外囊泡发挥生理和病理过程,包括凝血,免疫应答和肿瘤或在药物递送或再生医学作为潜在治疗剂的重要作用。该协议提出了在采用可调电阻脉冲检测各种流体隔离和非隔离外囊泡的定量和大小的表征方法。
外囊泡(EVS),其中包括“微泡”和“外来”,是体液非常丰富。近年来,两国在电动汽车的兴趣大幅增加。电动车辆已经显示出在各种生理和病理过程,包括凝血,免疫应答和肿瘤起着重要的作用。此外,电动汽车具有潜在的治疗剂,例如作为药物递送载体或作为再生医学。由于其体积小(50〜1000纳米)的准确定量和电动车的尺寸分析在技术上具有挑战性。
这个协议描述了如何可调电阻脉冲感测(的TRP)技术,采用了qNano系统,可以被用于确定电动车辆的浓度和大小。的方法,该方法通过一种纳米尺寸的细孔依赖于它们的传输电动车辆的检测,是比较快的,足以使用小体积的样品,并且不需要的PURification和电动汽车的浓度。旁边的正常运行协议的另一种方法是使用描述样品加入已知大小和浓度的聚苯乙烯珠粒。直接在生物流体测量电动汽车时,这种实时校准技术可用于克服技术障碍遇到。
从细胞起源囊泡体液1非常丰富。这些所谓的胞外囊泡(电动车)(50 – 在大小为1000nm)由任一融合多泡体与细胞膜或细胞膜的直接向外出芽形成。近年来,在电动汽车科研的兴趣大大增加,从而导致过多的电动汽车为重点的出版物,其中新的功能和电动车的特征进行了描述1。现在电动车被认为是参与生理和病理过程,如信号转导,免疫调节等血液凝固1-4浩如烟海。在癌症,电动车似乎在转移前龛5,6,转移亲癌变内容7,8血管8的和刺激的形成的作用。除此之外,电动车进行了探讨,作为治疗药物9投递代理。
尽管有这些德velopments,电动汽车的可靠的定量仍然具有挑战性。传统上,间接量化方法被使用,它依赖于总蛋白含量或特定蛋白质的定量。尽管广泛使用,这些技术不占蛋白质每EV的差异,也污染蛋白聚集体和蛋白质电动车之间造成歧视。此外,这些技术都需要隔离电动车辆,这在许多情况下,使EV浓度的生物样品中的比较是不可能的。
因此,努力着手开发新的方法,让更多的精确和直接的EV测量10。这份报告描述了可调电阻脉冲感应(跨国激进党)的可靠的定量和电动汽车的规模纹。
目前,qNano仪( 图1a)是跨国激进党市面上唯一平台。中的TRP,非导电性弹性膜间断无线个纳米大小的孔被分隔两个流体细胞。一流体细胞填充有感兴趣的样品,而其他细胞填充有颗粒的无电解质。通过施加电压,离子流/电流被建立,其在颗粒的通孔的转移改变( 图1b)。这个电流阻断('电阻脉冲')的幅度正比于粒子11( 图1c)的量。封锁时间可以用来评估的ζ-电势的颗粒,这依赖于颗粒的特性,如电荷或形状12。未知粒子的大小仿形可以通过比较所引起的未知粒子与具有已知直径所造成的校准微粒的电阻脉冲电阻脉冲来进行。除了封锁事件的严重程度,这其中发生率进行测量。这计数率热力ES上的粒子浓度。由于浓度和封锁的速率是线性比例13中 ,使用单个校准样品与已知浓度和粒径的颗粒允许浓度14和未知样品的粒度分布11的测定。
颗粒通过纳米孔的运动由电kinetic-(电泳和电渗透)和流体力15确定。通过使用可变压力模块(VPM)的流体单元之间的压力差可以被诱导作为一个额外的力。施加正压力增加粒子的流动速率,这可能是有益的,当粒子浓度低。此外,压力可被施加以减少电动力学力的作用。使用纳米孔具有相对小的孔隙直径时,这一点尤为重要(NP100,NP150和NP200可能),为经常用于电动汽车的检测。这些纳米孔,施加显著压力即使当,电动力学的力可以根据粒子的表面电荷,仍不可忽视16。通过测量颗粒速度在多重压力,一个电 – 动力学校正,从而更准确地,EV浓度可以计算出来。
在这里,提供详细的协议来确定电动车的尺寸分布和浓度。旁边的常规操作协议,另一种方法被描述,其中样品加入已知大小和浓度17的聚苯乙烯珠粒。这种实时校准技术可用于克服一些技术挑战直接在生物体液,如尿,血浆和细胞培养上清,或测量电动汽车时遇到当纳米孔的比的测量很长一段时间的稳定性不能保证。
在这个手稿的报价方法进行定量分析,采用的TRP电动汽车的规模特征描述的协议。这些TRP平台的主要优点是样本量小,相对短的测量时间,并没有所需的样品操纵。
前提条件进行精确测量的TRP是保持条件的校准和样品测量之间是相同的。这包括相同的缓冲液的使用量以及相同的仪器设定,例如纳米孔尺寸,电压和施加压力。原VPM缺少一种机制,用于在施加压力的精确设定,从而使在样品之间施加的压力的微小差异。另外,吸液在VPM蒸发可以在不同时间点测量诱发轻微的压力差和VPM因此,应该经常被重新灌注。这些限制可能已经解决了引进VPM2,哪有一个基于点击的比例,并基于空气压力。
在这个手稿中描述的备选方案是特别适用于电动车辆的测量非纯化的生物样品17中。我们相信,缓冲成分,如糖,脂质,蛋白质和其它较大的碎片,可以在某些情况下影响测量条件太多的标准协议是适用的。另外的校准珠的样品,而不是比较两个独立的测量值引入“实时校准”。比较具有不同的和/或未知流体的背景含量样品(不同供体的例如血浆)时,这个方法是特别合适的。尽管差异电动汽车和聚苯乙烯颗粒( 例如颗粒密度和表面电荷),理论模型和实验数据之间存在突出的聚苯乙烯小珠的可用性量化和电动汽车的尺寸分析,的前提下,该显著施加压力15,19。为了尽量减少电动力的影响,相对较大的NP150 / NP200纳米孔和显著正压的使用建议。
电动汽车和校准珠粒按大小区分。因此,纳米孔具有通过施加拉伸,制成直径在那里检测两个电动汽车和较大的校准微粒的观察被打开。自开业以来的孔隙会降低对较小颗粒的敏感性,只比电动车具有一定规模的记录(使用335 nm的校准珠时,往往电动车> 120 nm)的大。最低检出限为电动汽车可以降低到大约90纳米,用203纳米校准珠上的NP150纳米孔。然而,这种设置可能是不可行的,当较大的电动车引起的纳米孔经常堵塞。这些阻碍电动车的存在可以强制设置的利用率,其中人口电动车,太小意图CH中的检测阈值,将不会被检测到。
难度,试图测量颗粒比大小100nm以下时,操作该系统增加。在这种情况下,检测可以通过增加电解质的盐的浓度可以提高。离子浓度的增加将导致相对增加的封锁量值为小颗粒(较大的信号 – 噪声比)。这种技术对于电动车辆的测量的生存能力有虽然被验证,如增加盐的浓度可影响电动车辆的体积。
总之,这些TRP平台,可用于直接量化和电动车的尺寸表征。因为没有隔离或电动操纵(抗体结合或荧光标记)是必需的,该平台适用于在生物流体直接EV定量。一种替代方案是提供一种能够有利于样品,其中缓冲液组分诱导显著孔隙cloggin克事件,使得标准协议不可行的可靠利用。
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |