Implantation de veine cave inférieure interposition de greffe en modèle de souris
Summary
Pour améliorer notre connaissance de la formation néo-tissu cellulaire et moléculaire, un modèle murin de la TEVG a été récemment mis au point. Les greffons ont été implantés en sous-rénaux des greffes de la veine cave d'interposition de souris C57BL / 6. Ce modèle permet d'obtenir des résultats similaires à ceux obtenus dans notre étude clinique, mais sur un temps bien sûr beaucoup plus courte.
Abstract
Échafaudages biodégradables ensemencées avec des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BMC) sont souvent utilisés pour la chirurgie reconstructive pour traiter les anomalies cardiaques congénitales. Les résultats cliniques à long terme ont montré d'excellents taux de perméabilité, cependant, avec une incidence significative de la sténose. Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu vasculaire et de prévenir le développement de la sténose dans l'ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs), nous avons développé un modèle de souris de la greffe d'environ 1 mm de diamètre intérieur. Tout d'abord, les TEVGs ont été assemblés à partir d'échafaudages tubulaires biodégradables fabriqués à partir d'un non-tissé d'acide glycolique sentir maille enduit de copolymère ε-caprolactone et L-lactide. Les échafaudages ont ensuite été placés dans un lyophilisateur, l'aspirateur pendant 24 heures, et stockés dans un dessiccateur jusqu'à ce que l'ensemencement des cellules. Deuxièmement, la moelle osseuse a été recueillie à partir de souris donneuses et des cellules mononucléées ont été isolées par centrifugation en gradient de densité. Troisièmement, environ un million de cellules ont étéensemencées sur un échafaudage et incubées O / N. Enfin, les échafaudages graines ont ensuite été implantés en sous-rénaux greffes veine cave d'interposition dans C57BL / 6. Les greffons implantés démontré une excellente perméabilité (> 90%) sans preuve de complications thrombo-emboliques ou la formation d'anévrisme. Ce modèle murin nous aidera à comprendre et quantifier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu dans le TEVG.
Introduction
Les malformations cardiaques congénitales sont des affections graves qui touchent près de 8% des naissances vivantes aux États-Unis. Environ 25% de ces enfants atteints de malformations cardiaques congénitales ou 2,4 pour 1 000 naissances vivantes, nécessitent un traitement invasif dans la première année de leur vie 1. Le traitement le plus efficace pour une maladie cardiaque congénitale est la chirurgie reconstructive. Malheureusement, les complications résultant de l'utilisation de conduits vasculaires actuellement disponibles sont la cause la plus importante de la morbidité et de la mortalité post-opératoire.
Pour résoudre ce problème, nous avons développé les premiers ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs) pour une utilisation clinique 2. TEVGs ont été construits à partir de tubes de polyester biodégradables ensemencées avec des cellules dérivées de l'mononucléaires autologues de moelle osseuse (BM-MNC) et implantés comme des conduits veineux en chirurgie cardiaque congénitale. Les résultats ont montré d'excellents taux de perméabilité à 1-3 ans de suivi, mais avec une incidence significative de la sténose <sjusqu'à> 3,4. Il était clair qu'une meilleure compréhension de la formation de néo-tissu vasculaire et le mécanisme sous-jacent au développement de TEVG sténose était nécessaire. Afin de mieux comprendre le développement de TEVGs et le mécanisme de développement d'une sténose, un modèle ovin a été créé 5,6. Dans ce modèle, les TEVGs transformées avec succès dans les vaisseaux vivants et étaient similaires dans les deux morphologie et la fonction des veines indigènes. Cette utilisation d'un modèle de grand animal était une première étape importante dans la fourniture de l'information pré-clinique qui a facilité l'utilisation clinique de TEVGs. Cependant, la pleine compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu vasculaire dans TEVGs utilisant de grandes modèles animaux est limitée en raison des limitations dans la caractérisation moléculaire des phénotypes cellulaires vasculaires dues au manque d'espèces outils moléculaires spécifiques. Pour combler ces lacunes, un modèle murin de TEVGs a été développé en raison de l'avancement rapide de la génétique de la souris et leur vaste molecular caractérisation avec l'avantage supplémentaire d'une échelle de temps plus courte.
Le murin IVC modèle d'interposition fidèlement récapitulé le processus de néovaisseaux formation qui se produit dans les grands animaux et les humains, mais sur un parcours de temps beaucoup plus court 6-9. Ici, un protocole détaillé pour la fabrication de la greffe à petite échelle en utilisant des échafaudages biodégradables, BM-MNC récolte et l'isolement, BM-MNC semis sur l'échafaudage, et implantation du greffon dans un modèle murin ont été décrits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de souris de TEVG est un outil précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu et le développement de la sténose. La tête de série BM-MNC a été montré dans les deux images histologiques et SEM des cellules ensemencées sur la greffe 11. Efficacité cellule de semis a également été démontré en utilisant un test d'ADN 7. L'utilisation de ce système modèle, nous avons montré que l'ensemencement de cellules réduit l&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention du NIH (RO1 HL098228) de CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyglycolic acid (PGA) felt | Biomedical Structures | Custome ordered | |
| ɛ-caprolactone and L- lactide copolymer P(LA/CL) |
Gunze Inc. | Custome ordered | |
| Pipet tip, 0.1-10 μl | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI medium 1604 | gibco | 11875-093 | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| 24 well plate | Corning | 3526 | |
| 15cc tube | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Also called 'Histopaque' |
| DPBS | gibco | 14190-144 | |
| Littauer Bone Cutter 4.5" Straight | Roboz | RS-8480 | For BM harvesting |
| Forceps 4.5" | Roboz | RS-8120 | For BM harvesting |
| Scissors 4.5" | Roboz | RS-5912 | For BM harvesting |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 |
References
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