ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

Summary

אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים להשתמש הספרואידים במסכים בסמים.

Abstract

מספר גדל והולך של יישומים של (3D) הספרואידים גידול תלת ממדים כמודל במבחנה לגילוי סמים דורש ההסתגלות שלהם לפורמטים הקרנה בקנה מידה גדולה בכל שלב של מסך בסמים, כוללים ניתוח תמונה בקנה מידה גדולה. נכון לעכשיו אין תוכנת ניתוח תמונה מוכנה לשימוש וחופשי לפגוש בפורמט גדול בקנה מידה זה. השיטות הקיימות ביותר כרוכות ציור האורך והרוחב של הספרואידים 3D צילמו, וזה תהליך מייגע וגוזל זמן באופן ידני. מחקר זה מציג יישום תפוקה גבוהה תוכנת ניתוח תמונה - SpheroidSizer, המודד את האורך הצירי הראשי ומשניות של הספרואידים גידול 3D צילמו באופן אוטומטי ובדייקנות; מחשב את עוצמת הקול של כל אליפטית גידול 3D פרט; ואז פלטו את התוצאות בשתי צורות שונות בגיליונות אלקטרוניים למניפולציות קלים בניתוח נתונים שלאחר מכן. היתרון העיקרי של תוכנה זו הוא היישום שלה חזק תמונת ניתוח שהואמותאם למספר גדול של תמונות. הוא מספק חישוב תפוקה גבוהה וזרימת עבודה בקרת האיכות. הזמן המשוער לעבד 1,000 תמונות הוא כ 15 דקות על מחשב נייד מוגדר מינימאלי, או סביב 1 דקות בתחנת עבודה של ביצועים מרובות ליבות. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) נועד גם לבקרת איכות קלה, ומשתמשים יכולים לעקוף באופן ידני את תוצאות המחשב. השיטה העיקרית ששמשה בתוכנה זו מותאמת אלגוריתם הפעיל קווי המתאר, הידוע גם נחשים, שהוא מתאים במיוחד לתמונות עם תאורה לא אחידה ורקע רועש, כי לעתים קרובות המכות עיבוד הדמיה אוטומטית במסכי תפוקה גבוהה. "האתחול הידני" חינם וכלים "צייר יד" לספק את גמישות SpheroidSizer בהתמודדות עם סוגים שונים של הספרואידים ותמונות באיכות שונות. תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה זה להפליא מפחיתה עבודה ומאיצה את תהליך הניתוח. יישום תוכנה זו היא בeneficial להספרואידים גידול 3D להפכה לשגרה במודל חוץ גופית למסכי סמים בתעשייה ובאקדמיה.

Introduction

הספרואידים גידול תלת ממדי (3D) הם "מצרפי סימטריה כדורית של תאים סרטניים דומים לרקמות, ללא מצע מלאכותי לקובץ מצורף תא" ^1-3. הציטולוגיה והמורפולוגיה של הגידול spheroids מחקה טוב יותר in vivo ארגון רקמת גידול וmicroenvironments מאשר תאי monolayer דו ממדים (2D). הספרואידים גידול 3D הפכו למודל מעשי במבחנה להקרנות תפוקה גבוהה של תרופות טיפוליות אנטי סרטניות או לבחון את היעילות של תרופות מועמד לפני בעלי החיים in vivo או בדיקה קלינית ^4. מבחינה קלינית, את היעילות של כל טיפול תרופה נגד סרטן מוערך בהתבסס על צמיחת גידול מופחתת. בדומה לכך, אליפטית נפח יכול לשמש כמדד ליעילות ללימודי תרופה לסרטן במבחנה. נפח אליפטית (V = 0.5 * אורך * רוחב ²⁾ נקבע בהתבסס על האורך הצירי הראשי ומשניות (ידוע יותר בכינויו אורך ורוחב)של הספרואידים ^{6, 7.} רוב החוקרים צריכים לצייר באופן ידני את האורך ורוחב על כל אליפטית, לעתים קרובות באמצעות התוכנה המוצעים על ידי חברות מיקרוסקופיה ונמכרת יחד עם מכשירי ההדמיה. טכניקה זו הופכת להיות בעייתית כאשר מסכי סמים תפוקה גבוהה מבוצעים ויותר ממאה תמונות מיוצרים. כמה מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על השימוש בארגזי כלי תוכנה לניתוח פתוחים תמונת המקור כגון CellProfiler ^{8-10 ו11} ImageJ לפתח שגרת פילוח / פקודות מאקרו הבסיסיות שהיה כרוך בתיקון תאורה וthresholding הפשוט. אלה שגרות לעתים קרובות צריכה להיות מחדש מותאמות לקבוצות שונות של תמונות על פי תנאי תאורה והשינוי לעומת תמונה; לכן, חבילות תוכנה אלה לא יכולים לענות על דרישת חוסנו של ניתוח תמונת תפוקה גבוהה. פרידריך ומשתפי פעולה (2009) השתמשו בתוכנת קניינית למדוד למחצה מכוניו הנפח של אליפטיתatically ^5. השיטה המתוארת בMonazzam ונייר 'עמיתיו ¹⁰ הייתה שיטה חצי אוטומטי למדידת הגודל של אליפטית רק למספר קטן של תמונות. משום כך, קיים צורך ברור בכלים חזקים, גמישים, אוטומטיים וניתוח תמונה מוכן לשימוש להספרואידים גידול 3D.

במחקר זה, אנו מתארים SpheroidSizer - יישום תוכנה בקוד פתוח המבוסס על MATLAB ולמדוד את הגודל של הספרואידים גידול באופן אוטומטי ובאופן מדויק. SpheroidSizer נועד לעבד קבוצות רבות ושונות של תמונות של הספרואידים 3D באותה הפגישה. ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל ^12-14, SpheroidSizer יכול לסבול שינוי לעומת תמונה, וחסונה להתעלם שינוי הדרגתי בתאורת רקע ולהכיר הספרואידים בתמונה. זה גם יכול לסבול הרבה חפצים רגילים, למשל, פסולת, שמקורה בדגימה. זרימת העבודה מתוכננת כך שמשתמשים יכול לבצע contro איכותליטר במהלך או לאחר החישוב. דריסה ידנית של תוצאת הניתוח בקלות יכולה להתבצע במקום. מנצל את ארגז הכלים של המחשוב המקביל, מהירות הניתוח יכולה להיות שיפרה עוד יותר על ידי תיאום ליבות מחשוב מרובות לעבוד על החישוב בו זמנית על המחשב של משתמש. יתר על כן, SpheroidSizer פלטי התוצאות בשתי צורות שונות כדי לאפשר התממשקות קלה עם כלי ניתוח במורד הזרם.

Protocol

1. היווצרות הספרואידים גידול 3D, טיפולים תרופתיים ואוסף תמונה מבוצעים כפי שתוארו במאמר הקודם שלנו ^15.

2. התקנת תוכנה

1. התקנת תוכנת MATLAB מורשה למחשב המשמש לניתוח תמונה. ארגזי הכלים מMATLAB הבאים נדרשים גם כדי להיות מותקנות - ארגז כלים לעיבוד אותות, ארגז כלים של עיבוד תמונה, ו* ארגז כלים של מחשוב מקביל (* דרוש למצב מחשוב מקביל בלבד).
   הערה: אוניברסיטאות רבות לרכוש ולתחזק את רישיונות קבוצה, כך שהתוכנה היא חופשית להורדה ושימוש על ידי מדענים כלולות.
2. התקן את תכנית SpheroidSizer מקובץ SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. שמור את קובץ zip במערכת הקבצים המקומי שלך.
   2. לפתוח את קובץ SpheroidSizer.
   3. שמור את הקבצים בספרייה / תיקייה ייעודית, אשר יכונה בהמשך כלtהוא "מדריך התקנה".
      הערה: SpheroidSizer נבדק בהרחבה על מערכת הפעלה Windows 7. הוא צפוי לעבוד על מערכות הפעלה חלופיות עם התאמות מינימליות (לא נבדקו).

3. הכנה לניתוח תמונה על ידי SpheroidSizer

1. לקבוע את הרזולוציה / קנה מידה תמונה של מערכת ההדמיה (בקנה מידה מוחלטת של התמונה במיקרון לכל פיקסל (מיקרומטר / pix)).
   הערה: אם גודלו של כל פיקסל על שבב המצלמה ידוע, בקנה מידה התמונה יכולה להיות מחושב כגודל פיקסל x ההגדלה אובייקטיבית (מיקרומטר / Pix). ניתן להשיג ערך זה מתוכנת ההדמיה מצוידת במיקרוסקופ כמטה משובץ או עם עזרה מיצרן מערכת הדמיה. ערך זה יידרש בשלב 4.6.
2. להמיר את כל פורמטי קובץ תמונת קניינית לפורמטים של קבצים המקובלים - TIFF, JPEG, ו פורמטים של קבצי תמונה נפוצה אחרים.
3. שם קבצי תמונה ולסדר directories (איור 5 א).
   הערה: התוכנה מסתמכת על הפריסה הנכונה של מבנה ספריות ושמות קבצים כדי לאתחל מחדש את התוצאות לפורמט צלחת:
   1. תן שם לקבצי התמונה בפורמט הבא: [שם צלחת] _ [שורה] [עמודה] [ארכה] או [שם צלחת] [רווח] [שורה] [עמודה] [ארכה]... [שורה] להלן סדר א"ב ו[ עמודה] כדלקמן בסדר המספרים.
      הערה: ניתן למצוא תוכנת שינוי שם אצווה אוטומטי זמינה באופן חופשי כדי לסייע למשתמשים בשלב זה.
   2. מסדרים את הספרייה / תיקייה המבוססת על הניסוי באופן הבא: כל ניסוי צריך להיות מדריך אחד. תחת הספרייה של כל ניסוי, לא אמור להיות תיקיות המשנה עבור כל נקודת זמן. מתחת לכל תיקיית נקודת זמן, לא אמורה להיות כל תמונות מכל הלוחות.
      הערה: על מנת שתוצאות הניתוח להיות מסודרים בצורה אופטימלית בתוצאות מעוצבות, אנו ממליצים לשמור על אותו מספר הספרות עבור כל מזהה ידי מילוי 0 על lEFT, למשל, נקודות זמן נקראות כמו 000H, 072H, ו144H.

4. ניתוח תמונה של spheroids ידי SpheroidSizer

1. MATLAB הפתוח, לאחר מכן פתח את "החלון הפקודה", הקלד cd '[מדריך התקנה]' ולחץ על [RETURN].
2. הקלד "SpheroidSizer1_0" ב" Command Window "ולחץ על [RETURN] כדי להפעיל את תכנית SpheroidSizer.
3. לחץ על לחצן "עיון" בחלון SpheroidSizer1.0 כדי לבחור את ספריית הניסוי המכילה את כל תמונות.
4. בחר "כלול תיקיות משנה" לעבור מתחת לשדה הטקסט "התיקייה" לעבד תיקיות תמונה מקוננות מרובות תחת הספרייה המיועדת.
   הערה: אם "כלול תיקיות משנה" לעבור לא נבחר, רק התמונות ישירות תחת הספרייה מעובדות, וכל תיקיות המשנה הם התעלמו.
5. בחר באפשרות "On-the-fly תצוגה" לחד פעמיתלהניח כל תמונה מפולחות על גבי תמונת המקור שלה לבקרת איכות כחישוב הוא להיות מוצא להורג.
   הערה: מהירות חישוב מהירה, אם אפשרות "On-the-fly תצוגה" לא נבחרה.
6. ציין "החלטה" (בקנה מידה תמונה / רזולוציה במיקרומטר / Pix) של התמונות ניתחו בתיבה, לתכנית להמיר כראוי מדידות של אליפטית מפיקסל למיקרומטר.
   הערה: כל התמונות באותה התיקייה או ניתח יחד יש לנקוט באותם מיקרוסקופ עם אותה המטרה, כך שהיקף תמונה / הרזולוציה נשארה קבועה לכל ניסוי.
7. משתמשים (אופציונליים) יכולים לעקוב שלב 5 להגדרות משתמש מוגדר מתקדמות.
8. לחץ על "מחשוב" כדי להתחיל את החישוב.
   הערה: התוכנה מבצעת בדיקה אוטומטית שם קובץ לפני שתמשיך לחישוב. אם תיבת הדו שיח מופיעה המציין - "שגיאה קיימת בקובץ", לחץ על "היציאה ולהראות רשימה של טעויות"ולתקן את השגיאות בשמות קבצים מופיעים (ראה שלב 3.3). לאחר מכן, לחץ על "מחשוב" כדי להתחיל את החישוב מחדש.
9. לחץ על כפתור "השהה" כדי להשהות את החישוב; וניתן לחדש חישוב על ידי לחיצה על אותו כפתור המראה על "המשך".
   הערה: "לוח התוצאות" מציג את "קובץ" "התיקייה", "נפח" (במ"מ ^3), "זמן" (במיקרומטר), "רוחב" (במיקרומטר), ו( תיבת סימון) "חוקית" לכל הספרואידים ניתחו (איור 5 ג). נפח מחושב על בסיס הציר נמדד גדול (אורך) וציר המשני (רוחב) (V = 0.5 * אורך * רוחב ^2). תיבת הסימון "חוקית" היא אופציה למשתמש לבחור אם הניתוח של התמונה הוא חוקי או לא חוקי, לאחר בקרת איכות, ראה שלב 6.

5. הגדרות משתמש מתקדמות

1. לחץ על לחצן "מתקדם" בSpheroidSizer1.0 חלון כדי להעלות את החלון מתקדם תצורות על מנת להתאים את הגדרות משתמש מוגדר (איור 5).
2. הזן את שמות הקבצים של עניין "פלט פורמט" ותיבות "פלט רשימה" בחלון מתקדם התצורות תחת "קלט".
3. הזן מספר בין "2-10" בתיבת "צמצום". זה מקדם לתוכנה כדי להקטין את גודל התמונה בחישוב על מנת לשפר את מהירות החישוב. ככל שמספר, מהר יותר את מהירות החישוב. ברירת המחדל "להפחית" מוגדר 10.
4. הזן את סיומת קובץ תמונה להיות-מעובד בתיבת "כלול סוג".
5. הזן את סיומות קבצי תמונה או סופים שלא הולכים להיות מעובד על ידי התכנית בתיבת "תכלול סוג" כדלקמן: "_crude.jpg".
6. בחר "ללא" עבור "מיוחד צבע" לעבד 8 ביט וcol 16 קצתאו תמונות כמו שצריך; בחר "קצת 12" עבור "מיוחד צבע" לעיבוד תמונות צבע 12 סיביות כראוי
7. בדוק "השתמש במחשוב מקביל" אם המחשב משמש לניתוח תמונה מצויד במעבדים מרובים ו / או מעבדים מרובות ליבות. אם זה נכון, ואז ללכת לצעד 5.7.1; אם לא, אז לדלג 5.7.1 צעדים ו5.7.2.
   הערה: שגיאה תתרחש אם המחשב נמצא בשימוש אינו תומך בתצורה שנבחרה.
   1. סמן את האפשרות "השתמש במחשוב מקביל" בחלון מתקדם התצורות.
      הערה: השתמש רק במצב המחשוב המקביל, כאשר 4 או יותר ליבות זמינות למחשב.
   2. תיבת הזן מספר 4-12 ב" # העובדים "(מחשוב ליבות).
      הערה: מספר זה חייב להיות שווה או פחות ממספר ליבות מחשוב במחשב של המשתמש. מרבי של 12 מוטל על ידי ארגז הכלים המחשוב המקביל MATLAB תומך במקסימום של 12 ליבות. כאשר מחשוב המקבילי להיותING להורג, מופיע תיבת הדיאלוג קטנה לשאול את המשתמש להמתין לחישוב המקביל לסיים; החישוב לא יכול להיות מושהה, וגם לא תכונת "On-the-fly תצוגה" הוצאתו להורג במצב מחשוב מקביל.

6. בקרת האיכות

1. לחץ על התא המתאים ב" טבלת תוצאות "כדי לאשר את גובה הגבול מדויק של אליפטית בתמונות מנותחות,
   הערה: התמונות המקוריות ובקרת האיכות תופיע בצד ימין לבדיקה. המשתמש יכול לבחון את כל התמונות ברצף באמצעות החץ למטה במקלדת.
2. מקד את הגבול של אליפטית בתמונה שנבחרה באמצעות שני הכלים הבאים, במידת צורך:
   1. לחץ על הכפתור "אתחול ידני" כדי להציג את התמונה המקורית. לאחר מכן לחץ והחזק העכבר ימני מחוץ אליפטית ולגרור את כלי האליפסה כדי לכסות אליפטית בתמונה המקורית.
      הערה:אלגוריתם ctive-קונטור יוזם באמצעות קווי המתאר שהוגש משתמש ומבצע להתכנס על המתווה אליפטית הרצויה. "לוח התוצאות" יתעדכן באופן אוטומטי עם התוצאות חדשות. האפשרות "האתחול ידני" מאפשרת למשתמש לספק אתחול ידני לפעיל גובה.
   2. לחץ על לחצן "יד צייר" כדי להציג את התמונה המקורית. לאחר מכן השתמשתי בעכבר או מסך מגע אפשר לשרטט את הגבול של אליפטית בדיוק.
      הערה: קווי המתאר זו נמדד ישירות כדי לייצר צירים ראשיים ומשניות, המתעדכנים ב" לוח התוצאות ". כלי "יד צייר" משמש רק כאשר באפשרות "ידני אתחול" לא מצליחה להתכנס על הגבול הרצוי של אליפטית.
3. הסר את הסימון מתיבת הסימון בעמודה "חוקית" בשורה המתאימה של "לוח התוצאות", כאשר תמונה אינה מכילה כל אליפטית תקף בעת הבדיקה. "; תווית לא חוקית "מופיעה בפינה השמאלית העליונה של תמונת בקרת האיכות. אם "חוקי" הוא לא מסומן, הערכים של כל המדידות הם ריקים לאליפטית בקבצי תוצאות מעוצבות ופלט המיוצאים.
   הערה: קיצורי המקשים הבאים זמינים לשימוש ב" טבלת תוצאות ":" חץ למטה "לתמונה הבאה; "V" בתוקף / לא חוקי; "מ '" לאפשרות "אתחול ידני" ו "h" לאפשרות "צייר יד".

7. שמירה ויצוא של נתונים

1. לחץ על לחצן "יצוא המחקר" בחלון SpheroidSizer1.0 לייצא את מצב הביניים של הניתוח, אם המשתמש צריך כדי לצאת מהתוכנה לפני שסיימתי את הפרויקט. ציין את השם וספרייה של הקובץ כדי להינצל.
2. לחץ על לחצן "יבוא מחקר" כדי להחזיר את תוצאת מצב הביניים לעיל מ" יצוא מחקר "ונמשיך work על זה.
   הערה: קבצי מצב הביניים הם בפורמט טבעי של MATLAB (מחצלת.) ואינם ניתן לקריאה באופן ישיר על ידי כל תוכנות אחרות. תכונת בטיחות מובנהית בתוך התוכנה הופכת את היצוא אוטומטי של הפרויקט הפתוח למקרה שהתכנית יוצאת שלא בכוונה. בעת צורך, המשתמש יכול למצוא את הקובץ הזה, ששמה מתחיל ב "~ tmp" המכיל את חותמת הזמן המקבילה ב[ מדריך ההתקנה].
3. לחץ על "תוצאות פורמט" בחלון SpheroidSizer1.0 כדי לשמור את התוצאות.
   הערה: שתי צורות של תוצאות נשמרות בספרייה של הניסוי. ניתן להגדיר שמות הקבצים מיוצאים בחלון מתקדם התצורות (ראו שלב פרוטוקול 5.2). קובץ הפלט בפורמט הוא שולחן שמסומן כרטיסייה שמארגן את ערך הנפח לפורמט הצלחת המקורי לפי הסדר של מספר לוחית עולה עבור כל נקודת זמן; וכל נקודות הזמן מאורגנות בבסדר עולה (איור 5D). O הרשימהקובץ utput הוא שולחן שמסומן כרטיסייה המכיל את כל המדידות בצורה של רשימות ממוספרות (איור 5E).

Representative Results

SpheroidSizer נועד לייצר זיהוי אוטומטי, סימון ומדידה של הספרואידים 3D, עם עבודה מופחתת להפליא והתייעלות בחריפות לכמויות גדולות של תמונות. איור 1 א מציג את תהליך העבודה של SpheroidSizer. צעדי חישוב הליבה כוללים אתחול אוטומטי, אלגוריתם מתאר פעיל וכימות גובה. לאחר חישוב אוטומטי, תכונת בקרת האיכות משתמשת בשילוב של "אתחול ידני" וכלים "צייר יד" כדי להציל את כל פילוח מושלם. איור 1 מדגים את אלגוריתם מתאר מפורט האוטומטי הפעיל. שלב האתחול (איטרציה ה 0) מנצל את הפעולות עיבוד תמונה בסיסיות כדי ליצור גודל ומיקום משוערים של אליפטית וליצור קווי המתאר ייזום כדוריים עם גודל מוערך. קווי המתאר ייזום הזנות לתוך אלגוריתם מתאר הפעיל. בתורו סובב להתאים לפי התמונה המקומיתשיפוע ועקמומיות צורה. אלגוריתם מתאר הפעיל מסיים כאשר הגובה מתייצב (מתכנס), כלומר 477 חזרות לתמונה זו, או כאשר המספר המרבי המוגדר מראש של חזרות הוא הוצא להורג. בדוגמא זו, את קווי המתאר האתחול מוגדל במכוון, כדי להפגין את האלגוריתם טוב יותר. במציאות, האתחול הוא בדרך כלל קרוב מאוד לגבול בפועל והרבה פחות חזרות יש צורך באלגוריתם להתכנס. בהמשך לכך, האלגוריתם לוקח מדידות morphometric של הגבול אליפטית זוהה. הצירים הראשיים ומשניות של אליפטית נמדדים באמצעות ארגז הכלים MATLAB עיבוד תמונה (איור 1 ג). הציר המרכזי מוגדר כקטע הקו המחבר בין זוג אחד של הנקודות המרוחקות ביותר על קווי המתאר, הנקרא אורך (L). הציר המשני מוגדר כקו הארוך ביותר בניצב לציר המרכזי, המכונה לרוחב (W). במקרה זה, הערכים של L ו-W קרובים מאוד מאזאליפטית היא כדורית. היקף אליפטית מחושב כV = * L * 0.5 W ^2.

אחד המאפיינים של SpheroidSizer הוא זיהוי האוטומטי של גבול הספרואידים אפילו בתמונות עם רקע אחיד או רועש ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל (איורים 2 ב-D). עיבוד חישוביים בתמונות שדה בהירות הוא סובל לעתים קרובות על ידי רקע אחיד, שמטעה את שיטות המבוססים על ערכי סף אדפטיבית כדי להפיק תוצאות thresholding לא רצויות. הבעיה בולטת במיוחד כאשר צלחות רב גם משמשות וקירות של הבארות עשויים ליצור אפקטי הצללה על התמונות. עם זאת, מכיוון שאלגוריתם מתאר הפעיל אינו רגיש לשינוי ההצללה ההדרגתי ברקע, הוא מסוגל לזהות פילוח אליפטית בתמונות האלה בשדה בהירות עם אתחול נכון. איור 2 מראה כמה דוגמאות של תמונות עם רקע אחיד, או רועש, כמו לא אחיד תאורה (איור 2 (איור 2C) או ליבת נמקים (איור 2 ד). עם אלגוריתם מתאר פעיל אוטומטי, SpheroidSizer משרטט הספרואידים אלה במדויק בכל התמונות הללו, כפי שמוצג בקווי המתאר האדומים בפנל התחתון של כל דמות.

תכונת בקרת האיכות של SpheroidSizer היא מפתח לעבודת תפוקה גבוהה. "האתחול הידני" וכלים "צייר יד" הם כלים חינם בעל הערך עבור יישום זה. בין מאות או אלפי תמונות, זה בלתי נמנע כי האלגוריתם האוטומטי הוא לא מסוגל לזהות בצורה נכונה הספרואידים בכמה תמונות. כפי שמודגם באיור 3 א, כאשר זיהוי לא נכון של אליפטית נגרם עקב שלב האתחול, גודל לא תקין כלומר או מיקום של קווי המתאר הייזום בתמונה (פנל עליון), באפשרות "ידני אתחול" עובדת על ידי המאפשר למשתמש כראוי להגדיר את המיקום וגודל של spherOID ידני (פנל תחתון). היא מפעילה אלגוריתם מתאר הפעיל ליזום עם קווי המתאר מוגדרים באופן ידני ולבצע להתכנס על המתווה הרצויה. לתמונות קשות האלה כמו התמונה המקורית באיור 3 ב, אליפטית ממוקמת ברקע מסיח את הדעת ורועש. SpheroidSizer הוא לא הצליח לזהות את אליפטית כראוי על ידי השיטה האוטומטית (פנל עליון) או על ידי כלי "ידני אתחול" עם אתחול נכון (פנל באמצע). במקרה זה, באפשרות "צייר יד" ניתן להשתמש כדי לצייר באופן ידני את קווי המתאר של אליפטית כפי שמודגם בפנל התחתון. התכנית משתמשת בגבול מוגדר על ידי המשתמש כדי למדוד את הצירים הראשיים ומשניות של אליפטית ולחשב את עוצמת הקול. כל התוצאות מתוקנות תיכללנה מיידית "טבלת תוצאות" וניתן לייצא בהתאם.

כדי לקבוע את הביצועים של SpheroidSizer בערכות נתונים גדולות יותר, אנו משווים את זמן פעולה לראשונה על ידיניתוח אותו הסט של 288 תמונות באמצעות מדידות 1) ידניות עם תוכנה מסופקת על ידי יצרן מיקרוסקופ; 2) SpheroidSizer עם מחשב נייד רגיל בעל ליבה אחת; ו 3) SpheroidSizer עם תחנת עבודה של ביצועי מחשוב מקבילים מרובות ליבות. המדידות ידניות לעקוב אחר הפרוטוקול הטיפוסי שלנו לפני פיתוח התוכנה: האורך והרוחב של כל אליפטית נמשכים ביד ונמדדו באמצעות תכנית הספק (כפי שניתן לראות קווים האדומים בפנל העליון של איור 4 א); לאחר מכן עותקי המשתמשים למטה את ערכיה של המדידות. SpheroidSizer מעבד כל תמונה על ידי יצירת הגבול אליפטית (כפי שמוצג קווי המתאר האדומים בפנל התחתון של איור 4 א), מדידת האורך הראשי ומשניות הצירי, ויצוא התוצאות בגיליונות אלקטרוניים. כפי שניתן לראות בטבלה 1, המבוסס על החישוב מ288 תמונות, זה לוקח בממוצע 31.67 שניות כדי למדוד אליפטית אחד לכל תמונה באופן ידני; בזמן שהוא לוקח רק פחות מ -2 שניות וSpheroidSizer 160 #; בעת הפעלה על מחשב נייד רגיל בעל ליבה אחת; ושנייה פחות מ 1 כאשר פועלים על תחנת עבודה של ביצועי 12 ליבות. לכן, ניתוח תמונה הוא מעל 18x מהר יותר לכל תמונה באמצעות SpheroidSizer מאשר מדידות ידניות. זה מפחית באופן דרמטי עבודה כאשר יותר מאלף תמונות מנותחות. בשלב הבא, אנו משווים את השונות במדידות של הספרואידים 24 שמוצגים באיור 4 א בין מדידות ידניות וSpheroidSizer. 24 הספרואידים נמדדים שלוש פעמים על ידי שני השיטות; וסטיית התקן של כל אליפטית פרט מחושבת. כפי שניתן לראות באיור 4 ב ', סטיית התקן מSpheroidSizer (קו ונקודות ירוקים) הוא קרוב לאפס פרט לשלושת הספרואידים שמתוקנים בשלב בקרת האיכות, שעדיין מראה סטיית תקן קטנה יותר מאלה של שיטת המדידה הידנית. כל אלה מצביעים על כך שSpheroidSizer מבצע את ניתוח תמונה בצורה יעילה יותר ובאופן מדויק.

e_content "> ערכנו את מסך בסמים באמצעות הספרואידים BON-1 גידול 3D אנושיים כדי לגלות אילו תרכובות בשילוב עם מעכב Hsp90 הם המועמדים הפוטנציאליים לבדיקת ההשפעות אנטי גידול in vivo. הספרואידים גידול BON-1 3D אדם היו מבוגרים על צלחות 96 היטב מצופה agarose כפי שתואר במאמר הקודם ^15. שמונה תרכובות שונות עם שישה דילולים סדרתי בתוספת תקשורת ורכב הוקרנו על האפקטים היחיד וקומבינטורית שלהם עם 10 ננומטר ו20 מעכב Hsp90 ננומטר בכפילויות בהתאמה. שני הספרואידים היו משמש עבור כל ריכוז של התרכובת בודדת או התרכובות המשולבות. ארבע צלחות 96 היטב עם כולל 384 הספרואידים היו בשימוש. כל הספרואידים היו הדמיה ב 0, 72, 144, 168, ו192 שעה. כולל של 1,920 תמונות יוצרו מניסוי זה. זה לקח SpheroidSizer רק 30 דקות כדי להשלים את האנליזה חישובית של 1,920 תמונות עם 50 דקות נוספות לבקרת האיכות ויצוא נתונים. spheroidSizer מאיץ את תהליך ניתוח התמונה מאוד. איור 5A תערוכות צילום מסך של הסדרי התיקייה ושמות קבצים לצורך הניסוי הזה כדוגמא לשלב פרוטוקול 3.3. איורים 5 ב-E מראה את צילומי המסך של החלונות קופצים ניתוח תמונה ותוצאות . באמצעות SpheroidSizer כאיורים לפרוטוקול שלבים 4, 5, ו -7 לוקחים את הכרכים של הספרואידים 3D מטבלת התוצאות מעוצבות מיוצאות מSpheroidSizer, עשינו גרפים - צמיחה של הספרואידים גידול 3D על טיפולי מתחם לעומת הזמן של טיפולים. שני גרפים נציג מניסוי זה מוצגים באיור 5F ו5G. 5F איור מראה כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 וcladribine (קו ירוק) לעכב את הצמיחה של 3D spheroids יותר מהטיפול היחיד של מעכב Hsp90 (קו סגול) או cladribine (קו כתום), טוען כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 ו cladribine יכול להיות EF אנטי הסרטניfects in vivo. איור 5G מראה כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 ואדריאמיצין (קו ירוק) לא לעכב את הצמיחה של 3D spheroids יותר מהטיפול היחיד של אדריאמיצין (קו כתום) או מעכב Hsp90 (קו סגול), המצביע על כך טיפולים משולבים של מעכב Hsp90 ואדריאמיצין לא יכולים להיות השפעות אנטי סרטניים בגוף חי. ניסוי זה עזר לנו טוב יותר לבחור את התרכובות כדי לבדוק ההשפעות האנטי הסרטני שלהם in vivo ו SpheroidSizer הוא המפתח לניתוח נתוני ניסוי הזריז.

טבלה 1. השוואה של זמן פעולה בניתוח תמונה בין מדידות ידניות וSpheroidSizer בעת ניתוח אותה הקבוצה של 288 תמונות. אנא ג ללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

א) איור יישום תוכנת קוד פתוח למדידת הגודל של אליפטית זרימת העבודה הליבה של היישום ב ') של אלגוריתם מתאר הפעיל בשלבים שונים של איטרציה - איור 1 SpheroidSizer.... שים לב שקווי מתאר האתחול (איטרציה 0) הורחב במכוון על מנת להציג את האלגוריתם. C) מדידות האורך צירי הראשיות ומשניות וחישוב הנפח על ידי SpheroidSizer. L - ציר עיקרי: פעילות הקו המחבר בין זוג אחד של נקודות המרוחקות ביותר על קווי המתאר (המכונה אורך); W - ציר קטין: הקו הארוך ביותר בניצב לציר המרכזי (המכונה 'רוחב).

class = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד">
תמונות תמונות תמונות איור 2. נציג תוצאות מהפילוח האוטומטי של SpheroidSizer, מראה חוסן נגד תנאי תמונה שונים.) תמונות באיכות טובה אופיינית. ב ') עם בהירות והניגודיות שונות. C) עם להסיח פסולת. ד) הספרואידים עם ליבת נמקים . תמונות בפנל העליון של כל דמות הן המקור / תמונות מקוריות; תמונות בפנל התחתון של כל דמות הן תמונות בקרת האיכות; ואת קווי המתאר האדומים הוא הפילוח אליפטית שצויר על ידי חישוב אוטומטי.

"Src =" hres.jpg / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
איור 3. איור של "האתחול הידני" ו "יד צייר" כלים.) אפשרות "ידני אתחול" מאפשרת הציור של צורת אליפסה מתאימה ברחבי אליפטית לאתחול, כאשר פילוח אליפטית מדויק מתרחש לאחר האתחול האוטומטי. B ) כלי "יד לצייר" מאפשר מדויקת יד ציור של גבול אליפטית, כאשר פילוחים אליפטית מדויקים להתרחש עם אתחול הן אוטומטי וידני. הקו הכחול סביב אליפטית מציג את קווי המתאר האתחול; את קווי המתאר האדומים הוא הגבול אליפטית המזוהה. שים לב שאליפטית ב" אתחול ידני "ב) ואליפטית ב" צייר יד" בבוקר) מוגדל במכוון, כדי להפגין טוב יותר את הכלים.

איור 4. השוואה של ביצועי ניתוח תמונה בין SpheroidSizer ומדידות ידניות בעת ניתוח אותה הקבוצה של 24 תמונות. א) הספרואידים נציג כדי להראות עד כמה את האורך והרוחב של הספרואידים נקבעים על ידי מדידות ידניות וSpheroidSizer. 24 תמונות למעלה להכיל אורך / רוחב המצויר ביד של כל אליפטית בקווים אדומים באמצעות מדידות ידניות; נמוכות 24 תמונות (אותו 24 תמונות) מכילות גבול אליפטית מצויר במחשב בקווים אדומים באמצעות SpheroidSizer. B) סטיית התקן של אורך או רוחב של שלוש מדידות בכל אליפטית בודד.

איור 5. דוגמא מייצגת של ניצול של אליפטיתסייזר במסך סמים - ניתוח תמונה בתמונות 'הספרואידים שנאספו ממסך סמים באמצעות הספרואידים גידול BON-1 3D צילום מסך של הסדרי התיקייה ושמות קבצים עבור פרויקט זה ב') צילום מסך של מתקדם).. חלון תצורות בSpheroidSizer. C) צילום מסך של חלון SpheroidSizer1.0 עם שולחן תוצאות מוצג. ד ') צילום מסך של קובץ הפלט בפורמט המיוצא מSpheroidSizer. ה) צילום מסך של קובץ פלט הרשימה המיוצא מSpheroidSizer. F) צמיחה של הספרואידים גידול 3D על הטיפולים עם מעכב Hsp90 וcladribine צמיחה. G) של הספרואידים גידול 3D על הטיפולים עם מעכב Hsp90 ואדריאמיצין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ P>

Discussion

מחקר זה מציג תכנית מהירה, גמישה, יעילה ואוטומטית - SpheroidSizer לקביעה מדויקת של הגודל של הספרואידים גידול 3D. SpheroidSizer הוא קל לשימוש ודורש קלט משתמש מינימאלי. השלבים הקריטיים ביותר לריצה מדויקת, חלק והמוצלח של SpheroidSizer כוללים: שהספרואידים הם צילמו במרכז השדה בלי לגעת בקצה של באר; כל הקבצים שנתחו יחד כפרויקט אחד צריכים להיות צילמו באותם מיקרוסקופ עם אותה המטרה; כל הקבצים להיות מנותחים נקראים בצורה נכונה ומסודר כפי שמצוינים בפרוטוקול; והגדרות המוגדר על ידי משתמש נכונים הם נכנסו לפני החישוב.

היתרונות של SpheroidSizer כוללים את יכולתו לסבול את שינוי רקע הדרגתי בתמונה, כמו גם ליצירת קווי המתאר חלק שמתאימות לצורות כדוריות הכלליות של הספרואידים ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל. ביצועים של פעילגובה יכול להיות בסכנה בשני מצבים: אתחול עני, או נוכחות של קצוות מקומיים אחרים להסיח מהגובה הרצוי. במיוחד במקרים שנבדקו, המצב השני לפעמים קורה כאשר ליבת נמקים של אליפטית גדול מושך אליו את קווי המתאר הפעילים וכתוצאה מכך גובה קטן יותר שדווח. ראוי לציין כי שיטות המבוסס על סף אוטומטי אחרות סובלות גם במצב זה, אלא אם כן לסף מוגדר באופן ספציפי ביד. התוכנה לכן מעבירה קדימה מאמץ כדי לסייע למשתמשים לזהות ולתקן פילוח נפרץ על ידי אספקת תכונות בקרת איכות קלה. אם שגיאת פילוח קורה מאתחול עני, שימושים יכולים להשתמש בכלי "ידני אתחול" כדי לעקוף את האתחול האוטומטי. כאשר איכות תמונה ירודה מדי לקווי מתאר פעילים, משתמשים יכולים בקלות "יד צייר" את קווי המתאר שמזין לכימות. תוכנה הקיימת כגון CellProfiler יכולה להיות מותאמת ליישום זה בfashio חצי אוטומטי-n. זרימת העבודה יכולה להיות מסורבלת, כאשר כמויות גדולות של תמונות בתנאי הדמיה שונות מוצגות או כאשר קבוצת משנה של תמונות צריכה התערבות אנושית יותר למדוד בצורה נכונה. SpheroidSizer מספק חבילת All-in-One עבור חישוב ובקרת איכות לניהול זרימת עבודה ניתוח תמונת תפוקה גבוהה.

SpheroidSizer כיום מוגבל לאיתור אליפטית אחת לכל תמונה ורק מודד את האורך הצירי של אליפטית. ניתן להרחיב את התכנית לתמיכה בכימות נוסף לפי צורך על ידי חוקרים כגון כימות על הספרואידים עם ליבת נמקים, גילוי הספרואידים מרובים בתמונה אחת או ניטור צורת הספרואידים. יתר על כן, ניתן לשנות את התכנית כדי לזהות ולמדוד את הגודל של הגידולים נכרת מבעלי חיים או בני אדם, אשר בהחלט יהיו מועילה לחוקרים בעת ביצוע in vivo טרום קליני או מחקר קליני. לאחר עיבוד של הספרואידים זוהו גם יכול להיחקר מטרהing בהפחתת מאמץ אנושי הנדרש לבקרת איכות ועוד שיפור תפוקה. SpheroidSizer הוא יישום ניתוח תמונה כללי להספרואידים גידול 3D, המיוצרים מכל סוגי תאים, ולכן ניתן להשתמש בו על ידי קהילת חקר הסרטן רחבה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software