Implantasjon av vena cava inferior inter Graft i Mouse Model

Summary

For å forbedre vår kunnskap om cellulær og molekylær neotissue formasjon, ble en murine modell av TEVG nylig utviklet. Grafts ble implantert som infrarenale vena cava inter grafts i C57BL / 6 mus. Denne modellen oppnår lignende resultater til de som ble oppnådd i vår kliniske undersøkelser, men over en langt kortere tid-kurset.

Abstract

Biologisk nedbrytbart stillas seeded med benmarg mononukleære celler (BMCs) brukes ofte for rekonstruktiv kirurgi for å behandle hjerte anomalier medfødte. De langsiktige kliniske resultatene viste gode patency priser, men med betydelig forekomst av stenose. For å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer av vaskulær neotissue dannelse og hindre stenose utvikling i vev konstruert vaskulære graft (TEVGs), utviklet vi en mus modell av pode med ca 1 mm indre diameter. Først ble TEVGs sammen av bionedbrytbare rørformede stillasene fabrikkert fra en polyglykolsyre nonwoven følte mesh belagt med ε-kaprolakton og L-laktid-kopolymer. Stillasene ble deretter plassert i en fryse-, støvsugd for 24 timer, og lagres i en eksikkator til celle seeding. For det andre, benmarg ble oppsamlet fra donor-mus, og mononukleære celler ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering. Tredje, rundt én million celler varsådd på et stillas og ruges O / N. Til slutt ble de seeded stillasene deretter implantert som infrarenale vena cava inter grafts i C57BL / 6 mus. De implanterte grafts oppviste utmerket åpenhet (> 90%) uten tegn på tromboemboliske komplikasjoner eller aneurysmal formasjonen. Dette murine modellen vil hjelpe oss til å forstå og kvantifisere de cellulære og molekylære mekanismer for neotissue formasjonen i TEVG.

Introduction

Medfødte hjertefeil er alvorlige forhold som påvirker nesten 8% av levendefødte i USA. Omtrent 25% av disse barn med medfødte hjertefeil eller 2,4 per 1 000 levendefødte, krever invasiv behandling i det første året av sitt liv ^en. Den mest effektive behandlingen for medfødt hjertesykdom er rekonstruktiv kirurgi. Dessverre, komplikasjoner som oppstår ved bruk av tilgjengelige vaskulære kanaler er den viktigste årsaken til postoperativ morbiditet og mortalitet.

For å løse dette problemet, har vi utviklet de første vev konstruert vaskulære graft (TEVGs) for klinisk bruk ^to. TEVGs ble konstruert av biologisk nedbrytbare polyester rør seeded med autolog benmarg avledet-mononukleære celler (BM-MNCs) og implantert som venøse kanaler for medfødt hjertekirurgi. Resultatene viste gode patency priser på 1-3 år med oppfølging, men med betydelig forekomst av stenose <sopp> 3,4. Det var klart at en bedre forståelse av vaskulær neotissue dannelse og mekanismen som ligger bak utvikling av TEVG stenose var nødvendig. For bedre å forstå utviklingen av TEVGs og mekanismen for stenosis utvikling, ble det ovine modell opprettet ^5,6. I denne modellen, de TEVGs hell forvandlet til levende fartøy og var lik i både morfologi og funksjon av innfødte årer. Denne bruken av et stort dyr modellen var et godt første skritt i å gi viktig pre-klinisk informasjon som hjulpet klinisk bruk av TEVGs. Men full forståelse av de cellulære og molekylære mekanismer av vaskulær neotissue formasjonen i TEVGs bruker store dyremodeller begrenset på grunn av begrensninger i molekylær karakterisering av vaskulær celle fenotyper grunn av manglende artsspesifikke molekylære verktøy. For å overvinne disse svakhetene, ble en murine modell av TEVGs utviklet på grunn av den raske utviklingen i muse genetikk og deres omfattende molekylr karakterisering med den ekstra fordelen av en forkortet tidsskala.

Den murine modellen IVC inter trofast rekapitulert prosessen neovessel formasjon som forekommer i store dyr og mennesker, men i løpet av en mye kortere tid selvfølgelig ^6-9. Her, en detaljert protokoll for småskala pode produksjon ved hjelp av biologisk nedbrytbare stillaser, BM-MNC høsting og isolasjon, BM-MNC seeding på stillaset, og pode implantasjon i en murine modell ble beskrevet.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Nationwide Children Hospital Institutional Animal Care og bruk komité. En. Graft Manufacturing Gjør ε-kaprolakton og L-laktid-kopolymer P (LA / CL)-løsning ved å tilsette 100 mg P (LA / CL) i 2 ml dioksan under en avtrekkshette. Plasser løsning på en vortex og blandes kontinuerlig i 1-1,5 timer for å oppløses fullstendig. I mellomtiden, ta et ark med polyglykolsyre (PGA) følte fra fryseren og kutte ut flere 5 x 8 mm sek…

Representative Results

En skjematisk av TEVG implantasjon er vist i figur 1.. Benmarg ble høstet fra en donor mus og mono-nukleære celler ble isolert ved anvendelse av tetthetssentrifugering og deretter utsådd på en biologisk nedbrytbar stillaset. Seeded stillasene ble inkubert O / N og implantert til en mottaker mus som en mindreverdig vena cava inter pode. Fig. 2 viser scanning elektronmikroskopi av PGA-P (CL / LA) stillaset. Den indre diameter var ca 1 mm og veggtykkelsen v…

Discussion

Denne musemodell av TEVG er et verdifullt verktøy for å studere cellulære og molekylære mekanismer for neotissue dannelse og utvikling av stenosis. Seeded BM-MNC ble vist i både histologiske og SEM bilder av de seedede celler på pode ^11. Cell seeding effektivitet ble også vist ved hjelp av en DNA-assay ^7.. Ved hjelp av denne modellen systemet vi viste at celle seeding reduserer forekomsten av utviklingen av TEVG stenose, som var den primære modus for svikt i vår kliniske studie ^tre.</…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
ɛ-caprolactone and L- lactide copolymer P(LA/CL)	Gunze Inc.		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24 well plate	Corning	3526
15cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	gibco	14190-144
Littauer Bone Cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 – Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25G 1 in., Needle	BD	305125
30G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500