методам, которые позволяют локализацию микроРНК 20. Тем не менее, несмотря на множество улучшений, которые были сделаны с существующими методами маркировки клеток, эффективность этих процедур отрицаются если пятно (ы) не могут быть легко визуализированы в образце интереса в нужной точке времени. Это ограничение является проблематичным для исследователей особенно когда она относится к ранних эмбриональных стадиях данио онтогенеза, который потенциально может привести к пробелам в нашем понимании различных процессов развития, которые возникают в это время. Во время нормального развития данио, желточный мешок будет постепенно уменьшаться в размерах по мере старения эмбриона 11. Таким образом, на этих более поздних стадиях развития (> 24 часа после оплодотворения), окрашивание WISH довольно проста для анализа, потому что эмбрион больше по сравнению с прилегающей желточного мешка. Однако, это не тот случай со сцены хвостовой почки в начале сомитогенеза (когда эмбриональныемасса расположена вокруг желтка), где непрозрачная желток может иногда скрывать визуализацию пятно. Следовательно, метод плоской монтажа была разработана, чтобы помочь облегчить визуализации и анализа данных проблем, связанных с характеристикой ранних данио образцов эмбриона (схематизированных в рисунках 1 и 2), и был широко использован с систематической фенотипирования генетических мутаций изолированных с первых крупномасштабных генетических экранов 21.

С появлением техники плоским монтажа, анализ ранних стадиях развития была значительно улучшена. После того, как желток удаляется из эмбриона, можно заложить квартиру эмбриона на предметное стекло в желаемой ориентации для работы с изображениями. Это двумерный положение позволяет просматривать весь эмбриона сразу, что избавляет от необходимости вращать образец. Многочисленные ткани расположены в широких областях эмбриона, например,предшественники, которые формируют кровь и почки. Кроме того, один, возможно, потребуется, чтобы сравнить несколько различных развивающихся тканей в одно время. Плоская монтажная позволяет исследователю одновременно просматривать всю область таких клеточных групп, и, таким образом может очень помочь количественными такие как измерения площади для ткани или клеток пунктам. Этот метод, в конечном счете помогли привести ко многим открытиям, касающимся целый ряд важных механизмов развития, лежащих в основе кроветворение, нейрогенез и органогенез. Таким образом, после освоения, заявки на этот простой метод для исследователей весьма существенны.

Например, в исследовании, рассматривая клонов выбор во кроветворения, плоским смонтировать препараты эмбрионов данио на сомитных стадиях (SS) 14 и 18 были использованы для иллюстрации изменения, которые произошли в паттерне экспрессии в PU.1 цинка фактора палец транскрипции между дикого типа и GATA1 морфолино вводят эмбрионов 22.Этот метод позволил обнаружить расширенной области PU.1 при 18 сс, указывая, что GATA1, скорее всего регуляции экспрессии PU.1 в промежуточной клеточной массы (ICM) вокруг этот момент времени. Установлены Дополнительная плоским эмбрионы окрашенные для различных эритроидных генов, включая gtpbp1 и epsin продемонстрировал убыток в экспрессии этих генов в VLT мутантов, которые были GATA1 - / -. Дальнейший анализ не показал никаких изменений в экспрессии генов erythoid как biklf и testhymin, которые были, как известно, зависит от Гата деятельности. Таким образом, в сочетании с их других экспериментальных результатов было выявлено, что GATA1 имеет важное значение в регулировании дифференцировки клеток в пределах миело-эритроидных линии. В исследовании развития нервного гребня, плоские опоры были использованы для изучения экспрессии Crestin в Монблан (моб M610) мутантов в исследованииизучение роли Монблан и функции генов tfap2a 23. На 10 и 20 сс, выражение Crestin был полностью отменен в голову и была снижена в багажнике области толпы M610 мутантов по сравнению с нормальной экспрессии дикого типа, в конечном счете, помощь этой группе сделать вывод о важности Монблан и tfap2a регулирования при формировании нервного гребня. Кроме того, с точки зрения органогенеза, плоские крепления позволили открытие присутствии различных областях в начале почечной области предшественников во время развития данио почек эмбриона, известный как предпочки. Данио эмбрион обеспечивает консервативный и в то же анатомически простой системы для изучения того, как почечные предшественники привести к нефрона функциональных блоков, которые составляют предпочки, процесс, известный как нефрогенеза 6,7 (рис. 4). Квартира смонтировать анализ была полезна для документов областях реNAL предшественники и рассекать на исход изменений в сигнализации РА во предпочки паттерна 6,7 (рис. 5), которая ранее была неизвестна. Взятые вместе, эти примеры показывают, что на самом деле есть много широкое применение для этой квартире установить протокол в изучении разнообразных процессов, которые происходят во время нормального развития и больных государств.

Концептуально, эта квартира процедура монтажа довольно прост в целом. Тем не менее, манипуляции и степень изящества необходимые освоить этот метод может быть довольно сложным в освоении в отсутствие наглядной демонстрации. Таким образом, этот протокол был составлен для того, чтобы исследователи, особенно новички в данио модели, с возможностью, чтобы лучше понять, как выполнять эту технику и делиться нашим советам на реагенты, которые могут оптимизировать обработку тканей. Мы надеемся, что этот протокол, в конечном счете позволить другим в сообществе уточнить наиболее идеальные условия выборки, чтобы быть уСЭД для премиум изображений, анализа данных и связи их результатов в публикациях. В конечном счете, это должно позволить исследователей преодолеть анатомические препятствия на данио во время раннего эмбриогенеза, которые могут затенить представление результатов эксперимента, и решить эти за счет использования этой простой, но значительного техники.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана финансирование в RAW от каждого из следующих: NIH гранты K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О'Коннор Стартер Scholar предоставления гранта № 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук. Мы особенно хотели бы поблагодарить Элизабет и Майкл Галлахер, вместе со всей Галлахер семьи, который передал щедрый подарок в Университет Нотр-Дам, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся преданность в обслуживании и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей исследовательской лаборатории для своих комментариев, дискуссий и идеи по этой работе, кака также календулы (Maripooka) и Zinnia Wingert для обеспечения естественно пролить кошачьих усов, чтобы сделать самые превосходные инструменты ресниц для нашего исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  5. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  6. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  9. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
  10. Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  11. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
  13. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
  14. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
  15. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
  16. Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
  17. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
  18. Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
  19. Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
  20. Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
  21. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  22. Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
  23. Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).

Tags

Биология развития выпуск 89 животные позвоночные рыбы данио рост и развитие морфогенез эмбриональных и развитие плода органогенез естественнонаучных дисциплин эмбрион вся гора плоским крепление deyolking томография
Квартира Гора Подготовка к наблюдению и анализу эмбрионов рыбок данио образцами запятнана вся гора<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N.,… More

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter