Implantation af ringere Vena Cava indskydning Graft i musemodel
Summary
For at forbedre vores viden for Cellulær og Molekylær neotissue dannelse blev en musemodel af TEVG nylig udviklet. De transplantater blev implanteret som infrarenale vena cava indskydning grafts i C57BL / 6 mus. Denne model opnår lignende resultater til dem, der opnås i vores kliniske undersøgelser, men over en langt kortere tid-kursus.
Abstract
Bionedbrydelige stilladser podet med knoglemarv mononukleære celler (BMC'er) anvendes ofte til rekonstruktiv kirurgi til behandling af medfødte hjerte anomalier. De langsigtede kliniske resultater viste gode åbentstående kar, dog med betydelig forekomst af stenose. For at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer af vaskulær neotissue dannelse og forhindre stenose udvikling manipuleret væv vaskulære transplantater (TEVGs) udviklede vi en musemodel af transplantatet med ca 1 mm indre diameter. Først blev TEVGs samles fra bionedbrydelige rørformede stilladser fremstillet ud fra et polyglycolsyre-vævet filt mesh belagt med ε-caprolacton og L-lactid-copolymer. De stilladser blev derefter anbragt i en frysetørrer, støvsuges i 24 timer og opbevares i en ekssikkator, indtil cellepodning. For det andet blev knoglemarv opsamlet fra donormus og mononukleære celler blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering. For det tredje var cirka en million cellerpodet på et stillads og inkuberet O / N. Endelig blev de podede stilladser implanteres derefter som infrarenale vena cava indskydning grafts i C57BL / 6 mus. De implanterede grafts demonstreret fremragende passage (> 90%) uden tegn på tromboemboliske komplikationer eller aneurismal formation. Denne musemodel vil hjælpe os med at forstå og kvantificere de cellulære og molekylære mekanismer i neotissue dannelse i TEVG.
Introduction
Medfødte hjertefejl er alvorlige forhold, der påvirker næsten 8% af levendefødte i USA. Ca. 25% af disse spædbørn med medfødte hjertefejl eller 2,4 per 1.000 levendefødte, kræve invasiv behandling i det første år af deres liv 1. Den mest effektive behandling for medfødt hjertesygdom er rekonstruktionskirurgi. Desværre, komplikationer som følge af brugen af for tiden tilgængelige vaskulære kanaler er den væsentligste årsag til postoperative sygelighed og dødelighed.
For at løse dette problem, har vi udviklet de første manipuleret væv karimplantater (TEVGs) til klinisk brug 2. TEVGs blev bygget af biologisk nedbrydelige polyesterrør tilsået med autolog knoglemarv afledt-mononukleære celler (BM-MNCs) og implanteret som venøse kanaler for medfødt hjerteoperation. Resultaterne viste fremragende åbentstående kar på 1-3 års follow-up, men med en betydelig forekomst af stenose <sop> 3,4. Det var klart, at en bedre forståelse af vaskulær neotissue dannelse og den mekanisme bag udviklingen af TEVG stenose var nødvendigt. For bedre at forstå udviklingen af TEVGs og mekanismen af stenose udvikling blev en fåre-model skabt 5,6. I denne model er de TEVGs succes omdannet til levende fartøjer og var ens i både morfologi og funktion af native vener. Denne brug af en stor dyremodel var et godt første skridt i at yde vigtige prækliniske oplysninger, hjulpet klinisk brug af TEVGs. Dog er fuld forståelse for de cellulære og molekylære mekanismer i vaskulær neotissue dannelse i TEVGs anvender store dyremodeller begrænset på grund af begrænsninger i molekylær karakterisering af vaskulære cellefænotyper på grund af manglende artsspecifikke molekylære værktøjer. For at overvinde disse mangler blev en musemodel af TEVGs udviklet på grund af den hurtige avancement i muse genetik og deres omfattende molecular karakterisering med den ekstra fordel af en kortere tidshorisont.
Den murine IVC indskydning model trofast gentaget processen neovessel dannelse, der forekommer i store dyr og mennesker, men over en meget kortere tidsforløb 6-9. Her en detaljeret protokol for små graft produktion ved hjælp af biologisk nedbrydelige stilladser blev BM-MNC høst og isolation, BM-MNC såning på stillads, og graft implantation i en musemodel beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den musemodel af TEVG er et værdifuldt redskab til at studere cellulære og molekylære mekanismer af neotissue dannelse og udvikling af stenose. Den podede BM-MNC blev vist i både histologiske og SEM billeder af de podede celler på transplantatet 11. Cellepodning effektivitet blev også vist under anvendelse af en DNA-analyse 7. Ved hjælp af dette modelsystem viste vi, at cellepodning reducerer forekomsten af udviklingen TEVG stenose, som var den primære form for svigt i vores humane kliniske…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra NIH (RO1 HL098228) til CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| ɛ-caprolactone and L- lactide copolymer P(LA/CL) |
Gunze Inc. | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24 well plate | Corning | 3526 | |
| 15cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | gibco | 14190-144 | |
| Littauer Bone Cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
- Heart Association, A. m. e. r. i. c. a. n. Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin’oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
