High-throughput Billede Analyse af Tumor Spheroids: Et brugervenligt program til at måle størrelsen af ​​Spheroids automatisk og præcist

Summary

Vi præsenterer en high-throughput billede analyse software program til at måle størrelsen af ​​tredimensionale tumor spheroids filmede med lys-felt mikroskopi. Denne applikation giver en hurtig og effektiv måde at undersøge virkningerne af terapeutiske lægemidler på spheroids, hvilket er til gavn for forskere, der ønsker at bruge spheroids i narkotika skærme.

Abstract

Det stigende antal ansøgninger i tre-dimensionelle (3D) tumor spheroids som en in vitro model for lægemiddelforskning kræver deres tilpasning til store screening formater i alle trin i et lægemiddel skærm, herunder storstilet billedanalyse. I øjeblikket er der ingen klar-til-brug og gratis billede analyse software til at imødekomme denne store format. De fleste eksisterende metoder involverer manuel tegning af længde og bredde af de afbildede 3D spheroids, hvilket er en kedelig og tidskrævende proces. Denne undersøgelse præsenterer en high-throughput billede analyse software applikation - SpheroidSizer, som måler den større og mindre aksial længde af de afbildede 3D tumor spheroids automatisk og præcist; beregner mængden af ​​hver enkelt 3D-tumor klumpformet; derefter udlæser resultaterne i to forskellige former i regneark til nemme manipulationer i den efterfølgende analyse af data. Den største fordel ved denne software er dens magtfulde billedanalyse program, der ertilpasset til et stort antal billeder. Det giver high-throughput beregning og workflow kvalitetskontrol. Den anslåede tid til at behandle 1.000 billeder er omkring 15 min på en minimalt konfigureret laptop, eller omkring 1 min på en multi-core ydeevne arbejdsstation. Den grafiske brugergrænseflade (GUI) er også designet til nem kvalitetskontrol, og brugerne kan manuelt tilsidesætte computer resultater. Nøglen metode i denne software er tilpasset fra den aktive konturalgoritme, også kendt som slanger, som er specielt velegnet til billeder med ujævn belysning og støjende baggrund, der ofte plager automatiseret billeddannelse forarbejdning i high-throughput skærme. Den gratis "Manual Initialize" og "Hånd tegne" værktøjer giver fleksibilitet til at SpheroidSizer i beskæftiger sig med forskellige typer af spheroids og forskellige billeder af høj kvalitet. Denne high-throughput billede analyse software bemærkelsesværdigt reducerer arbejdskraft og fremskynder analyseprocessen. Gennemførelsen af ​​denne software er beneficial til 3D tumor sfæroiderne at blive en rutine in vitro model for narkotika skærme i industrien og den akademiske verden.

Introduction

Tre-dimensionel (3D) tumor spheroids er "kuglesymmetriske aggregater af tumorceller analoge til væv uden kunstigt substrat for cellebinding" ^1-3. Den cytologi og morfologi af tumor sfæroiderne bedre efterligner in vivo tumorvæv organisation og mikromiljøer end monolag todimensionale (2D) celler. 3D tumor spheroids er blevet en praktisk in vitro model for high-throughput screeninger af anti-cancer terapeutiske stoffer eller undersøge effekten af lægemiddelkandidater, før in vivo-dyr eller klinisk afprøvning ^4.. Klinisk er effekten af ​​enhver anti-cancer narkotika behandling evalueret baseret på reduceret tumor vækst. Analogt kan spheroid volumen bruges som et mål for effekten af in vitro-undersøgelser kræftbehandlingstargets. Klumpformet volumen (V = 0,5 * Længde * Bredde ²⁾ bestemmes på grundlag af større og mindre aksial længde (mere almindeligt kendt som længde og bredde)af sfæroider ^{6, 7.} De fleste forskere er nødt til manuelt at tegne længde og bredde på hver klumpformet, ofte ved hjælp af software, der tilbydes af mikroskopi virksomheder og sælges sammen med de billeddannende instrumenter. Denne teknik bliver problematisk, når high-throughput narkotika skærme, der udføres og mere end hundredvis af billeder er produceret. Nogle af de seneste undersøgelser rapporterede brug af open source billede analyse software værktøjskasser såsom CellProfiler ^8-10 og ImageJ ¹¹ at udvikle rudimentære segmentering rutiner / makroer, som er involveret illumination korrektion og enkel tærskling. Disse rutiner skal ofte være re-korrigeret for forskellige partier af billeder i henhold til belysning tilstand og billedets kontrast forandring; derfor kan disse softwarepakker ikke opfylder robusthed kravet i high-throughput billedanalyse. Friedrich og samarbejdspartnere (2009), der anvendes proprietær software til at måle klumpformet volumen semi-autommatisk ^5.. Beskrevet i Monazzam og hans kollegers papir ¹⁰ metode var en semi-automatiseret metode til at måle klumpformet størrelse kun for et lille antal billeder. Derfor eksisterer der et klart behov for solide, fleksible, automatiske og klar-til-brug billede analyseværktøjer til 3D-tumor sfæroiderne.

I denne undersøgelse beskriver vi SpheroidSizer - en MATLAB-baserede og open source-software program til at måle størrelsen af ​​tumor spheroids automatisk og præcist. SpheroidSizer er designet til at behandle mange forskellige partier af billeder af 3D spheroids i samme session. Udnytte den aktive konturalgoritme ^12-14, kan SpheroidSizer tolerere billedets kontrast forandring, håndfast ignorere gradvis ændring i baggrundsbelysning og genkende spheroids i billedet. Det kan også tåle mange sædvanlige artefakter, fx snavs, stammer fra prøven. Arbejdsgangen er designet, så brugerne kan udføre kvalitet control under eller efter beregning. Manuel overskrivning af analyseresultatet kan let foretages på stedet. Drage fordel af parallel computing værktøjskasse, kan analysen hastigheden yderligere styrket ved at koordinere flere computing kerner at arbejde på beregning samtidigt på en brugers computer. Desuden SpheroidSizer udgange resultaterne i to forskellige former at gøre det let samspil med downstream analyseværktøjer.

Protocol

1.. 3D tumor spheroids dannelse, narkotika behandlinger og billedsamling udføres som beskrevet i vores tidligere papir ^15.

2.. Softwareinstallation

1. Installer licenseret MATLAB software på den computer, der anvendes til billedanalyse. Følgende værktøjskasser fra Matlab er også forpligtet til at blive installeret - Signal Processing værktøjskasse, Image Processing værktøjskassen og Parallel Computing værktøjskasse * (* nødvendig for parallel computing tilstand).
   BEMÆRK: Mange universiteter købe og vedligeholde gruppens licenser, således at software er gratis at blive hentet og anvendes af tilknyttede forskere.
2. Installer SpheroidSizer program fra SpheroidSizer.zip fil (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. Gem zip-filen i dit lokale filsystem.
   2. Pak SpheroidSizer fil.
   3. Gem filerne i en udpeget bibliotek / mappe, som efterfølgende vil blive omtalt som than "Installation Directory".
      BEMÆRK: SpheroidSizer er blevet grundigt testet på en Windows 7-operativsystem. Det forventes at arbejde på alternative operativsystemer med minimale justeringer (ikke testet).

3.. Forberedelse af Billedanalyse af SpheroidSizer

1. Bestem billedet skala / opløsning af billeddannende system (absolut skala af billedet i mikron per pixel (mM / pix)).
   BEMÆRK: Hvis størrelsen af hver pixel på kameraet chip er kendt, kan billedet skala beregnes som objektiv forstørrelse x pixelstørrelse (mM / pix). Denne værdi kan fås fra imaging software er udstyret med mikroskopet som indlejrede metadata eller med hjælp fra imaging systemleverandøren. Denne værdi vil blive krævet i trin 4.6.
2. Konverter enhver proprietære filformater til de accepterede filformater - TIFF, JPEG og andre almindelige filformater.
3. Navngiv billedfiler og arrangere directories (figur 5A).
   BEMÆRK: Programmet er afhængig af korrekt layout af mappestruktur og filnavne omformatere resultaterne i plade format:
   1. Navngiv billedfiler i følgende format: [plade navn] _ [række] [kolonne] [udvidelse] eller [plade navn] [mellemrum] [række] [kolonne] [udvidelse]... [Række] følger i alfabetisk rækkefølge og [kolonne] følger den numeriske rækkefølge.
      BEMÆRK: Frit tilgængelig automatisk batch omdøbning software kan findes til at støtte brugere i dette trin.
   2. Arranger bibliotek / mappe baseret på forsøget på følgende måde: Hvert forsøg skal have en mappe. Under hvert eksperiment adressekartotek, bør der være undermapper for hvert tidspunkt. Under hvert tidspunkt undermappe, bør der være alle de billeder fra alle plader.
      BEMÆRK: For at de analyseresultater til optimalt sorteret i de formaterede resultater, foreslår vi at holde det samme antal cifre for hver id ved at udfylde 0'er på left, fx er tidspunkter navngivet som 000h, 072H og 144H.

4.. Image Analysis af Sfæroider af SpheroidSizer

1. Åbent MATLAB, derefter åbne "Command Window", type cd '[Installation Directory]' og tryk [RETURN].
2. Skriv "SpheroidSizer1_0" i "Command Window" og tryk på [RETURN] for at starte SpheroidSizer programmet.
3. Klik på "Gennemse" knappen i SpheroidSizer1.0 vinduet for at vælge eksperimentet mappe, der indeholder alle billederne.
4. Vælg "Medtag undermapper" toggle under "Folder" tekstfeltet for at behandle flere indlejrede billedmapper under den udpegede mappe.
   BEMÆRK: Hvis "Medtag undermapper" toggle ikke er valgt, er det kun de billeder, direkte under den mappe der behandles, og alle undermapper ignoreres.
5. Vælg "On-the-fly display" mulighed for at displægge hver segmenteret billede på toppen af ​​sin kildebilledet til kvalitetskontrol som beregningen udføres.
   BEMÆRK: Computation hastighed er hurtigere, hvis "On-the-fly display" ikke er valgt.
6. Angiv "Resolution" (billede skala / opløsning i mM / pix) af de analyserede billeder i kassen, for at programmet korrekt konvertere kugleformede målinger fra pixel til um.
   BEMÆRK: Alle billederne i den samme mappe eller analyseres sammen bør tages under samme mikroskop med samme formål, så billedet skala / opløsning forbliver konstant for hvert forsøg.
7. (Valgfri) brugere kan følge trin 5 for Avancerede brugerdefinerede indstillinger.
8. Klik på "Compute" for at starte beregningen.
   BEMÆRK: Softwaren udfører en automatisk filnavn kontrol før du fortsætter til beregning. Hvis en dialogboks dukker op angiver - "findes Fejl i filename", klik på "Afslut og vise fejlliste"og rette fejlene i børsnoterede filnavne (se trin 3.3). Klik derefter på "Compute" for at starte beregningen igen.
9. Klik på "Pause"-knappen for at holde pause i beregningen; og beregning kan genoptages ved at klikke på samme knap, der viser på "Fortsæt".
   BEMÆRK: "Resultater" viser "Folder", "File", "Volume" (i mm ³⁾ »Længde« (i mM), "Bredde" (i mM), og "gyldig" (afkrydsningsfeltet) for alle de analyserede sfæroider (figur 5C). Volumen er beregnet på grundlag af den målte storakse (længde) og lilleaksen (bredde) (V = 0,5 * Længde * Bredde ^2). "Gyldigt" afkrydsningsfelt er en mulighed for brugeren at vælge, om analyse af billedet er gyldig eller ugyldig efter kvalitetskontrol, se Trin 6.

5. Avancerede brugerdefinerede indstillinger

1. Klik på knappen "Avanceret" i SphereoidSizer1.0 vinduet for at opdrage den avancerede konfigurationer vinduet for at tilpasse brugerdefinerede indstillinger (figur 5B).
2. Indtast filnavne af interesse i "Format Output" og "List Output" bokse i avancerede konfigurationer vinduet under "Input".
3. Indtast et nummer fra "2-10" i "Reducer"-boksen. Dette er en koefficient for software til at reducere billedstørrelsen i beregningen for at forbedre beregningen hastighed. Jo større tallet er, jo hurtigere beregningen hastighed. Standarden "Reducer" er indstillet til 10.
4. Indtast til-være-behandlet billede filtypenavn i "Medtag type" kassen.
5. Indtast billede filtypenavne eller endelser, der ikke kommer til at blive behandlet af programmet i "Udelukke type" kasse som følger: "_crude.jpg".
6. Vælg "Ingen" for "Special Color" til at behandle 8 bit og 16 bit coleller billeder korrekt; vælg "12 bit" for "Special Color" til at behandle 12-bit farvebilleder ordentligt
7. Check "Brug Parallel Computing", hvis computeren bruges til billedanalyse er udstyret med flere CPU'er og / eller multi-core CPU'er. Hvis dette er sandt, så gå til trin 5.7.1; hvis ikke, så springe trin 5.7.1 og 5.7.2.
   BEMÆRK: En fejl vil opstå, hvis computeren bliver brugt ikke understøtter den valgte konfiguration.
   1. Check "Brug Parallel Computing" i Advanced-konfigurationer.
      BEMÆRK: Brug kun den parallel computing-tilstand, når 4 eller flere kerner er tilgængelige for computeren.
   2. Indtast et nummer 4-12 i "# Workers" (computing kerner) kassen.
      BEMÆRK: Dette tal skal være lig med eller mindre end antallet af computing kerner i brugerens computer. Et maksimum på 12 pålægger Matlab parallel computing værktøjskasse understøtter maksimalt 12 kerner. Når parallel computing væreING henrettet, en lille dialogboks vises beder brugeren om at vente til parallel beregning til slut; beregningen kan ikke sættes på pause, og heller ikke er "On-the-fly display"-funktionen bliver henrettet i parallel computing-tilstand.

6.. Kvalitetskontrol

1. Klik på den tilsvarende celle i "Resultater" for at bekræfte den præcise grænse kontur af en kugleformet i de analyserede billeder
   BEMÆRK: De originale og kvalitetskontrol billeder vil dukke op på højre side til gennemgang. Brugeren kan undersøge alle de billeder i rækkefølge ved hjælp af pil ned på tastaturet.
2. Forfine grænsen af ​​klumpformet på det valgte billede ved hjælp af følgende to værktøjer, hvis det er nødvendigt:
   1. Klik på "Manual Initialize" knappen for at vise det oprindelige billede. Klik derefter på og hold musen lige udenfor klumpformet og træk ellipseværktøjet at dække klumpformet på det originale billede.
      BEMÆRK: active-konturalgoritme initierer ved hjælp af bruger-indsendes kontur og eksekverer at konvergere på det ønskede klumpformet omrids. Den "Resultater" vil automatisk blive opdateret med de nye resultater. Den "Manual Initialize" værktøj giver brugeren mulighed for manuelt at give initialisering til aktiv-kontur.
   2. Klik på knappen "Hånd Draw" for at vise det oprindelige billede. Derefter bruge musen eller en touch aktiveret skærm til præcist at trække grænsen af ​​klumpformet.
      Bemærk: Denne skitse er direkte målt til at generere større og mindre akser, som opdateres i "Resultater". Den "Hånd Draw" værktøj bruges kun, når "Manuel Initialize" værktøj undlader at konvergere på den ønskede grænse af klumpformet.
3. Fjern markeringen i afkrydsningsfeltet "gyldigt" kolonnen i den tilsvarende række af "Resultater", når et billede ikke indeholder nogen gyldige klumpformet ved inspektion. En "; Ugyldig "label vises øverst venstre hjørne af den kvalitetskontrol image. Hvis "gyldig" er markeret, værdierne for alle målingerne er tom for klumpformet i de eksporterede formaterede og output resultaterne filer.
   BEMÆRK: Følgende tastaturgenveje er tilgængeligt til brug i "Result Table": "pil ned" for næste billede; "V" for gyldige / ugyldige; "M" for "Manuel Initialize" værktøj og "h" for "Hand Draw" værktøj.

7.. Lagring og eksport af data

1. Klik på "Export Study" knappen i SpheroidSizer1.0 vinduet for at eksportere den mellemliggende tilstand af analysen, hvis brugeren har brug for at afslutte softwaren før efterbehandling projektet. Angiv navn og biblioteket på den fil, der skal gemmes.
2. Klik på "Importer Study" knappen for at bringe tilbage den ovennævnte mellemliggende tilstand resultat fra "Export Study", og fortsætte med at arbejdk på det.
   BEMÆRK: De mellemliggende statslige filer er i en indfødt MATLAB format (mat.) Og er ikke direkte læses af andre programmer. En sikkerhedsfunktion indbygget i software gør automatisk eksport af den åbne projekt i tilfælde programmet afsluttes utilsigtet. Når det er nødvendigt, kan brugeren finde denne fil, hvis navn begynder med "~ tmp", som indeholder det tilsvarende tidsstempel i [Installation Directory].
3. Klik på "Formater Results" i SpheroidSizer1.0 vinduet for at gemme resultaterne.
   BEMÆRK: To former af resultaterne gemmes i eksperimentets bibliotek. De eksporterede filnavne kan konfigureres i Advanced-konfigurationer (se Protocol Trin 5.2). Formatet output-fil er en tab-afgrænset tabel, der organiserer lydstyrken værdi i den oprindelige plade format i størrelsesordenen et stigende plade nummer for hvert tidspunkt; og alle tidspunkter er organiseret i en stigende rækkefølge (figur 5D). Listen output fil er en tab-afgrænset tabel, der indeholder alle de målinger i form af ordnede lister (Figur 5e).

Representative Results

SpheroidSizer er designet til at producere automatiseret detektion, afgrænsning og måling af 3D spheroids, med bemærkelsesværdigt reduceret arbejdskraft og akut øget effektivitet for store mængder af billeder. Figur 1A viser arbejdsgangen for SpheroidSizer. De centrale beregnings skridt omfatter automatiseret initialisering, aktiv konturalgoritme og kontur kvantificering. Efter automatiseret beregning, den kvalitetskontrol funktion bruger en kombination af "Manual Initialize" og "Hånd tegne" værktøjer til at redde nogen ufuldkomne segmentering. 1B illustrerer den detaljerede automatiserede aktiv konturalgoritme. Det skridt initialisering (0. iteration) udnytter grundlæggende billedbehandling skridt til at generere omtrentlige størrelse og placering af klumpformet og generere en sfærisk indledning kontur med en anslået størrelse. Indledningen kontur feeds ind i den aktive konturalgoritme. Til gengæld er det gentager at justere efter det lokale billedegradient og form krumning. Den aktive konturalgoritme færdig når konturen stabiliserer (konvergerer), dvs 477 iterationer for dette billede, eller når foruddefineret maksimalt antal iterationer er udført. I dette eksempel er initialiseringen kontur bevidst udvidet til bedre fremvise algoritmen. I virkeligheden initialiseringen er normalt meget tæt på den faktiske grænse og der er behov langt færre gentagelser for algoritmen til at konvergere. Efterfølgende algoritmen tager morfometriske målinger af detekteret klumpformet grænse. De større og mindre akser klumpformet måles ved hjælp af Matlab billedbehandling værktøjskasse (figur 1C). Storaksen er defineret som den linje segment, som forbinder et enkelt par af de fjerneste punkter på konturen, som der henvises til længden (L). Lilleaksen er defineret som den længste linje vinkelret på hovedaksen, som der henvises til bredde (W). I dette tilfælde er værdien af ​​L og W er meget tæt, eftersomklumpformet er sfærisk. Mængden af sfæroidet beregnes som V = 0,5 * L * B ^2.

Et af kendetegnene ved SpheroidSizer er dens automatiseret detektering af grænsen for sfæroiderne selv på billeder med ujævn eller støjende baggrund udnytte den aktive konturalgoritme (figur 2B-D). Computational behandling af lyse felt billeder er ofte plaget af ujævn baggrund, der vildleder adaptive tærsklingsparametre-baserede metoder til at producere uønskede tærsklingsparametre resultater. Spørgsmålet er især tydeligt, når multi-brønds plader anvendes, og brøndenes vægge kan skabe skygge-effekter på billederne. Men fordi det aktive konturalgoritme er ikke følsom over for den gradvise skygge ændring i baggrunden, er det i stand til at identificere klumpformet segmentering i disse lyse felt billeder med korrekt initialisering. 2 viser et par eksempler på billeder med ujævn eller støjende baggrund, ligesom ujævn figur belysning (figur 2B (Figur 2C) eller nekrotisk kerne (Figur 2D). Med automatiseret aktiv konturalgoritme, SpheroidSizer afgrænser disse sfæroider nøjagtigt i alle disse billeder, som vist i den røde kontur på det nederste panel af hver figur.

Den kvalitetskontrol træk SpheroidSizer er nøglen til en high-throughput workflow. Den "Manual Initialize" og "Hand Draw" værktøjer er værdifulde gratis værktøj til dette program. Blandt hundredvis eller tusindvis af billeder, er det uundgåeligt, at den automatiske algoritme ikke er i stand til korrekt at detektere spheroids i nogle billeder. Som illustreret i figur 3A, hvor forkert detektion af klumpformet er forvoldt på grund initialiseringen skridt, dvs forkert størrelse eller placering af indledningen kontur i billedet (øverste panel), "Manual Initialize" værktøj virker ved at lade brugeren til korrekt definere placeringen og størrelsen af ​​SphereOID manuelt (nederste panel). Det udløser den aktive konturalgoritme at indlede med manuelt defineret kontur og eksekvere at konvergere på den ønskede kontur. For disse hårde billeder som det originale billede i figur 3B, er klumpformet placeret i en distraherende og støjende baggrund. SpheroidSizer er ikke i stand til korrekt at identificere klumpformet af den automatiserede metode, (øverste panel) eller ved "Manuel Initialize" værktøj med korrekt initialisering (midterste panel). I dette tilfælde kan "Hånd Draw" værktøj anvendes til manuelt at tegne omridset af sfæroidet som illustreret i det nederste panel. Programmet anvender brugerdefineret grænse til at måle de større og mindre akser sfæroid og beregne volumen. Alle de korrigerede resultater straks indarbejdet i "Resultater" og kan derfor eksporteres.

For at bestemme effektiviteten af ​​SpheroidSizer i større datasæt vi først sammenligne driftstid vedanalyse af den samme sæt af 288 billeder ved hjælp af 1) manuelle målinger med mikroskop sælger medfølgende software; 2) SpheroidSizer med en single-core regelmæssig laptop; og 3) SpheroidSizer med en multi-core parallel computing ydeevne arbejdsstation. De manuelle målinger følge vores typisk protokol forud for udviklingen af softwaren: længden og bredden af hver klumpformet er tegnet i hånden og målt ved hjælp af sælgeren program (som set de røde linjer i det øverste panel af figur 4A); derefter bruger kopierer ned måleværdier. SpheroidSizer behandler hvert billede ved at generere sfæroiden grænse (som vist det røde omrids i det nederste panel i figur 4A), måling aksial større og mindre længde, og eksportere resultaterne i regneark. Som det ses i tabel 1, der er baseret på en beregning fra 288 billeder, det tager i gennemsnit 31,67 sek til at måle en kugleformet pr billedet manuelt; mens det tager kun SpheroidSizer mindre end 2 sek & # 160; når du kører på en single-core regelmæssig laptop; og mindre end 1 sek, når du kører på en 12-core ydeevne arbejdsstation. Derfor billedanalyse er over 18x hurtigere per billede ved hjælp SpheroidSizer end manuelle målinger. Det reducerer drastisk arbejdskraft, når mere end tusindvis af billeder analyseres. Dernæst sammenligner vi variation i målinger af de 24 spheroids vist i figur 4A mellem manuelle målinger og SpheroidSizer. De 24 spheroids måles tre gange med begge metoder; og standardafvigelsen for hver enkelt klumpformet beregnes. Som det ses i figur 4B, standardafvigelsen fra SpheroidSizer (grøn linje og prikker) er tæt på nul, med undtagelse af de tre spheroids, som rettes ved kvalitetskontrol skridt, som stadig vise mindre standardafvigelse end dem fra den manuelle målinger metode. Alle disse viser, at SpheroidSizer udfører billedanalyse mere effektivt og præcist.

e_content "> Vi har udført et lægemiddel skærm ved hjælp af humane BON-1 3D tumor sphæroider at finde ud af, hvilke forbindelser i kombination med en hsp90 inhibitor er de potentielle kandidater til at teste anti-tumor effekt in vivo. Menneskelige BON-1 3D tumor spheroids blev dyrket på agarose-belagte 96-brønds plader som beskrevet i det foregående papir ^15. Otte forskellige forbindelser med seks seriefortyndinger plus medier og køretøjet blev screenet for deres enkelt-og kombinatoriske virkninger med 10 nM og 20 nM hsp90 inhibitor i dubletter hhv. To sfæroider blev anvendes for hver koncentration af den individuelle forbindelse, eller de kombinerede forbindelser. Fire plader med 96 brønde med i alt 384 sfæroider blev anvendt. Alle sfæroider blev afbildet på 0, 72, 144, 168 og 192 timer. alt 1.920 billeder blev fremstillet fra dette eksperiment. Det tog SpheroidSizer kun 30 minutter til at fuldføre den beregningsmæssige analyse af de 1.920 billeder med yderligere 50 minutter til kvalitetskontrol og eksport af data. SpheroidSizer fremskynder billedanalyse processen enormt. 5A viser et skærmbillede af mappen arrangementer og filnavne for dette eksperiment som et eksempel for protokol Trin 3.3. Figur 5B-E viser skærmbilleder af billedanalyse pop-up vinduer og resultater . bruge SpheroidSizer som illustrationer til protokol 4, 5 og 7, idet mængderne af 3D spheroids fra den formaterede resultat tabellen eksporteret fra SpheroidSizer, gjorde vi grafer - vækst af 3D tumor spheroids på sammensatte behandlinger versus tid af behandlinger. To repræsentative grafer fra dette forsøg er vist i figur 5F og 5G. Figur 5F viser, at de kombinerede behandlinger af hsp90-inhibitor og cladribine (grøn linje) inhibere væksten af ​​3D sfæroider mere end enkelt behandling med hsp90-inhibitor (lilla linje) eller cladribine (orange linje), hvilket antyder, at de kombinerede behandlinger af hsp90-inhibitor og cladribine kan have anti-tumor efeffekter in vivo. Figur 5G viser, at de kombinerede behandlinger af hsp90-inhibitor og adriamycin (grøn linje), ikke hæmme væksten af 3D sfæroider mere end enkelt behandling af adriamycin (orange linje) eller hsp90 inhibitor (lilla linje), hvilket antyder, at kombinerede behandlinger af hsp90-inhibitor og adriamycin ikke har anti-tumor-virkninger in vivo. Dette eksperiment hjalp os til bedre at vælge de forbindelser til at teste deres anti-tumor effekt in vivo og SpheroidSizer er nøglen til den hurtige eksperimentelle data analyse.

Tabel 1.. Sammenligning af drift tid på billedanalyse mellem manuelle målinger og SpheroidSizer når man analyserer det samme sæt af 288 billeder. venligst cslikke her for at se en større version af denne tabel.

Figur 1 SpheroidSizer -... En open-source software program til måling af klumpformet størrelse A) Kernen workflow af ansøgningen B) Illustration af den aktive konturalgoritme på forskellige stadier af iteration. Bemærk venligst, at initialiseringen kontur (iteration 0) med vilje blev udvidet med henblik på at fremvise algoritmen. C) De større og mindre aksial længde målinger og beregning af volumen af SpheroidSizer. L - hovedakse: linjesegmentet forbinder et enkelt par fjerneste punkter på konturen (jf. længde); W - lilleakse: den længste linje vinkelret på hovedaksen (jf. bredde).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid">
Figur 2.. Repræsentative resultater fra den automatiske segmentering af SpheroidSizer, viser robusthed mod forskellige billed betingelser. A) billeder Typisk god kvalitet. B) billeder med forskellig lysstyrke og kontrast. C) Billeder med distraherende vragrester. D) Billeder af spheroids med nekrotisk kerne . Billeder øverst panel af hver figur er kilden / originale billeder; billeder på det nederste panel af hver figur er kvalitetskontrol billeder; og det røde omrids er klumpformet segmentering tegnet af automatiseret beregning.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Figur 3.. Illustration af "Manual Initialize" og "Hand Uafgjort" værktøjer. A) "Manuel Initialize" værktøj tillader tegning af en fitting ellipse form på tværs af klumpformet for initialisering, hvor unøjagtige spheroid segmentering opstår efter den automatiske initialisering. B ) Den "Hånd Draw" værktøj giver nøjagtig hånd tegning af klumpformet grænse, hvor unøjagtige sfæroidpartikler segmentations forekomme med både automatisk og manuel initialisering. Den blå linje omkring klumpformet viser initialisering kontur; det røde omrids er identificeret klumpformet grænse. Bemærk venligst, at klumpformet i "Manuel Initialize" i A) og klumpformet i "Hånd Draw" i B) bevidst er udvidet for bedre at fremvise værktøjerne.

Fig. 4. Sammenligning af billedanalyse ydeevne mellem SpheroidSizer og manuelle målinger, når man analyserer det samme sæt af 24 billeder. A) Repræsentative sphæroider at vise, hvordan længde og bredde af spheroids er bestemt af manuelle målinger og SpheroidSizer. Top 24 billeder indeholder håndtegnede længde / bredde af hver klumpformet i røde linjer ved hjælp af manuelle målinger; lavere 24 billeder (de samme 24 billeder) indeholder computer-trukket klumpformet grænse i rød kontur hjælp SpheroidSizer. B) Standardafvigelse af længde eller bredde fra tre målinger på hver enkelt klumpformet.

Figur 5.. Et repræsentativt eksempel på udnyttelse af SfæroideSizer i lægemiddel skærm - billedanalyse på sfæroiderne 'billeder, der blev indsamlet fra et lægemiddel skærm ved hjælp BON-1 3D tumor spheroids A) Et skærmbillede af mappen arrangementer og filnavne til dette projekt B) Et skærmbillede af avancerede.. konfigurationer vindue i SpheroidSizer. C) Et skærmbillede af SpheroidSizer1.0 vindue med viste Resultater. D) Et skærmbillede af format output fil eksporteret fra SpheroidSizer. E) Et skærmbillede af listen output-fil eksporteret fra SpheroidSizer. F) Vækst af 3D tumor spheroids til de anmeldte behandlinger med hsp90 hæmmer og cladribine. G) Vækst af 3D tumor spheroids til de anmeldte behandlinger med hsp90 hæmmer og adriamycin. Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>

Discussion

Denne undersøgelse præsenterer en hurtig, fleksibel, effektiv og automatiseret program - SpheroidSizer for nøjagtig bestemmelse af størrelsen af ​​3D-tumor sfæroiderne. SpheroidSizer er nem at bruge og kræver minimal brugerinput. De mest kritiske trin for nøjagtig, glat og vellykket drift af SpheroidSizer omfatter: at sfæroiderne er afbildet i midten af ​​feltet uden at berøre kanten af ​​brønden; alle de filer, der skal analyseres sammen som ét projekt skal afbildes under samme mikroskop med samme formål; alle de filer, der skal analyseres er navngivet og anbragt som vist i protokollen korrekt; og korrekte brugerdefinerede indstillinger er indtastet før beregning.

Fordelene ved SpheroidSizer omfatter dens evne til at tolerere gradvis baggrund ændring i billedet samt at frembringe glatte konturer, der svarer til de almindelige sfæriske former af sfæroider udnytte den aktive konturalgoritme. Ydelse af aktivkontur kan kompromitteres i to situationer: dårlig initialisering, eller tilstedeværelsen af ​​andre lokale kanter distraherende fra den ønskede kontur. Specielt i vores testede tilfælde, den anden situation undertiden ske, når nekrotisk kerne af en stor klumpformet tiltrækker aktive kontur resulterer i mindre kontur blevet indberettet. Det er værd at bemærke, at andre automatiserede tærskel-baserede metoder lider også i denne situation, medmindre tærsklen specifikt er fastsat af hånden. Den software, derfor fremsætter indsats for at hjælpe brugerne med at opdage og afhjælpe kompromitteret segmentering ved at give nem kvalitetskontrol funktioner. Hvis segmentering fejl opstår af dårlig initialisering, kan anvendelser bruge "Manual Initialize" værktøj til at tilsidesætte den automatiske initialisering. Når billedkvaliteten er for dårlig for aktiv kontur, kan brugerne nemt "Hånd Uafgjort" konturen der føres ind kvantificering. Eksisterende software såsom CellProfiler kan tilpasses til denne anvendelse i en halvautomatisk fashion. Arbejdsprocessen kan være besværligt, når store mængder af billeder med forskellige billeddiagnostiske forhold præsenteres, eller når en delmængde af billederne har brug for mere menneskelig indgriben for at måle korrekt. SpheroidSizer giver en alt-i-én pakke til beregning og kvalitetskontrol til at håndtere high-throughput billedanalyse workflow.

SpheroidSizer øjeblikket er begrænset til at opdage én klumpformet pr billede, og kun måler den aksiale længde af klumpformet. Programmet kan udvides til at støtte yderligere kvantificering brug for forskere, såsom kvantificering på spheroids med nekrotisk kerne, afsløre flere spheroids i ét billede eller overvågning af formen af ​​sfæroiderne. Desuden kan programmet modificeres til at detektere og måle størrelsen af de udskårne tumorer fra dyr eller mennesker, som helt sikkert vil være til gavn for forskere, når de foretager in vivo prækliniske eller kliniske forskning. Efterbehandling af de fundne spheroids kan også undersøges målning på at reducere menneskelig indsats er nødvendig for kvalitetskontrol og yderligere forbedre gennemløb. SpheroidSizer er en generaliseret billedanalyse ansøgning til 3D tumor spheroids, der er produceret fra alle celletyper, og derfor kan anvendes af et bredt kræftforskning samfund.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software