Vesículas extracelulares juegan papeles importantes en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer o como agentes terapéuticos potenciales en la administración de fármacos o la medicina regenerativa. Este protocolo presenta métodos para la cuantificación y caracterización de tamaño de las vesículas extracelulares aisladas y no aisladas en diversos fluidos utilizando sintonizable de detección de pulso resistiva.
Vesículas extracelulares (EVs), incluyendo 'microvesículas' y 'exosomas', son muy abundantes en los fluidos corporales. Los últimos años han sido testigo de un enorme aumento en el interés por los vehículos eléctricos. EVs han demostrado que desempeñan papeles importantes en varios procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer. Además, los vehículos eléctricos tienen potencial como agentes terapéuticos, por ejemplo, como vehículos de suministro de fármacos o como medicina regenerativa. Debido a su pequeño tamaño (50 a 1000 nm) cuantificación exacta y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos es técnicamente difícil.
Este protocolo describe cómo sintonizable tecnología de detección de pulso resistiva (TRP), utilizando el sistema de qNano, se puede utilizar para determinar la concentración y el tamaño de los vehículos eléctricos. El método, que se basa en la detección de los vehículos eléctricos sobre su transferencia a través de un poro de tamaño nano, es relativamente rápido, es suficiente el uso de pequeños volúmenes de muestra y no requiere la purficación y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de operación regular un enfoque alternativo se describe utilizando muestras adicionadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración. Este tiempo real técnica de calibración se puede utilizar para superar los obstáculos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en los fluidos biológicos.
Las vesículas de origen celular son muy abundantes en los fluidos corporales 1. Estos llamados vesículas extracelulares (SVE) (50 – 1000 nm de tamaño) se forman por cualquiera de fusión de cuerpos multivesiculares con la membrana celular, o por gemación directa en el exterior de la membrana celular. En los últimos años, el interés científico en los vehículos eléctricos se ha incrementado en gran medida, lo que resulta en una gran cantidad de publicaciones EV-centrado, en el que las nuevas funciones y características de los vehículos eléctricos se describen 1. EVs ahora se cree que están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos tales como la transducción de señales, regulación inmune, y la coagulación de la sangre 1-4. En el cáncer, los vehículos eléctricos parecen jugar un papel en la formación de nichos premetastatic 5,6, la transferencia de pro-canceroso contenido de 7,8 y la estimulación de la angiogénesis 8. Además de esto, los vehículos eléctricos se exploran como agentes de suministro de agentes terapéuticos 9.
A pesar de estos dedesarrollos, la cuantificación fiable de los vehículos eléctricos sigue siendo un reto. Tradicionalmente, se utilizan métodos de cuantificación indirectos, que se basan en la cuantificación del contenido total de proteína o proteínas específicas. Aunque se usan ampliamente, estas técnicas no tienen en cuenta las diferencias de proteínas-por-EV, y no discriminan entre contaminantes agregados de proteínas y proteínas en los vehículos eléctricos. Además, estas técnicas requieren el aislamiento de los vehículos eléctricos, que en muchos casos hace que la comparación de las concentraciones de EV en muestras biológicas imposible.
Por lo tanto, se realizan esfuerzos para desarrollar nuevos métodos que permitan la medición EV más precisa y directa 10. Este informe describe el uso de los sensores de pulso resistiva sintonizable (TRP) para la cuantificación fiable y tamaño de perfiles de los vehículos eléctricos.
Actualmente, el qNano instrumento (Figura 1a) es la plataforma sólo está disponible comercialmente para TRPS. En TRPS, una membrana elástica no conductor puntuada wiª un poro de tamaño nanométrico se separa dos células del líquido. Una de las células del líquido se llena con la muestra de interés, mientras que la otra celda se llena con electrolito libre de partículas. Mediante la aplicación de una tensión, un flujo / corriente eléctrica iónica se establece, que se altera en la transferencia de las partículas a través del poro (Figura 1b). La magnitud de este bloqueo actual ('pulso resistiva') es proporcional al volumen de la partícula 11 (Figura 1c). La duración del bloqueo se puede utilizar para evaluar el potencial zeta de las partículas, que se basa en características de las partículas tales como la carga o la forma 12. Tamaño de perfiles de partículas desconocidas puede llevar a cabo mediante la comparación de los impulsos resistivas causadas por las partículas desconocidas con los pulsos resistivas causadas por las partículas de calibración con un diámetro conocido. Además de la magnitud de un evento de bloqueo, se mide la tasa de los que éstos se producen. Esta tasa de recuento reliES en la concentración de partículas. Dado que la concentración y la tasa de bloqueos son linealmente proporcional 13, usando una sola muestra de calibración con una concentración conocida de partículas y tamaño de partícula permite la medición de la concentración y distribución de tamaño 14 11 de una muestra desconocida.
