שלפוחית תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית תאית מבודדת ולא מבודדת בנוזלים שונים תוך שימוש בחישת דופק resistive מתכונן.
שלפוחית תאית (EVS), הכוללים 'microvesicles' ו 'exosomes', נמצא בשפע רב בנוזלי גוף. בשנים האחרונות חלו גידול עצום בעניין בכלי רכב חשמלי. כלי רכב חשמליים הוכחו לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן. בנוסף, כלי רכב חשמליים יש פוטנציאל כסוכנים טיפוליים, למשל ככלי רכב משלוח סמים או כרפואת רגנרטיבית. בגלל הגודל הקטן שלהם (50 ל1,000 ננומטר) כימות מדויק ואפיון גודל של כלי רכב חשמלי הוא מאתגר מבחינה טכנית.
פרוטוקול זה מתאר טכנולוגיה איך מתכונן חישת דופק התנגדות (tRPS), שימוש במערכת qNano, ניתן להשתמש בם כדי לקבוע את הריכוז וגודל של כלי רכב חשמליים. השיטה, הנשענת על זיהוי של כלי רכב חשמליים עם ההעברה שלהם דרך נקבובית בגודל ננו, היא מהירה יחסית, די בשימוש באמצעי אחסון מדגם קטן ואינה דורשת PURification וריכוז של כלי רכב חשמליים. הדגימות הבאה לפרוטוקול פעולה הרגיל גישה חלופית היא באמצעות תיארה ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז. בזמן אמת זה טכניקת כיול יכול לשמש כדי להתגבר על מכשולים טכניים נתקל במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים.
שלפוחית ממוצא סלולארי הן נרחבת ביותר בנוזלי גוף 1. שלפוחית אלה שנקראים תאי (EVS) (50 – 1,000 ננומטר בגודל) נוצרות על ידי שני ההיתוך של גופים רב לפוחי עם קרום התא או על ידי ניצנים החוצה ישירים של קרום התא. בשנים האחרונות, עניין מדעי בכלי רכב החשמלי גדל מאוד, וכתוצאה מכך שפע של פרסומים ממוקדים EV, שבו פונקציות ומאפיינים של כלי רכב חשמליים חדשות מתוארים 1. כלי רכב חשמליים נמצאים כעת האמינו להיות מעורב במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון העברת אותות, רגולציה חיסונית, וקרישת דם 1-4. בסרטן, כלי רכב חשמליים נראים לשחק תפקיד בהיווצרות של נישות premetastatic 5,6, העברת פרו סרטני תוכן 7,8 וגירוי של אנגיוגנזה 8. חוץ מזה, כלי רכב חשמליים נחקרים כסוכני משלוח של סוכנים טיפוליים 9.
למרות דה אלהvelopments, כימות אמין של כלי רכב חשמלי נותר מאתגר. באופן מסורתי, שיטות כימות עקיפות משמשות, אשר מסתמכות על כימות של תכולת חלבון כוללת או חלבונים ספציפיים. למרות שימוש נרחב, הטכניקות הללו אינן מסבירות הבדלי חלבון לכל EV, ואינה מבחינות בין זיהום אגרגטים חלבון וחלבונים בכלי רכב חשמלי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות בידוד של כלי רכב חשמליים, אשר במקרים רבים הופך את ההשוואה של ריכוזי EV בדגימות ביולוגיות בלתי אפשרית.
לכן, מאמצים נעשים כדי לפתח שיטות חדשניות המאפשרות לEV יותר המדויק וישיר מדידה 10. דו"ח זה מתאר את השימוש בחישה מתכונן דופק התנגדות (tRPS) לכימות אמין ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים.
נכון לעכשיו, qNano מכשיר (איור 1 א) היא הפלטפורמה היחידה זמינה מסחרי עבור tRPS. בtRPS, קרום אלסטי שאינו מוליך מנוקד wiה נקבובית בגודל ננו הוא מפריד בין שני תאי נוזל. אחד מתאי נוזל מלא במדגם של עניין, ואילו התאים האחרים מלאים באלקטרוליט ללא חלקיקים. באמצעות הפעלת זרם, זרימה / זרם חשמלי יוני היא הוקם, אשר שינתה עם העברת החלקיקים דרך הנקבובית (איור 1b). סדר הגודל של מצור הנוכחי ("דופק התנגדות") הוא פרופורציונאלי להיקף 11 (איור 1 ג) החלקיקים. משך המצור ניתן להשתמש כדי להעריך את zeta-הפוטנציאל של חלקיקים, אשר מסתמך על מאפייני חלקיקים כגון תשלום או לעצב 12. פרופיל גודל של חלקיקים ידועים יכול להתבצע על ידי השוואת פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקים לא ידועים עם פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקי כיול בקוטר ידוע. חוץ מזה סדר הגודל של אירוע מצור, ששיעורה אלה מתרחשים נמדד. רלי קצב ספירה זוes בריכוז החלקיקים. מאז הריכוז ושיעור החסימות הם באופן ליניארי יחסיים 13, באמצעות מדגם כיול יחיד עם חלקיקים של ריכוז ידוע וגודל חלקיקים מאפשר למדידת הריכוז 14 והתפלגות גודל 11 של מדגם לא ידוע.
התנועה של חלקיקים דרך nanopore נקבעה על ידי אלקטרו kinetic- כוחות (electrophoretic ואלקטרו האוסמוטי) וfluidic 15. על ידי שימוש במודול הלחץ משתנה (VPM) הבדל בלחץ בין תאי הנוזל יכול להיגרם ככוח נוסף. הפעלת לחץ חיובי מגדילה את קצב הזרימה של חלקיקים, אשר עשוי להועיל כאשר ריכוז החלקיקים הוא נמוך. כמו כן, יכול להיות מיושם בלחץ כדי להפחית את ההשפעה של כוחות אלקטרו קינטית. זה חשוב במיוחד בעת השימוש בnanopores עם נקבוביות בקוטר קטן יחסית (NP100, NP150 ואולי NP200) לעתים קרובות משמש לזיהוי של כלי רכב חשמלי.לnanopores אלה, גם כאשר הפעלת לחץ משמעותי, כוחות אלקטרו הקינטית יכולים, בהתאם למטען משטח חלקיקים, להישאר nonnegligible 16. על ידי מדידת שיעור החלקיקים בלחצים מרובים, אלקטרו kinetically מתוקן, ולכן יותר מדויק, ניתן לחשב ריכוז EV.
הנה, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל וריכוז של כלי רכב חשמליים. בסמוך לפרוטוקול הפעולה הרגיל, גישה חלופית מתוארת בי דגימות ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז 17. טכניקת כיול בזמן אמת זה יכול לשמש כדי להתגבר על כמה מהאתגרים הטכניים נתקלו במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, פלזמה וsupernatant תרבית תאים, או כאשר יציבות של nanopore על פני תקופה של זמן מדידה ארוכה לא יכולה להיות הבטיח.
הפרוטוקולים מתוארים במתודולוגיות הצעת כתב היד הזה לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים באמצעות tRPS. יתרונותיו העיקריים של פלטפורמת tRPS הם גודל המדגם הקטן, משך מדידה קצר יחסית והיעדר המניפולציה מדגם הנדרש.
תנאי מוקדם למדידת tRPS מדויקת הוא לשמור תנאים זהים בין מדידות כיול ומדגם. זה כולל את השימוש במאגרים זהים, כמו גם הגדרות מכשיר זהות, כגון גודל nanopore, מתח ולחץ מופעל. VPM המקורי חסר מנגנון להגדרה של הלחץ המופעל מדויקת, ובכך גורם להבדלים קלים בלחץ שימושי בין דגימות. כמו כן, אידוי של נוזל תחול בVPM יכול לגרום להבדלי לחץ קטין בעת מדידה בנקודות זמן שונים וVPM ולכן צריך להיות לעתים קרובות מחדש דרוך. מגבלות אלה עלולות להיות כבר נפתרו על ידי הקדמה של VPM2, שיש קנה מידה המבוסס על לחץ ומבוסס לחץ אוויר.
הפרוטוקול החלופי שתואר בכתב היד הזה הוא מתאים במיוחד למדידה של כלי רכב חשמלי בדגימות ביולוגיות שאינם מטוהרת 17. אנו מאמינים כי רכיבי חיץ, כגון סוכרים, שומנים, חלבונים וגדולים יותר פסולת אחרות, יכול במקרים מסוימים להשפיע על תנאי המדידה יותר מדי עבור הפרוטוקול הסטנדרטי להיות ישים. תוספת של חרוזים כיול למדגם ולא השוואה בין שתי מדידות נפרדות מציגה 'כיול בזמן אמת'. שיטה זו מתאימה במיוחד כאשר משווה דגימות (למשל פלזמה של תורמי דם שונים) שיש לי תוכן רקע fluidic שונה ו / או לא ידוע. למרות שקיימים הבדלים בין כלי רכב חשמליים וחלקיקי פוליסטירן (צפיפות חלקיקים למשל ותשלום פני השטח), מודלים תיאורטיים, כמו גם נתוני ניסוי מדגיש את השימושיות של חרוזי פוליסטירן לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים,תחת התנאי שהלחץ משמעותי מיושם 15,19. כדי למזער את השפעתם של כוחות electrokinetic, שימוש בNP150 / nanopore NP200 הגדול יחסית והלחץ חיובי משמעותי מומלץ.
כלי רכב חשמליים וחרוזים כיול נבדלים ביניהם בגודל. כתוצאה מכך, nanopore יש נפתח על ידי יישום מתיחה, לקוטר שבו גילוי של שני כלי רכב חשמליים וחלקיקי כיול הגדולים יותר הוא ציין. מאז הפתיחה הנקבובית תקטן הרגישות כלפי חלקיקים קטנים יותר, רק EVS גדול יותר מגודל מסוים נרשמים (לעתים קרובות כלי רכב חשמלי> 120 ננומטר בעת שימוש בחרוז כיול 335 ננומטר). גבול הגילוי המינימאלי לכלי רכב חשמליים יכול להיות ירידה של כ 90 ננומטר, באמצעות 203 חרוזים כיול ננומטר על nanopore NP150. עם זאת, תוכנית התקנה זו יכולה להיות unviable כאשר כלי רכב חשמליים גדולים יותר לגרום לסתימה תכופה של nanopore. הנוכחות של כלי רכב חשמליים החוסמים אלה עלולות לאלץ את הניצול של התקנה שבו אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים, קטנה מדי למחשבהCH סף הגילוי, לא יזוהה.
הקושי לפעול עליות המערכת כאשר מנסה למדוד חלקיקים קטנים יותר מאשר בגודל 100 ננומטר. במקרים כאלה, זיהוי ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז מלח של אלקטרוליט. ריכוז יון מוגבר יגרום לסדרי גודל יחסית מוגברים מצור לחלקיקים קטנים (גדול יותר יחס אות לרעש). הכדאיות של טכניקה זו למדידות של כלי רכב חשמליים צריכה להיות מאומתת אם כי, כפי שריכוזי מלח מוגברים עשויים להשפיע על עוצמת הקול של כלי רכב חשמליים.
לסיכום, פלטפורמת tRPS יכולה לשמש לכימות ישיר ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים. מאז לא נדרש בידוד או המניפולציה EV (נוגדן תיוג מחייב או ניאון), הפלטפורמה מתאימה לכימות EV ישיר בנוזלים ביולוגיים. פרוטוקול חלופי ובלבד שיכול להיות מועיל עבור דגימות שבו רכיבי חיץ לגרום cloggin הנקבובית משמעותיאירועים גרם, מה שהופך את הניצול אמין של הפרוטוקול הסטנדרטי unviable.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |