EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Nar1
Summary
The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.
Abstract
Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) supervisa valoraciones redox son un poderoso método para determinar el potencial punto medio de cofactores en proteínas y para identificar y cuantificar los cofactores en su estado redox detectable.
La técnica es complementaria a la electroquímica directa (voltametría) se aproxima, ya que no ofrece información sobre las tasas de transferencia de electrones, pero no establecer el estado redox identidad y de los cofactores en la proteína en estudio. La técnica es ampliamente aplicable a cualquier proteína que contiene una resonancia paramagnética electrónica (EPR) cofactor detectable.
Una titulación típica requiere proteína de 2 ml con una concentración de cofactor en el intervalo de 1-100 mM. La proteína se valora con un reductor químico (ditionito de sodio) o el oxidante (ferricianuro potásico) para contrapesar la muestra en un determinado potencial. Un alambre de platino y un electrodo de referencia de Ag / AgCl se conectan a un voltiometro para medir el potencial de la solución de proteína. Un conjunto de 13 diferentes mediadores redox se utiliza para equilibrar entre los cofactores redox de la proteína y los electrodos. Las muestras se extraen a diferentes potenciales y los espectros de Resonancia Paramagnética Electrónica, característicos de los diferentes cofactores redox en la proteína, se midieron. La trama de la intensidad de la señal en comparación con el potencial de la muestra se analiza utilizando la ecuación de Nernst con el fin de determinar el potencial de punto medio del cofactor.
Introduction
Llama la atención que los procesos químicos más fundamentales que sustentan la vida en este planeta, la fotosíntesis, la fijación de nitrógeno y la respiración, son catalizadas por grandes complejos de proteínas que contienen una amplia gama de cofactores redox orgánicos e inorgánicos. Se ha estimado que aproximadamente el 30% de todas las proteínas contienen uno o más cofactores metálicos. 1,2 identificación y caracterización de los cofactores redox se pueden establecer utilizando la electroquímica directa (por ejemplo, proteína de voltametría película) o valoraciones redox. Las dos técnicas son complementarias en su naturaleza y aplicabilidad. Voltamperometría ofrece determinación rápida de potenciales de punto medio y la cinética de transferencia de electrones de cofactores que pueden reaccionar con una superficie de electrodo. 3,4 lo general, esto funciona bien para las proteínas de transferencia de electrones, tales como citocromo c o ferredoxina. Y a veces funciona para las proteínas más complejas que han sido inmovilizados a una superficie del electrodo. El conocimiento detallado de lanaturaleza de cofactores en la proteína tiene que estar disponible, ya que el voltamograma no dará ninguna información directa sobre la identidad del cofactor. Valoraciones redox son más laborioso para ejecutar y requieren cantidades mg de proteína. Sin embargo, ofrecen información sobre el potencial punto medio y la identidad del cofactor. 5 Además, en una sola titulación múltiples cofactores en una proteína pueden ser monitoreados.
El principio de una titulación redox es que la proteína activa redox o enzima se reduce o se oxida químicamente. Con el fin de asegurarse de que los cofactores reaccionan con los mediadores reductor u oxidante redox se utilizan. Estos mediadores redox también reaccionan con un electrodo de modo que el potencial de la solución se puede medir. Los mediadores actúan como un tampón redox y se equilibran entre los cofactores en la proteína y el electrodo. Después de poising químicamente el potencial en el valor deseado, se extrae una muestra y rápidamente congelados en nitrógeno líquido en AWait posterior análisis con técnicas espectroscópicas. Espectroscopia EPR es particularmente útil a este respecto, ya que puede ser usado para medir cuantitativamente centros metálicos paramagnéticos o radicales orgánicos.
La valoración redox se puede realizar en dos direcciones: de menor a mayor o de mayor a menor potencial punto medio. La elección depende de la estabilidad de los cofactores en estudio. A menudo es prudente comenzar a bajo potencial y añadir oxidante para escalonadamente aumentar el potencial. Esto se llama una titulación oxidativo y se describe aquí. Aquí mostramos la valoración redox del cluster hierro-azufre que contiene proteína Nar1 de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína está implicada, probablemente como un andamio de proteínas, en la citosólica de hierro-azufre biosintética clúster maquinaria (CIA vía) 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
La serie de 13 mediadores redox permite un equilibrio redox en la solución en el rango de -0,45 a 0,3 V frente a SHE (Tabla 1 y Figura 3). Bien por encima y por debajo de estos potenciales de todos los mediadores son o bien totalmente reducidos o completamente oxidados y, por tanto, no más lejos de equilibrio con los centros redox activos de la proteína pueden ocurrir. Este es un concepto importante, como en la literatura titulaciones redox veces se llevan a cabo con sólo dos o tres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por una beca de investigación de la Escuela Nacional de Investigación Combinación holandés, Catálisis Controlado por Diseño Química (NRSC-Catálisis). Dr. HY Steensma y el Dr. GPH van Heusden de la Universidad de Leiden son reconocidos por su apoyo a la expresión recombinante de S. cerevisiae Nar1.
Materials
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) ·(HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
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