El movimiento de las partículas a través de la nanopore se determina por electro kinetic- fuerzas electroforéticas (y electro-osmótica) y de fluidos 15. Al utilizar el módulo de presión variable (VPM) una diferencia de presión entre las cámaras de fluido puede ser inducida como una fuerza adicional. La aplicación de presión positiva aumenta la velocidad de flujo de partículas, que pueden ser de beneficio cuando la concentración de partículas es baja. También, la presión se puede aplicar para reducir el efecto de las fuerzas electro-cinética. Esto es especialmente importante cuando se utiliza nanoporos con un pequeño diámetro de poro relativo (NP100, NP150 y NP200 posiblemente) que se utiliza a menudo como para la detección de los vehículos eléctricos.Para estos nanoporos, incluso cuando se aplica una presión significativa, las fuerzas electro-cinética pueden, dependiendo de la carga superficial de las partículas, siendo no despreciable 16. Mediante la medición de la tasa de partícula en múltiples presiones, un electro cinéticamente corregido, y por lo tanto más precisa, la concentración EV se puede calcular.
Aquí, protocolos detallados se proporcionan para determinar la distribución del tamaño y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de funcionamiento regular, un enfoque alternativo se describe que las muestras están sobrecargadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración 17. Esta técnica de calibración en tiempo real se puede utilizar para superar algunos de los desafíos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en fluidos biológicos, tales como orina, plasma y sobrenadante de cultivo celular, o cuando la estabilidad de la nanoporos durante un largo período de tiempo de medición no puede ser asegurado.
Los protocolos descritos en este manuscrito metodologías de oferta para la cuantificación y caracterización de tamaño de los vehículos eléctricos utilizando TRPS. Las principales ventajas de la plataforma TRPS son el pequeño tamaño de la muestra, duración relativa de medición corto y la ausencia de manipulación de la muestra requerida.
Requisito previo para la medición precisa TRPS es mantener condiciones idénticas entre las mediciones de calibración y muestras. Esto incluye el uso de topes idénticos, así como la configuración del instrumento idénticos, como el tamaño de nanoporos, la tensión y la presión aplicada. El VPM original, carece de un mecanismo para el ajuste exacto de la presión aplicada, causando con ello diferencias menores en la presión aplicada entre las muestras. También, la evaporación del fluido de cebado en el VPM puede inducir diferencias de presión de menor importancia cuando se mide en diferentes puntos de tiempo y el VPM tanto, a menudo debe ser re-cebado. Estas limitaciones potencialmente han sido resueltos por la introducción de la VPM2, quetiene una escala basada en clic y se basa presión de aire.
El protocolo alternativo descrito en este manuscrito es especialmente adecuado para la medición de los vehículos eléctricos en muestras biológicas purificadas no 17. Creemos que los componentes del tampón, tales como azúcares, lípidos, proteínas y otros residuos más grandes, puede en algunos casos influyen en las condiciones de medición demasiado para el protocolo estándar para ser aplicables. La adición de bolas de calibración de la muestra en lugar de comparar dos mediciones separadas introduce 'calibración en tiempo real'. Este método es especialmente adecuado cuando la comparación de muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo de diferentes donantes) que tienen diferentes y / o desconocidos contenidos fluídicos fondo. Aunque existen diferencias entre los vehículos eléctricos y las partículas de poliestireno (por ejemplo, la densidad de las partículas y la carga superficial), modelos teóricos, así como los datos experimentales de relieve la capacidad de uso de perlas de poliestireno para la cuantificación y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos,bajo la condición previa de que se aplica una presión significativa 15,19. Para minimizar la influencia de las fuerzas electrocinéticas, se recomienda el uso de la relativamente mayor NP150 / NP200 nanoporos y la presión positiva significativa.
EVs y bolas de calibración se distinguen por el tamaño. En consecuencia, el nanoporo tiene que ser abierto mediante la aplicación de estiramiento, a un diámetro donde se observa la detección de ambos vehículos eléctricos y las partículas más grandes de calibración. Desde la apertura del poro disminuirá la sensibilidad hacia partículas más pequeñas, sólo EVS más grande que un cierto tamaño se registran (a menudo EVs> 120 nm cuando se utiliza un cordón de calibración 335 nm). El límite de detección mínimo para los vehículos eléctricos se puede reducir a aproximadamente 90 nm, con 203 bolas de calibración nm en un nanoporo NP150. Sin embargo, esta configuración puede ser inviable cuando los vehículos eléctricos más grandes inducen obstrucción frecuente de la nanopore. La presencia de estos vehículos eléctricos que obstruyen puede forzar la utilización de una configuración en la que una población de EVs, demasiado pequeño para reaCH El umbral de detección, no será detectado.
La dificultad para operar el sistema aumenta cuando se trata de medir las partículas menores de 100 nm de tamaño. En tales casos, la detección puede mejorarse aumentando la concentración de sal del electrolito. Un aumento de la concentración de iones inducirá aumenta relativamente magnitudes de bloqueo para partículas pequeñas (mayor relación señal a ruido). La viabilidad de esta técnica para la medición de los vehículos eléctricos tiene que ser validado, aunque, como el aumento de las concentraciones de sal pueden influir en el volumen de los vehículos eléctricos.
En conclusión, la plataforma TRPS puede ser utilizado para la cuantificación directa y caracterización tamaño de los vehículos eléctricos. Dado que no se requiere aislamiento o manipulación EV (anticuerpo etiquetado de unión o fluorescente), la plataforma es adecuado para la cuantificación directa EV en fluidos biológicos. Un protocolo alternativo se prevé que puede ser beneficiosa para muestras en las que los componentes del tampón inducen significativa cloggin de porog eventos, por lo que la utilización fiable de el protocolo estándar inviable.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |