Summary
我々は、明視野顕微鏡で画像化された三次元の腫瘍スフェロイドの大きさを測定するためのハイスループット画像解析ソフトウェアアプリケーションを提示する。このアプリケーションは、薬物スクリーニングにスフェロイドを使用したい研究者にとって有益であるスフェロイド、上の治療薬の効果を調べるために迅速かつ効果的な方法を提供します。
Abstract
創薬のためのin vitroモデルとして3次元（3D）腫瘍スフェロイドのアプリケーションの増加は、大規模な画像解析を含む薬物スクリーニングの各段階において、大規模なスクリーニング形式への適応を必要とする。現在、この大規模な形式を満たすために何に使える対応で無料の画像解析ソフトウェアはありません。ほとんどの既存の方法は、手動で、退屈で時間のかかるプロセスであり、撮像された3Dスフェロイド、の長さ及び幅を描画することを含む。本研究では、高スループット画像解析ソフトウェアアプリケーションブック - SpheroidSizer、自動的かつ正確に結像3D腫瘍スフェロイドのメジャーおよびマイナーの軸方向の長さを測定し;個々の3D腫瘍回転楕円体の体積を計算します。その後のデータ解析が容易な操作のためにスプレッドシートの2つの異なる形式で結果を出力する。このソフトウェアの主な利点は、その強力な画像解析アプリケーションです大量の画像に適応。これは、高スループットの計算および品質管理のワークフローを提供する。 1000枚を処理するための推定時間は、最小構成のラップトップ上で約15分間、またはマルチコア·パフォーマンス·ワークステーション上で約1分である。グラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）も容易に品質管理のために設計されており、ユーザが手動でコンピュータ結果を上書きすることができる。このソフトウェアで使用されるキーの方法は、多くの場合、ハイスループットスクリーニングに自動画像処理を悩ませている照明ムラやノイズの多い背景の画像に特に適していることもヘビとして知られる動的輪郭アルゴリズム、、から適応されている。無料の「手動初期化」と「ハンドドロー」ツールは、回転楕円体と多様な品質の画像の様々なタイプを扱う際にSpheroidSizerに柔軟性を提供します。この高スループット画像解析ソフトウェアを著しく労力を低減し、解析処理をスピードアップする。このソフトウェアを実装することはBです産学における薬物スクリーニングのためのin vitroモデル内のルーチンになるための3D腫瘍スフェロイドのためeneficial。
Introduction
3次元（3D）腫瘍スフェロイド1-3」は、細胞付着のためのない人工基質を有する組織に類似した腫瘍細胞の球対称凝集体」である。腫瘍の細胞学及び形態は、単層、二次元（2D）細胞よりも良好模倣するインビボでの腫瘍組織および組織の微小環境をスフェロイド。 3D腫瘍スフェロイドは、ハイスループット抗癌治療薬のスクリーニングまたは候補薬物の有効性を検査するための実用的なin vitroモデルとなっているインビボ動物または臨床試験の前に4。臨床的には、任意の抗がん剤治療の有効性は低減され、腫瘍の成長に基づいて評価される。同様に、スフェロイド体積はインビトロがん剤研究のための有効性の尺度として用いることができる。回転楕円体の体積（V = 0.5 *長さ*幅2）を （より一般的に長さと幅とも呼ばれます）メジャーとマイナーの軸方向の長さに基づいて決定されるスフェロイドの6、7。ほとんどの研究者は、手動で、多くの場合、顕微鏡会社が提供し、イメージング機器と一緒に販売するソフトウェアを使用して、各回転楕円体上の長さと幅を描画する必要があります。ハイスループット薬物スクリーニングが行われる画像の数百以上が生成されるとき、この技術は、問題となる。いくつかの最近の研究では、光量補正、簡単な閾値処理を含んだ基本的なセグメント化ルーチン/マクロを開発するなどCellProfiler 8月10日とImageJの11のようなオープンソースの画像解析ソフトウェアツールボックスを使用することを報告した。これらのルーチンは、多くの場合、照明条件及び画像コントラスト変化に応じて画像の異なるバッチのために再調整する必要がある;従って、これらのソフトウェアパッケージは、ハイスループット画像解析の堅牢性要件を満たすことができない。フリードリヒとの共同研究（2009）は、回転楕円体のボリューム半AUTOMを測定するために、独自のソフトウェアを使用atically 5。 Monazzamと彼の同僚の紙10に記載されている方法は、イメージだけのデータ量が少ないときに、回転楕円体の大きさを測定するための半自動化された方法であった。したがって、3D腫瘍スフェロイドのため、堅牢で柔軟な、自動化されたすぐに使用できる画像解析ツールのための明確な必要性が存在する。
本研究では、SpheroidSizerを説明 - MATLABベースのオープンソース·ソフトウェア·アプリケーションを自動的かつ正確に腫瘍スフェロイドの大きさを測定すること。 SpheroidSizerは、同一セッション内で、3Dスフェロイドの画像の多くの異なるバッチを処理するように設計されている。動的輪郭アルゴリズム12から14を利用して、SpheroidSizerロバスト背景照明が徐々に変化を無視して、画像内のスフェロイドを認識し、画像コントラストの変化に耐えることができます。また、 例えば 、破片は、試料から発生し、多くの通常のアーティファクトを許容することができる。ユーザは、品質コントロを実行できるようにワークフローを設計するL中または演算後。解析結果の手動上書きを容易にその場で行うことができる。並列コンピューティング·ツールボックスを利用して、解析速度は、ユーザのコンピュータ上で同時に計算上で動作する複数のコンピューティング·コアを調整することによって追加免疫することができる。また、SpheroidSizerは、下流の解析ツールと容易にインターフェースできるようにするために、2つの異なる形式で結果を出力します。
Protocol
前報15で説明したように1。3D腫瘍スフェロイド形成、薬物治療および画像収集が行われる。
2。ソフトウェアのインストール
- 画像解析のために使用されるコンピュータ上にライセンスされたMATLABソフトウェアをインストールします。 MATLABから、以下のツールボックスもインストールする必要が - 信号処理ツールボックス、画像処理ツールボックス、および並列コンピューティングツールボックス*（*パラレル·コンピューティング·モードのために必要な場合のみ）。
注：ソフトウェアがダウンロードされ、関連の科学者によって使用されて自由になるように、多くの大学は、グループライセンスを購入し、維持する。 - SpheroidSizer.zipファイル（http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip）からSpheroidSizerプログラムをインストールします。
- ローカルファイルシステム内のzipファイルを保存します。
- SpheroidSizerファイルを解凍します。
- その後、Tと呼ぶことにする指定されたディレクトリ/フォルダにファイルを保存彼は、「インストールディレクトリ」。
注：SpheroidSizerは広範囲のWindows 7オペレーティング·システム上でテストされています。それは、最小限の調整（未テスト）で、代替のオペレーティングシステム上で動作するように期待されている。
SpheroidSizerによる画像解析のための3。準備
- イメージングシステム（ピクセルあたりミクロン画像の絶対尺度（以下/ PIX））の画像スケール/解像度を決定。
NOTE：カメラチップ上の各画素の大きさが既知の場合は、画像の倍率は、 対物倍率xの画素径 （μm/ pixは）として計算することができる。この値は、埋め込まれたメタデータとして、またはイメージング·システムのベンダからの助けを借りて顕微鏡を備えたイメージングソフトウェアから得ることができる。この値は、ステップ4.6に必要となります。 - TIFF、JPEG、および他の一般的な画像ファイル形式 - 任意の独自の画像ファイル形式は、受け入れのファイル形式に変換します。
- 画像ファイルに名前を付け、directori手配ES（ 図5A）。
注：このソフトウェアは、プレートフォーマットに結果を再フォーマットするディレクトリ構造やファイル名の適切なレイアウトに依存しています：- 以下のフォーマットの画像ファイルに名前を付け、[プレート名] _ [行] [列] [拡張]または[プレート名] [スペース] [行] [列] [拡張機能]。。。 [行]はアルファベット順に従っており、[列]は番号順に従います。
注：自由に利用できる自動一括リネームソフトウエアは、このステップでユーザを支援するために見つけることができます。 - 以下の方法での実験に基づくディレクトリ/フォルダを整理：各実験は、1ディレクトリを持つ必要があります。各実験のディレクトリの下に、各時点でのサブディレクトリがあるはずです。各時点のサブディレクトリの下で、すべてのプレートからのすべての画像があるはずです。
注：最適にフォーマットされた結果でソートする解析結果のために、我々はLに0を充填することによって、各識別子に対して同じ桁数を維持することをお勧めEFT、 例えば 、時点は000H、072H、144Hおよびとして名前が付けられています。
- 以下のフォーマットの画像ファイルに名前を付け、[プレート名] _ [行] [列] [拡張]または[プレート名] [スペース] [行] [列] [拡張機能]。。。 [行]はアルファベット順に従っており、[列]は番号順に従います。
SpheroidSizerによるスフェロイドの4。画像解析
- オープンなMATLABは、それから「コマンドウィンドウ」で、cd '[インストールディレクトリ]'を押しながら[戻る]を開きます。
- SpheroidSizerプログラムを起動し、「コマンドウィンドウ」を選び、[戻る]で「SpheroidSizer1_0」と入力します。
- すべての画像が含まれている実験ディレクトリを選択するためにSpheroidSizer1.0ウインドウで「参照」ボタンをクリックしてください。
- 選択して指定されたディレクトリの下にネストされた複数の画像フォルダを処理するために、「フォルダ」テキストフィールドの下のトグル「サブフォルダを含める」。
注：「サブフォルダを含める」トグルが選択されていない場合は、直接ディレクトリの下にあるイメージだけが処理され、すべてのサブフォルダは無視されます。 - DISPを「オン·ザ·フライ表示」オプションを選択します。計算が実行されているように、品質管理のためのソース画像の上にそれぞれ分割された画像を置く。
注：「オンザフライ表示」オプションが選択されていない場合、計算速度が速くなります。 - 正しくμmの画素から回転楕円体の測定値を変換するプログラムの場合は、ボックスで解析画像の「解決方法」（以下/ PIXでの画像スケール/解像度）を指定します。
注：画像スケール/解像度は、各実験のために一定になるように、同じフォルダ内のすべての画像や、一緒に分析には、同じ目的で同じ顕微鏡下で撮影する必要があります。 - （省略可能）ユーザーが高度なユーザー定義の設定については、ステップ5に従うことができます。
- 計算を開始するために「計算」をクリックしてください。
注：ソフトウェアは、計算に進む前に、自動ファイル名のチェックを行う。ダイアログボックスが示す表示される場合 - 「エラーファイル名に存在する「クリック」を終了し、エラーのリストを表示する」（ステップ3.3参照）記載されているファイル名の誤りを修正。その後、再度計算を開始するために「計算」をクリックします。 - 計算を一時停止するには「一時停止」ボタンをクリックしてください。そして計算は「続行」を示す同じボタンをクリックして、再開することができます。
注：（μm単位）「結果表」「フォルダ」、「ファイル」を表示、「音量」（MM 3）で、「長さ」（μm単位）、「幅」、および「有効」（チェックボックス）分析したスフェロイド（ 図5C）のすべてについて。体積を測定し、長軸（長さ）と短径（幅）に基づいて算出される（V = 0.5 *長さ*幅2）。 「有効」チェックボックスは、画像の解析、品質管理の後に有効であるか無効である場合には、ステップ6を参照して、ユーザが選択するためのオプションです。
5。高度なユーザー定義の設定
- Spherで「詳細設定」ボタンをクリックしてくださいoidSizer1.0ユーザー定義の設定（ 図5B）を調整するために、高度な設定ウィンドウを表示するには、ウィンドウ。
- 「入力」の下で高度な設定]ウィンドウの「フォーマット出力」と「リスト出力」ボックスで目的のファイル名を入力してください。
- 「リデュース」ボックスに「2月10日」の数値を入力します。これは、計算速度を向上させるために、計算に画像サイズを縮小するソフトウェアのための係数である。数値が大きいほど、より速い計算速度である。デフォルトの「リデュース」が10に設定されています。
- "タイプを含める」ボックスに、なるように処理された画像ファイルの拡張子を入力してください。
- 「_crude.jpg "次のように"タイプを除外」のボックスにプログラムによって処理されようとしていない画像ファイルの拡張子や語尾を入力してください。
- 8ビットと16ビットのCOLを処理するために「スペシャルカラー」の「なし」を選択してください適切に、または画像;適切に12ビットのカラー画像を処理する「スペシャルカラー」を「12ビット」を選択してください
- チェック画像解析のために使用されるコンピュータは、複数のCPUおよび/またはマルチコアCPUを搭載している場合、「並列コンピューティングを使用する」。これが本当であれば、5.7.1に進みます。もしそうでなければ、ステップ5.7.1および5.7.2をスキップします。
注：使用中のコンピュータが選択した構成をサポートしていない場合は、エラーが発生します。- 高度な設定]ウィンドウの「使用する並列コンピューティング」オプションをチェックします。
注：4つ以上のコアがコンピュータで利用できる場合にのみ、並列コンピューティング·モードを使用します。 - 「＃労働者」の4-12（コンピューティングコア）ボックスから番号を入力してください。
注：この番号は、等しいか又はユーザのコンピュータでの演算コアの数よりも少なくなければならない。 12の最大値は、MATLABの並列コンピューティング·ツールボックスは、12コアの最大をサポートして徴収され。並列コンピューティングは、BEのときING実行、小さなダイアログボックスが表示され終了する並列計算を待つためにユーザに尋ねる。計算は一時停止、およびNOR並列コンピューティング·モードで実行されている「オンザフライ表示」機能であることはできません。
- 高度な設定]ウィンドウの「使用する並列コンピューティング」オプションをチェックします。
6。品質管理
- 分析された画像中の回転楕円体の正確な境界輪郭を確認するために「結果テーブル」に対応するセルをクリックし、
注：オリジナルと品質管理イメージはレビューのために右側に表示されます。ユーザは、キーボードの下矢印を使用して順番にすべての画像を調べることができます。 - 必要に応じて、次の2のツールを使用して、選択した画像に回転楕円体の境界を絞り込む：
- オリジナル画像を表示する「手動初期化」ボタンをクリックしてください。クリック＆ホールド、マウスを右回転楕円体の外に、元の画像に回転楕円体をカバーする楕円ツールをドラッグします。
注：Active輪郭アルゴリズムは、ユーザーが送信した輪郭を使用して開始し、希望の回転楕円体の輪郭に収束する実行されます。 「結果表には、「自動的に新しい結果に更新されます。 「手動初期化」ツールは、ユーザーが手動でアクティブ輪郭の初期化を提供することができます。 - 元の画像を表示するように「手ドロー」ボタンをクリックしてください。そして、正確に回転楕円体の境界線を描画するために、マウスやタッチ対応スクリーンを使用しています。
注：このアウトラインは直接「結果表」に更新されて長軸と短軸を生成するために測定される。 「ハンドDRAW」ツールは、「手動初期化」ツールは、回転楕円体の所望の境界に収束しなかった場合にのみ使用されます。
- オリジナル画像を表示する「手動初期化」ボタンをクリックしてください。クリック＆ホールド、マウスを右回転楕円体の外に、元の画像に回転楕円体をカバーする楕円ツールをドラッグします。
- 画像は、検査の際に、任意の有効な回転楕円体が含まれていない場合には、「結果表」の対応する行の「有効」列のチェックボックスをオフにします。 ";無効」ラベルは、品質管理、画像の左上隅に表示されます。 「有効な」とは、オフにすると、すべての測定値は、エクスポートされたフォーマットされた出力結果ファイル内の回転楕円体のために空になります。
注：以下のキーボードショートカットは、「結果表」で使用するために利用可能である：次の画像のための「下矢印」;有効/無効のための "V"; 「ハンドDRAW」ツールの「手動初期化」ツールと「H」の「M」。
7。保存とデータのエクスポート
- ユーザーがプロジェクトを終了する前にソフトウェアを終了する必要がある場合には、分析の中間状態をエクスポートするSpheroidSizer1.0ウィンドウに「エクスポート研究」ボタンをクリックしてください。保存するファイルの名前とディレクトリを指定します。
- 「エクスポート研究」から上記の中間状態の結果を持ち帰るとWORに進み「インポートスタディ」ボタンをクリックしてくださいそれをkである。
注：中間状態ファイルは、ネイティブのMATLAB形式（。マット）にあり、他のソフトウェアプログラムから直接読み取れるものではありません。ソフトウェアに組み込まれた安全機能により、プログラムが意図せずに終了した場合に、開いているプロジェクトを自動的に輸出を行う。必要なときに、ユーザーは、名前が[インストールディレクトリ]に対応するタイムスタンプが含まれている "〜TMP」で始まる、このファイルを見つけることができます。 - 結果を保存するSpheroidSizer1.0ウィンドウ内の「フォーマット結果」をクリックしてください。
注：結果の2つの形態が、実験のディレクトリに保存されます。エクスポートされたファイル名は、（プロトコルステップ5.2を参照）高度な設定]ウィンドウで設定することができます。形式の出力ファイルには、各時点で上昇プレート番号順に原版フォーマットにボリューム値を整理タブ区切ら表である。そして、全ての時点は、昇順（ 図5D）で構成されています。リストOutputなどファイルには、順序付けられたリスト（ 図5E）の形での測定値がすべて含まれ、タブで区切られた表である。
Representative Results
SpheroidSizer労力を大幅に低減し、大量の画像のために急性的に増加した効率で、3Dスフェロイドの自動検出、および測定描写を生成するように設計される。 図1Aは SpheroidSizerのワークフローを示している。コア計算ステップは、自動化された初期化、動的輪郭アルゴリズムと輪郭定量化が含まれています。後の計算を自動化、品質管理機能は、任意の不完全なセグメンテーションをサルベージする「手動初期化」と「ハンドドロー」ツールを組み合わせて使用しています。 図1Bは 、詳細な自動化された動的輪郭アルゴリズムを示している。初期化ステップ（0番目の反復）は回転楕円体のおおよそのサイズおよび位置を生成し、推定サイズの球状開始輪郭を生成するために、基本的な画像処理ステップを利用する。開始輪郭は動的輪郭アルゴリズムにフィードバックする。ターンでは、ローカルの画像に応じて調整して繰り返し処理勾配と曲率形状。動的輪郭アルゴリズムこのイメージの477回の繰り返しすなわち仕上げ輪郭が安定（収束）、とき、または反復の事前に定義された最大数が実行される。この例では、初期輪郭が意図的に良好なアルゴリズムを紹介するために拡大される。現実には、初期化は、通常、実際の境界に非常に近いと非常に少ない反復が収束するアルゴリズムのために必要とされる。その後、このアルゴリズムは、検出された回転楕円境界の形態学的測定を行う。回転楕円体の長軸と短軸は、MATLABの画像処理ツールボックス（ 図1C）を用いて測定している。長軸は、長さ（L）と呼ばれる輪郭上の最も遠い点の一対を結ぶ線分として定義される。短軸は、幅（W）と呼ばれる長軸に直交する最長の線として定義される。この場合、L及びWの値が非常に近いので、回転楕円体は、球形である。回転楕円体の体積は、V = 0.5 * L *ののW 2として算出される。
SpheroidSizerの特徴の一つは、不均一やノイズの多い背景が動的輪郭アルゴリズム（ 図2B-D）を利用することにしても画像上のスフェロイドの境界、その自動検出です。明視野画像の演算処理は、多くの場合、不必要なしきい値処理結果を生成するために適応しきい値ベースの方法を誤解不均一な背景、悩まされている。マルチウェルプレートを使用すると、ウェルの壁画像についてシャドーイング効果を作成される場合があり問題が特に顕著である。しかし、動的輪郭アルゴリズムは、バックグラウンドで徐々に濃淡変化に敏感ではないので、それは適切な初期化でこれらの明視野像でのスフェロイドのセグメンテーションを識別することができる。 図2は 、凹凸のような、不均一やノイズの多い背景の画像のいくつかの例を示しています照明（ 図2B 図2C）または壊死性コア（ 図2D）。各図の下側のパネルに赤い輪郭のように自動化された動的輪郭アルゴリズムでは、SpheroidSizerは、これらすべての画像に正確にこれらのスフェロイドの輪郭を描く。
SpheroidSizerの品質制御機能は、ハイスループットワークフローの鍵である。 「手動初期化」と「ハンドドロー」ツールは、このアプリケーションのための貴重な無料のツールです。画像数百または数千の中でも、自動化されたアルゴリズムが正しく一部の画像でスフェロイドを検出することができないことは避けられない。回転楕円体の不適切な検出により画像（上のパネル）中の開始輪郭の初期段階、 すなわち不適切な大きさまたは位置に起因する、図3Aに示すように、「手動初期化」ツールは、ユーザが適切に機能することによってspherの位置とサイズを定義するOIDを手動で（下のパネル）。これは、手動で定義された輪郭を開始し、目的の輪郭に収束するために実行する動的輪郭アルゴリズムをトリガします。 図3Bの元の画像のようにこれらの厳しい画像では、回転楕円体は気が散るし、ノイズの多い背景にあります。 SpheroidSizerが適切に自動化された方法（上のパネル）または適切な初期化（中央パネル）で「マニュアル初期化」ツールで回転楕円体を識別することができません。ここで、「ハンドドロー」ツールは、下のパネルに示されるように手動で回転楕円体の輪郭を描画するために使用することができる。プログラムは、回転楕円体の長軸と短軸を測定し、体積を計算するために、ユーザー定義の境界を使用しています。すべての修正された結果は、すぐに「結果表」に組み込まれ、それに応じてエクスポートすることができます。
大きなデータセット内のSpheroidSizerの性能を決定するために、我々は最初の操作時間を比較顕微鏡ベンダーが提供するソフトウェアを使用して1）手動測定を使用して288の画像の同じセットを分析する。 2）シングルコアの正規ラップトップSpheroidSizer;そして3）マルチコア並列コンピューティング性能のワークステーションでSpheroidSizer。手動測定前にソフトウェアを開発する私たちの典型的なプロトコルは、次のとおりです。各回転楕円体の長さと幅は、手で描かれた、ベンダー·プログラム（ 図4Aのトップパネルに赤色のラインを見られるように）を使用して測定している。 [ユーザーのコピーの測定値がダウン。 SpheroidSizer（ 図4Aの下のパネルに赤い輪郭線を示したように）、回転楕円体の境界を生成し、軸メジャーとマイナーの長さを測定し、スプレッドシートに結果をエクスポートすることで、各画像を処理する。 288画像からの計算に基づいて、 表1に見られるように、手動で、画像ごとに1つのスフェロイドを測定するために31.67秒の平均をとる;それだけSpheroidSizer未満2秒＆れている間 ＃160;シングルコアの正規のラップトップ上で実行されている。未満1秒12コア·パフォーマンス·ワークステーション上で動作しているとき。したがって、画像分析、手動測定よりもSpheroidSizerを用いて画像あたり18倍を超える高速である。画像の数千を超えるが分析されるとき、それは劇的に労働を軽減します。次に、手動測定とSpheroidSizerの間、図4（a）に示す24スフェロイドの測定値の変動を比較します。 24スフェロイドは、両方の方法を3回測定され;そして個々の各スフェロイドの標準偏差が計算される。 図4Bに見られるように、SpheroidSizer（緑色の線や点）からの標準偏差は、まだ手動測定法からのものよりも小さく、標準偏差を示す品質管理手順、で補正されている3スフェロイドを除いてゼロに近い。これらはすべて、SpheroidSizerをより効率的かつ正確に画像解析を行うことを示している。
e_content ">我々は、生体内で抗腫瘍効果をテストするための潜在的な候補である。人間BON-1の3D腫瘍スフェロイドが成長させたHsp90阻害剤との組み合わせでは、化合物かを調べるために、ヒトBON-1の3D腫瘍スフェロイドを使用して薬物スクリーニングを実施しました前報15で説明したように、アガロースでコーティングされた96ウェルプレートに。6段階希釈Plusメディアと車両との8種類の化合物は、それぞれ10 nMおよび連で20 nMのHsp90阻害剤とのシングルと組み合わせ効果についてスクリーニングした。二つのスフェロイドであった合計384スフェロイドを有する4 96ウェルプレートを用いた。個々の化合物または結合化合物の各濃度について用いられる。全てスフェロイドを0、72、144、168、および192時間で撮像した。1920画像の総数を製造したこの実験から、それは品質管理とデータエクスポートのための追加の50分で1920画像のコンピュータ解析を完了するために、SpheroidSizerのみを30分かかった。SPHEROidSizerは非常に画像解析処理を高速化します。 図5（a）はプロトコルステップ3.3を例に、この実験のためのフォルダの配置とファイル名のスクリーンショットを示しています。 図5B-Eは 、画像解析のポップアップウィンドウと結果のスクリーンショットを示しています。治療の時間に対する化合物処理の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長 - SpheroidSizerからエクスポートフォーマットされた結果テーブルから3Dスフェロイドのボリュームを取るプロトコル手順4のためのイラスト、5、および7としてSpheroidSizerを使用して、我々はグラフを作りました。この実験からの二つの代表的グラフを図5Fおよび5Gに示されている。図5Fは、Hsp90阻害剤の併用治療を示唆し、Hsp90阻害剤（パープルライン）またはクラドリビン（オレンジライン）の単一治療よりもスフェロイドHsp90阻害剤とクラドリビン（緑色の線）の併用治療は、3Dの成長を阻害することを示し、クラドリビンは、抗腫瘍エフを有していてもよい生体内で fects。 図5Gはことを示唆し、アドリアマイシン（オレンジライン）またはHsp90阻害剤（パープルライン）の単一治療よりもスフェロイドHsp90阻害剤アドリアマイシン（緑色の線）の併用治療は、3Dの成長を阻害しないことを示していHSP90阻害剤およびアドリアマイシンの併用治療は、 インビボで抗腫瘍効果を有していなくてもよい。この実験は、私たちはより良い生体内でそれらの抗腫瘍効果をテストするために化合物を選択し、SpheroidSizerがスピーディー実験データ解析の鍵となりました。
表1。手動測定とSpheroidSizer間の画像解析に関する動作時間の比較288の画像の同じセットを分析する。 してくださいCこの表の拡大版をご覧になるにはこちらをなめる。
図1 SpheroidSizer - 。反復のさまざまな段階で動的輪郭アルゴリズムの回転楕円体の大きさを測定するためのオープンソースのソフトウェア·アプリケーションA）アプリケーションの中核となるワークフローB）イラスト。初期輪郭（反復0）が意図的アルゴリズム。C）メジャーとマイナーの軸方向の長さの測定値とSpheroidSizerによる体積の計算を紹介するために、拡大されたことに注意してください。 L - 長径：（長さと呼ばれる）輪郭上の最も遠い点の単一の対を結ぶ線分; W - 短径：（幅と呼ばれる）の長軸に対して垂直な最長行。
壊死性コアを用いた球状の図2。SpheroidSizerの自動化されたセグメント化の代表的な結果、様々な画像の条件に対するロバスト性を示す。A）典型的な良い品質の画像。B）画像散る残骸と異なる明るさとコントラスト。C）写真有り。D）は画像。各図の上のパネルの画像は、ソース/元の画像である。各図の下側のパネルで画像を品質管理のイメージです。と赤のアウトラインが自動化された計算によって描かれた回転楕円体のセグメンテーションである。
hres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
図3。「手動初期化」のイラストと「ハンドドロー」ツール。A）「マニュアル初期化」ツールは、不正確な回転楕円体のセグメント化は、自動初期化後に発生した場合に、初期化のために回転楕円体全体でフィットする楕円形の描画を可能にします。B ）「ハンドドロー」ツールは、回転楕円体の境界の正確な手描き、不正確な回転楕円セグメンテーションは自動と手動の両方の初期化で発生することができます。回転楕円体の周りの青い線は初期輪郭を示しています。赤い輪郭が特定さスフェロイドの境界である。 Aの「マニュアル初期化」）における回転楕円体とBの「ハンドドロー」の回転楕円体）が意図的に優れたツールを紹介するために拡大されることに注意してください。
図4の画像24の同じセットを分析SpheroidSizerと手動測定値の間の画像解析性能の比較。 A）代表スフェロイドはスフェロイドの長さと幅は、手動測定とSpheroidSizerによって決定された方法を示すこと。トップ24の画像は、手動測定を使用して赤線内の各回転楕円体の手描きの長さ/幅が含まれている。下24の画像（同24画像）SpheroidSizer。B）個々の回転楕円体上の3つの測定値からの長さや幅の標準偏差を使用して赤い枠内のコンピュータ描画回転楕円境界を含んでいる。
図5。回転楕円体の利用の代表例薬物スクリーニングにおけるサイザー- BON-1の3D腫瘍スフェロイドを使用して薬物画面から収集したスフェロイド「画像上の画像分析A）は、このプロジェクトのフォルダ構成及びファイル名のスクリーンショットB）先進のスクリーンショット。 SpheroidSizer。C）表示された結果表でSpheroidSizer1.0ウィンドウのスクリーンショットで構成ウィンドウが表示されます。D）SpheroidSizerからエクスポート形式の出力ファイルのスクリーンショット。E）SpheroidSizerからエクスポートリストの出力ファイルのスクリーンショット。F） Hsp90阻害剤とクラドリビンとの治療の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長。G）の Hsp90阻害剤アドリアマイシンによる処置の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 </ pの>
Discussion
SpheroidSizer 3D腫瘍スフェロイドの大きさを正確に決定するため - 本研究では、高速で柔軟性のある、効果的かつ自動化されたプログラムを提示します。 SpheroidSizerは使いやすく、最小限のユーザー入力を必要とします。 SpheroidSizer正確、円滑かつ正常なランニングのための最も重要なステップは次のとおりです。スフェロイドがウェルの端に触れることなく、フィールドの中央で画像化されていること; 1プロジェクトとして一緒に分析しようとするすべてのファイルが同じ目的で同じ顕微鏡下で画像化されるべきである。プロトコルに示されているように分析しようとするすべてのファイルが正しく命名され、配置されている。そして、正しいユーザが定義した設定は、計算前に入力されています。
SpheroidSizerの利点は、画像が徐々に背景の変化を許容するだけでなく、動的輪郭アルゴリズムを利用スフェロイドの一般的な球状の形状に対応して、滑らかな輪郭を生成する能力があります。アクティブのパフォーマンス貧しい初期化、または所望の輪郭から邪魔他のローカルのエッジが存在する：輪郭が2つの場合に損なわれる可能性があります。大回転楕円体の壊死性コアが報告されて小さい輪郭をもたらし、動的輪郭を魅了したとき、特に私たちのテストケースでは、第二の状況は時々起こる。これは、スレッシュホールドは、具体的に手で設定されていない限り、他の自動化されたしきい値ベースの方法も、このような状況で苦しむことは注目に値する。ソフトウェアは、そのため、ユーザーは検出するのに役立ち、簡単に品質管理機能を提供することで、妥協のセグメンテーションを改善するために前方力を入れています。セグメンテーションエラーが悪い初期から発生した場合、用途は自動化された初期化を無効にする「手動初期化」ツールを使用することができます。画質は、動的輪郭すぎる悪い場合には、ユーザーが簡単に定量化に送り込ま輪郭を「手を描く」ことができます。例えばCellProfilerなどの既存のソフトウェアは、半自動ファッにこの用途に適合させることができるN。画像の部分集合を正しく測定するためのより多くの人間の介入を必要とするときに別の撮影条件の画像が大量に提示されたとき、またはワークフローが煩雑になる可能性があります。 SpheroidSizerは、計算や高スループット画像解析のワークフローを管理するための品質管理のためのオールインワンスイートを提供しています。
SpheroidSizerは、現在の画像ごとに1つの回転楕円体の検出に限定されるものだけ回転楕円体の軸方向の長さを測定する。プログラムは、1つの画像内の複数のスフェロイドを検出又はスフェロイドの形状を監視する、壊死性コアを有する球状体で、例えば定量などの研究者が必要とするさらなる定量化をサポートするように拡張することができる。さらに、プログラムは、 インビボ前臨床又は臨床研究で行う場合は必ず研究者にとって有益である動物またはヒトから摘出した腫瘍の大きさを検出し、測定するために修飾することができる。検出されたスフェロイドの後処理はまた、目標を調査することができる品質管理のために必要とされる人間の労力を低減し、スループットをさらに向上させることをING。 SpheroidSizerは、任意の細胞タイプから生成された3D腫瘍スフェロイドのための一般化された画像解析アプリケーションであるため、幅広いがん研究コミュニティによって使用することができる。
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
我々は我々の研究に彼らのサポートのためのレイモンドとビバリーサックラー財団に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | microscope for imaging | |
| Vostro 1720 | Dell Inc. | single-core regular laptop | |
| HP Z820 | HP Inc. | multi-core performance workstation | |
| MATLAB and Simulink R2013a | Mathworks, Inc, Natick, MA | MATLAB software |
References
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