Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.
'Microvesicles' ve 'eksozomlann' dahil Ekstrasellüler veziküller (AGH), vücut sıvıları oldukça bol. Yeni yıl AGH ilgi büyük bir artış tanık olduk. EVs koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser de dahil olmak üzere, çeşitli fizyolojik ve patolojik işlemlere, önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, AGH ilaç verme araçları olarak, örneğin bir ilaç olarak ya da rejeneratif, terapötik maddeler olarak potansiyele sahiptir. Çünkü kendi küçük boyutu (50 1,000 nm) doğru ölçümü ve AGH boyutu profil teknik açıdan zor.
Bu protokol qNano sistemi kullanılarak nasıl ayarlanabilir darbe dirençli algılama (tRPS) teknolojisini tarif EVs konsantrasyon ve boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Nano ölçekli gözenek yoluyla transfer üzerine EVs saptanmasında kullanılır göre yöntem, nispeten hızlı bir küçük örnek hacimlerinin kullanılması yeterli ve pur gerektirmezification ve EVs konsantrasyonu. Alternatif bir yaklaşım kullanılarak açıklanmıştır normal çalışma protokolü aşağıdaki numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon polistiren boncuklar ile tutturuldu. Biyolojik akışkanlarda ölçümü sırasında doğrudan EV'lerini bir ayarlama tekniği teknik engellerin üstesinden gelmek için kullanılabilir Bu gerçek zamanlı karşılaştı.
Hücresel kökenli kesecikler vücut sıvılarında 1 oldukça bol. Bu sözde-dışı vezikülleri (EVS) (50 – 1000 nm boyutunda) hücre membranı ile çoklu vesiküler organların ikisi füzyonu veya hücre zarının doğrudan dışarı tomurcuklanma ile oluşturulmaktadır. Son yıllarda, AGH'ye bilimsel ilgi çok yeni fonksiyonlar ve EVs özellikleri tarif edilmektedir, ki 1 EV odaklı yayınların bir bolluk ile sonuçlanan, artmıştır. AGH artık, sinyal iletimi, bağışıklık düzenlemesi, ve kan pıhtılaşmasının 1-4 gibi fizyolojik ve patalojik sürece, geniş bir dizi dahil olmak inanılmaktadır. Kanserde, AGH premetastatik niş 5,6, anjiyojenez 8 ön-kanserli içerik 7,8 transferini ve uyarım oluşumunda rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra, AGH terapötik ajanların 9 teslimi ajanlar olarak incelenmiştir.
Bu de rağmenyadaki gelişmeler, EVs güvenilir ölçümü zor kalır. Geleneksel olarak, dolaylı ölçüm yöntemleri toplam protein içeriğinin veya spesifik protein miktarının dayananlar kullanılır. Geniş kullanılmasına rağmen, bu teknikler protein başına EV farklar için hesap yoktur, ve AGH protein agrega ve proteinleri kirletici arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu teknikler çoğu durumda biyolojik numunelerde EV konsantrasyonlarının karşılaştırması yapmak imkansız hale EVs izolasyonunu gerektirir.
Bu nedenle, çabaları daha hassas ve doğrudan EV ölçümü için 10 yapılabildiği yeni yöntemler geliştirmek için yapılmaktadır. Bu rapor, güvenilir ölçümü ve AGH boyutu profil için ayarlanabilir rezistif darbe algılama (tRPS) kullanımını açıklar.
Şu anda, qNano alet (Şekil 1a) tRPS için piyasada bulunan tek bir platformdur. TRPS olarak, iletken olmayan bir elastik zar wi noktalamanano-boyutlu bir gözenek inci iki akışkan hücrelerini ayıran. Diğer hücre partikülsüz elektrolit ile doldurulur ise sıvı hücrelerinden biri, söz konusu numunesi ile dikkatle doldurulmuştur. Bir voltaj uygulanarak, bir iyonik akış / elektrik akımı gözenekten partiküllerinin transferi üzerine değiştirilmiş olan (Şekil 1b) kurulur. Bu akım blokajının ('dirençli darbe') büyüklüğü parçacık 11 (Şekil 1c) hacmi ile doğru orantılıdır. Blokajı süresi örneğin yük ya da 12 gibi şekil parçacık özellikleri üzerine dayanır partiküllerinin zeta-potansiyelini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bilinmeyen parçacık büyüklüğü profil bilinen bir çapa sahip taneciklerin kalibrasyon kaynaklanan direnç darbelerle hasardan kaynaklanan darbeleri dirençli karşılaştırılmasıyla yapılabilir. Blokajın olayın büyüklüğü yanı sıra, bu ortaya çıktığı oranı ölçülür. Bu sayım oran dinleriparçacık konsantrasyonuna es. Konsantrasyon ve ablukaya oranı bilinen konsantrasyon ve tanecik büyüklüğü ile tek bir kalibrasyon numune kullanılarak doğrusal olarak orantılı olduğu için 13 konsantrasyon 14 ve bilinmeyen bir numune boyutu dağılımının 11 ölçülmesini sağlar.
Nano-gözeneklere parçacıklarının hareketi elektro kinetik (elektroforetik ve elektro-ozmotik) ve akışkan kuvvetlerinin 15 tarafından belirlenir. Değişken basınç modülü (VPM) akışkan hücreler arasında bir basınç farkı kullanılarak ek bir kuvvet olarak indüklenebilir. Pozitif bir basınç uygulanması, parçacık konsantrasyon düşük olduğunda yararlı olabilir parçacıkların akış hızını artırır. Ayrıca, basınç elektro kinetik güçlerin etkisini azaltmak için uygulanabilir. Göreceli küçük bir gözenek çapına sahip olan nano-gözeneklerde kullanıldığında bu özellikle önemlidir (NP100 muhtemelen NP150 ve NP200) sıklıkta EVs tespiti için kullanılır.Bu nano-gözeneklerde için, önemli bir basınç uygulanması bile, elektro kinetik kuvvetler, partikül yüzey yüküne bağlı olarak, 16 nonnegligible kalabilir. Birden fazla basınçlarda parçacık hızını ölçerek, bir elektro kinetik düzeltilmiş, ve böylece daha hassas EV konsantrasyonu hesaplanabilir.
Burada ayrıntılı protokolleri, EVs boyut dağılımına ve konsantrasyonunu tespit etmek için temin edilmiştir. Numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon 17 polistiren boncuklar ile tutturuldu yerlerde normal çalışma protokolü yanında, alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bu gerçek-zamanlı bir ayarlama tekniği, idrar, plazma ve hücre kültürü üstte kalan sıvı ya da biyolojik sıvılarda, doğrudan EV'lerini ölçümü sırasında teknik sorunlardan bazılarını karşılaşılan üstesinden gelmek için kullanılabilir ölçüm uzun bir süre boyunca nano-gözeneklere stabilitesi olamaz zaman sağlanmalıdır.
Miktar ve tRPS kullanarak EVs boyutu karakterizasyonu için bu el yazması teklif metodolojileri tarif protokolleri. TRPS platformunun önemli avantajları küçük örneklem büyüklüğü, göreceli kısa ölçüm süresi ve gerekli numune manipülasyon yokluğu vardır.
Doğru tRPS ölçümü için önkoşuldur kalibrasyon ve numune ölçümleri arasındaki özdeş koşullar tutmaktır. Bu, aynı tampon kullanımının yanı sıra küçük gözenek büyüklüğü, gerilim ve uygulanan basınç gibi aynı cihaz ayarlarını kapsamaktadır. Orijinal VPM bu şekilde, örnekler arasında uygulanan basınç arasındaki farklılıklar küçüktür neden uygulanan basıncın tam ayarı için bir mekanizmayı barındırmamaktadır. Farklı zaman noktalarında ölçülmesi Ayrıca, VPM hazırlama sıvısı içinde buharlaştırılması, küçük basınç farklılıkları neden olabilir ve bu nedenle sık sık yeniden VPM ile prime edilmiş olmalıdır. Bu kısıtlamalar, potansiyel olarak VPM2, zerk edilmesi ile çözülmüştür hangiBir tıklama bazlı ölçeğe sahip ve hava basıncı dayanır.
Bu yazıda tarif edilen alternatif protokol olmayan saflaştınlmış biyolojik numuneler 17 EVs ölçümü için uygundur. Bu şekerler, lipidler, proteinler ve bazı durumlarda, diğer daha büyük parçalardan tampon bileşenleri, geçerli olmak üzere standart bir protokol için çok fazla ölçüm koşulları etkileyebilecek inanıyoruz. Numunenin iki ayn yapı yerine değerlerle karşılaştırılarak kalibrasyon boncuklarının ilavesinin, "gerçek zamanlı kalibrasyon 'getirmektedir. Farklı ve / veya bilinmeyen bir akışkan arka plan içeriğini numuneler (örneğin, farklı vericilerden kan plazması) karşılaştırırken Bu yöntem özellikle uygundur. Farklılıklar AGH ve polistiren parçacıkların (örneğin, parçacık yoğunluğu ve yüzey yükü), teorik modellerin yanı sıra deneysel veriler arasındaki mevcut olmasına rağmen miktar ve AGH boyutu profil için polistiren boncuk kullanılabilirliğini altını,önkoşul altında olduğu önemli bir basınç 15,19 uygulanır. Elektrokinetik güçlerin etkisini en aza indirmek için, göreceli olarak daha yüksek NP150 / nano-gözeneklere NP200 ve önemli bir basıncın kullanımı tavsiye edilir.
AGH ve kalibrasyon boncuk boyutuna göre ayırt edilir. Sonuç olarak, çok küçük gözenek EVS ve daha büyük partiküllerin kalibrasyon her ikisinin tespit gözlenen bir çapa, gerilme uygulayarak açılmalıdır. Gözenek açılması küçük parçacıklara karşı hassasiyetini azaltacaktır yana, yalnızca kaydedilir belirli bir boyutta (genellikle AGH> 120 nm bir 335 nm kalibrasyon boncuk kullanılarak) daha büyük EVS. EVs için en düşük saptama sınırı bir NP150 nano-gözeneklere 203 nm kalibrasyon boncuklar kullanılarak, yaklaşık 90 nm'ye düşürülebilir. Büyük AGH nanopore sık sık tıkanma neden Ancak, bu kurulum geçerli olmayabilir. Bu engellemekten EVs varlığı kurulum kullanımını zorlamaktır nerede rea çok küçük AGH bir nüfus,bulgulama eşiğine ch, tespit edilemez.
Boyutu 100 nm daha küçük partikülleri ölçmek için çalışırken zorluk sistemi artar çalıştırmak için. Bu gibi durumlarda, belirleme elektrolit tuz konsantrasyonunun arttırılması yoluyla iyileştirilebilir. Artan iyon konsantrasyonu küçük parçacıklar için nispeten artmış abluka büyüklüklerini (büyük sinyal-gürültü oranı) neden olacaktır. EVs ölçümleri için bu tekniğin yaşayabilirliği yüksek tuz konsantrasyonları EVs hacmini etkileyebilir gibi olsa da güncellenmelidir.
Sonuç olarak, bir platform tRPS doğrudan miktar ve EVs büyüklük bakımından kullanılabilir. Herhangi bir izolasyon veya EV manipülasyon (antikor bağlama veya floresan etiketleme) gerekli olduğundan, platform, biyolojik sıvılar içinde, doğrudan EV ölçümü için uygundur. Alternatif bir protokol bellek bileşenleri önemli ölçüde gözenek cloggin neden burada numuneler için yararlı olabilir sağlanmıştırişlersiz standart protokol güvenilir kullanımını sağlayarak g olaylar.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |