Hög kapacitet bildanalys av tumör spheroids: Ett användarvänligt program för att mäta storleken på sfäroider automatiskt och korrekt

Summary

Vi presenterar en hög genomströmning bildanalys programvara för att mäta storleken på tredimensionella tumör sfäroider avbildas med ljusfält mikroskopi. Denna applikation ger ett snabbt och effektivt sätt att undersöka effekterna av terapeutiska läkemedel på sfäroider, vilket är till nytta för forskare som vill använda spheroids i drogskärmar.

Abstract

Det ökande antalet ansökningar av tredimensionella (3D) tumör spheroids som en modell för läkemedelsforskning in vitro kräver anpassning till storskalig screening format i varje steg av en drog skärm, inklusive storskaliga bildanalys. För närvarande finns ingen klar att använda och fri bildanalysmjukvara för att möta detta stort format. De flesta befintliga metoder involverar manuellt rita längden och bredden på de avbildade 3D spheroids, vilket är en mödosam och tidskrävande process. Denna studie presenterar en hög genomströmning bildanalys programvara - SpheroidSizer, som mäter den större och mindre axiell längd av de avbildade 3D tumör spheroids automatiskt och noggrant; beräknar volymen för varje enskild 3D tumör spheroid; matar sedan ut resultaten i två olika former i kalkylblad för enkla manipulationer i den efterföljande dataanalys. Den största fördelen med denna programvara är dess kraftfulla bildanalys program som äranpassad för ett stort antal bilder. Det ger hög genomströmning beräkningar och kvalitetskontroll arbetsflöde. Den beräknade tiden för att bearbeta 1.000 bilder är ca 15 min på ett minimalt konfigurerad bärbar dator, eller ca 1 min på en multi-core prestanda arbetsstation. Det grafiska användargränssnittet (GUI) är också utformad för enkel kvalitetskontroll, och användare kan manuellt åsidosätta datorresultat. Nyckeln metod som används i denna programvara är anpassad från den aktiva kontur algoritmen, även känd som ormar, som är speciellt lämplig för bilder med ojämn belysning och bullrig bakgrund som ofta plågar automatiserad bildbehandling i hög genomströmning skärmar. Den kostnadsfria "Manuell Initiera" och "Hand Draw" verktyg ger flexibilitet att SpheroidSizer att hantera olika typer av sfäroider och olika bildkvalitet. Denna high-throughput bildanalys programvara minskar anmärkningsvärt arbete och snabbar upp analysprocessen. Att genomföra detta program är beneficial för 3D tumör sfäroider att bli en rutin i modell vitro för drog skärmar i industri och akademi.

Introduction

Tredimensionell (3D) tumör sfäroider är "sfäriskt symmetriska aggregat av tumörceller som är analoga med vävnader, utan artificiellt substrat för cellvidhäftning" ^1-3. Den cytologi och morfologi av tumören sfäroider bättre härmar vivo tumörvävnad som organisation och mikromiljöer än monolager tvådimensionella (2D)-celler i. 3D tumör sfäroider har blivit en praktisk modell för hög kapacitet visningar av anti-cancer terapeutiska droger eller undersöka effekten av läkemedelskandidater in vitro innan in vivo djur eller kliniska tester ^4. Kliniskt, är effekten av eventuella läkemedel mot cancer behandling utvärderas baserat på minskad tumörtillväxt. Analogt kan spheroid volym användas som ett mått på effektiviteten för in vitro-studier cancerläkemedel. Sfäroid volym (V = 0,5 * Längd * Bredd ²⁾ bestäms utifrån den större och mindre axiell längd (mer känd som längd och bredd)av sfäroiderna ^{6, 7.} De flesta forskare har att rita manuellt längd och bredd på varje sfäroid, ofta med hjälp av programvara som erbjuds av mikroskopi företag och säljs tillsammans med avbildningsinstrument. Denna teknik blir problematiskt när hög kapacitet drogskärmar utförs och mer än hundra bilder produceras. Några aktuella studier rapporterade användningen av öppna källbildanalysprogram verktygslådor såsom CellProfiler ^8-10 och ImageJ ¹¹ utveckla rudimentära segmente rutiner / makron som involverade belysning korrigering och enkel tröskel. Dessa rutiner behöver ofta åter justeras för olika partier av bilder beroende på belysningen skick och bildkontrast förändring; därför kan dessa mjukvarupaket inte uppfyller robustkravet för bildanalys med hög genomströmning. Friedrich och medarbetare (2009) använt proprietär programvara för att mäta sfäroid volym semi-automtiskt ^5. Den metod som beskrivs i Monazzam och hans kollegors papper ¹⁰ var en semi-automatisk metod för att mäta sfäroid storlek bara för ett litet antal bilder. Därför finns det ett tydligt behov av robusta, flexibla, automatiserade och färdiga att använda bild analysverktyg för 3D tumör spheroids.

I denna studie beskriver vi SpheroidSizer - en MATLAB-baserad och open-source program för att mäta storleken på tumör sfäroider automatiskt och korrekt. SpheroidSizer är utformad för att behandla många olika partier av bilder i 3D spheroids i samma session. Använda den aktiva konturalgoritmen ^12-14, kan SpheroidSizer tolerera bildkontrastförändringar, kraftigt ignorera gradvis förändring av bakgrundsbelysningen och erkänna spheroids i bilden. Det kan också tolerera många vanliga artefakter, till exempel, skräp, härstammar från provet. Arbetsflödet är utformad så att användarna kan utföra kvalitets control under eller efter beräkning. Manuellt överskrivning av analysresultatet kan lätt genomföras på plats. Att dra nytta av den parallella beräkningar verktygslåda, kan analyshastigheten ytterligare av att samordna flera datorer kärnor att arbeta på beräkningen samtidigt på en användares dator. Dessutom SpheroidSizer matar ut resultaten i två olika former för att möjliggöra enkel gränssnitt med nedströms analysverktyg.

Protocol

1. 3D tumör sfäroider bildas, läkemedelsbehandlingar och bildsamling utförs enligt beskrivningen i vår tidigare papper ^15.

2. Installation av programvara

1. Installera licensierad MATLAB programvara på datorn som används för bildanalys. Följande verktygslådor från MATLAB krävs också att installeras - Signalbehandling verktygslåda, bildbehandling verktygslåda, och Parallel Computing Toolbox * (* behövs för parallella beräkningar läge).
   OBS: Många universitet köpa och underhålla grupplicenser så att programmet är gratis att laddas ner och användas av anknutna forskare.
2. Installera SpheroidSizer programmet från SpheroidSizer.zip fil (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. Spara zip-filen på din lokala filsystemet.
   2. Packa upp SpheroidSizer filen.
   3. Spara filerna i en angiven katalog / mapp, som senare kommer att kallas than "Installation Directory".
      OBS: SpheroidSizer har testats på en Windows 7-operativsystemet. Det förväntas att arbeta med alternativa operativsystem med minimala justeringar (ej testat).

3. Förberedelser för bildanalys av SpheroidSizer

1. Bestäm bildskalan / upplösningen för bildsystem (absolut skala av bilden i mikrometer per pixel (nm / pix)).
   OBS: Om storleken på varje pixel på kamerachip är känd, kan bildskalan beräknas som objektivförstoring x pixelstorlek (nm / pix). Detta värde kan erhållas från bildbehandlingsprogram utrustad med mikroskopet som inbäddad metadata eller med hjälp av avbildningssystemleverantören. Detta värde kommer att krävas i steg 4.6.
2. Konvertera alla proprietära filformat till de accepterade filformat - TIFF, JPEG, och andra vanliga filformat.
3. Namnge bildfiler och ordna directories (Figur 5A).
   OBS: Programmet bygger på den rätta layouten på katalogstruktur och filnamn för att formatera resultaten i plattformat:
   1. Namnge bildfiler i följande format: [plattnamn] _ [rad] [kolumn] [tillägg] eller [tallrik namn] [mellanslag] [rad] [kolumn] [förlängning]... [V] följer den alfabetiska ordning och [kolumn] följer den nummerordning.
      OBS: Fritt tillgänglig automatisk batch döpa programvaran finns för att hjälpa användare i det här steget.
   2. Ordna katalogen / mapp baserad på försöket på följande sätt: Varje experiment bör ha en katalog. Under varje experiment katalog, bör det finnas underkataloger för varje tidpunkt. Under varje tidpunkt underkatalog, bör det finnas alla bilderna från alla plattorna.
      OBS: För att analysresultaten skall optimalt sorterade i formaterade resultat, föreslår vi att behålla samma antal siffror för varje identifierare genom att fylla 0 s på left, till exempel, är tidpunkter namnges som 000h, 072H och 144H.

4. Bildanalys av sfäroiderna genom SpheroidSizer

1. Öppna MATLAB, öppna sedan "Command Window" Skriv cd "[Installation Directory]" och tryck på [RETURN].
2. Skriv "SpheroidSizer1_0" i "Command Window" och tryck på [RETURN] för att starta SpheroidSizer programmet.
3. Klicka på "Bläddra"-knappen i SpheroidSizer1.0 fönstret för att välja experimentet katalog som innehåller alla bilder.
4. Markera "Inkludera undermappar" växla under "Mapp" textfält för att bearbeta flera kapslade bild mappar under den angivna katalogen.
   OBS: Om "Inkludera undermappar" toggle är inte utvalda, bara bilderna direkt under katalogen bearbetas, och alla undermappar ignoreras.
5. Välj "On-the-fly display" för att displägger varje segmenterad bild på toppen av sin källbild för kvalitetskontroll som beräkningen utförs.
   OBS: Beräkningshastigheten är snabbare om inte väljs "On-the-fly displayen" alternativet.
6. Ange "Resolution" (bildskala / upplösning i pm / pix) av de analyserade bilderna i rutan för programmet att korrekt konvertera sfäroiden mätningar från pixel till um.
   OBS: Alla bilder i samma mapp eller analyseras tillsammans bör tas under samma mikroskop med samma syfte, så att bildskalan / upplösning är konstant för varje experiment.
7. (Valfritt) användare kan följa steg 5 för avancerade användardefinierade inställningar.
8. Klicka på "Beräkna" för att starta beräkningen.
   OBS: Programvaran genomför ett automatiskt filnamn kontroll innan du går vidare till beräkningen. Om en dialogruta dyker upp som anger - "Fel finns i filnamn", klicka på "Exit och visa fellista"och åtgärda felen i noterade filnamn (se steg 3.3). Klicka sedan på "Beräkna" för att starta beräkningen igen.
9. Klicka på "Paus"-knappen för att göra paus i beräkningen; och beräkning kan återupptas genom att klicka på samma knapp som visar "Continue".
   OBS: "Resultattabell" visar "Folder", "File", "Volume" (i mm ^3), "Längd" (i mikrometer), "Width" (i mikrometer), och "Giltig" (kryssruta) för alla de analyserade sfäroider (fig 5c). Volymen beräknas utifrån den uppmätta storaxeln (längd) och lillaxeln (bredd) (V = 0,5 * Längd * Bredd ^2). Den "Giltig" kryssrutan är ett alternativ för användaren att välja om analysen av bilden är giltig eller ogiltig efter kvalitetskontroll, se steg 6.

5. Avancerade användardefinierade inställningar

1. Klicka på knappen "Avancerat" i SpheroidSizer1.0 fönstret för att få upp den avancerade fönstret Konfigurationer för att anpassa användardefinierade inställningar (Figur 5B).
2. Ange filnamnen av intresse i "Format Output" och "List Output" rutor i Avancerade Konfigurationer fönstret under "Input".
3. Skriv in ett nummer från "2-10" i "Minska" rutan. Detta är en koefficient för programvaran för att minska bildstorleken i beräkningen för att förbättra beräkningshastigheten. Ju högre värdet är, desto snabbare beräkningshastighet. Standard "Minska" är satt till 10.
4. Ange till-vara-behandlade bild filändelsen i "Inkludera typ" låda.
5. Ange tillägg för bildfiler eller ändelser som inte kommer att behandlas av programmet i "Uteslut typen" rutan enligt följande: "_crude.jpg".
6. Välj "Ingen" för "Special Color" för att bearbeta 8 bitars och 16 bitars coleller bilder korrekt; välj "12 bit" för "Special Color" för att bearbeta 12-bitars färgbilder ordentligt
7. Kontrollera "Använda Parallel Computing" om datorn används för bildanalys är utrustad med flera processorer och / eller multi-core processorer. Om detta är sant, sedan till steg 5.7.1; om inte, så hoppa över steg 5.7.1 och 5.7.2.
   OBS: Ett fel inträffar om den dator som används inte stödjer den valda konfigurationen.
   1. Markera "Använd Parallel Computing" i den avancerade fönstret Konfigurationer.
      OBS: Använd endast den parallella beräkningar läge när 4 eller fler kärnor finns tillgängliga för datorn.
   2. Skriv in ett nummer 4-12 i "# Workers" (dator kärnor) rutan.
      OBS: Detta nummer måste vara lika med eller mindre än antalet datorer kärnor i användarens dator. Maximalt 12 tas ut av MATLAB Parallel Computing Toolbox stödjer maximalt 12 kärnor. När parallella beräkningar är attning avrättades, en liten dialogruta som ber användaren att vänta på den parallella beräkningar till slut; beräkningen kan inte pausas, och inte heller är "On-the-fly display"-funktionen som exekveras parallellt datorläge.

6. Kvalitetskontroll

1. Klicka på motsvarande cell i "Resultattabell" för att bekräfta den exakta gränsen konturen av en sfäroid i de analyserade bilderna,
   OBS: De ursprungliga och kvalitetskontroll bilder kommer att dyka upp på höger sida för granskning. Användaren kan granska alla bilder i sekvens med hjälp av nedåtpilen på tangentbordet.
2. Förfina gränsen för sfäroiden på den valda bilden med hjälp av följande två verktyg, om det behövs:
   1. Klicka på "Manual Initiera" för att visa den ursprungliga bilden. Klicka sedan på och håll musen precis utanför sfäroid och dra ellipsen verktyget för att täcka sfäroid på den ursprungliga bilden.
      OBS: enctive-kontur algoritm initierar använder användar lämnat kontur och kör för att konvergera på önskad sfäroid kontur. Den "Resultattabell" kommer automatiskt att uppdateras med de nya resultaten. Den "Manuell Initiera" verktyget tillåter användaren att manuellt ge initiering för aktiv-kontur.
   2. Klicka på knappen "Hand Draw" för att visa den ursprungliga bilden. Använd sedan musen eller en touch aktiverad skärm att exakt dra gränsen för sfäroid.
      OBS: Denna översikt är direkt mätas för att skapa större och mindre axlar, som uppdateras i "Resultattabell". Den "Hand Draw" verktyg används endast när "Manual Initiera" verktyget inte konvergera på den önskade gränsen av sfäroid.
3. Avmarkera kryssrutan i "Valid" kolumnen i motsvarande rad i "Resultattabell", när en bild innehåller inte någon giltig sfäroid vid inspektion. En "; Invalid "etikett visas i det övre vänstra hörnet av kvalitetskontroll bild. Om "JA" är ikryssad, värdena för alla mätningar är tomma för sfäroid i de exporterade formaterade och utgångsresultatfiler.
   OBS: Följande kortkommandon finns tillgängliga för användning i "Result Table": "nedåtpilen" för nästa bild; "V" för giltig / ogiltig; "M" för "Manuell Initiera" verktyget och "h" för "Hand Draw" verktyg.

7. Spara och exportera data

1. Klicka på "Exportera Study" i SpheroidSizer1.0 fönstret för att exportera den mellantillstånd av analysen, om användaren behöver för att avsluta programmet innan du avslutar projektet. Ange namn och katalog för filen som ska sparas.
2. Klicka på "Importera Study" för att få tillbaka den ovannämnda mellantillstånd resultat från "Exportera Study" och fortsätter att work på det.
   OBS: De mellanliggande stats filer i en infödd MATLAB-format (matta.) Och är inte direkt kan läsas av andra program. En säkerhetsfunktion inbyggd i mjukvaran gör automatiska exporten av det öppna projektet ifall programmet avslutas oavsiktligt. Vid behov kan användaren hitta denna fil, vars namn börjar med "~ tmp" som innehåller motsvarande tidsstämpel i [Installation Directory].
3. Klicka på "Format Resultat" i SpheroidSizer1.0 fönstret för att spara resultatet.
   OBS: Två former av resultaten sparas i försöket katalog. De exporterade filnamn kan konfigureras i Advanced fönstret Konfigurationer (se protokoll Steg 5.2). Formatet utfil är en tab-avgränsad tabell som organiserar volymvärdet i den ursprungliga plattformat i storleksordningen en stigande platta nummer för varje tidpunkt; och alla tidpunkter är organiserade i en stigande ordning (Figur 5D). Listan output fil är en flik-avgränsad tabell som innehåller alla mätningar i form av beställda listor (Figur 5E).

Representative Results

SpheroidSizer är utformad för att producera automatiserad detektion, avgränsning och mätning av 3D spheroids, med anmärkningsvärt minskad arbetskraft och akut ökad effektivitet för stora mängder bilder. Figur 1A visar arbetsflödet i SpheroidSizer. Kärnberäkningssteg inkluderar automatisk initiering, aktiv konturalgoritm och kontur kvantifiering. Efter automatisk uträkning använder kvalitetskontrollfunktionen en kombination av "Manuell Initiera" och "Hand Draw" verktyg för att rädda alla ofullkomliga segmentering. Figur 1B visar den detaljerade automatiserade aktiv konturalgoritm. Initieringen steg (0. Iteration) utnyttjar basiska bildbehandlingssteg för att generera en ungefärlig storlek och lokalisering av sfäroid och genererar en sfärisk initiering kontur uppskattad storlek. Inled kontur matar in i den aktiva konturalgoritm. I sin tur det itererar att anpassa efter den lokala bildenlutning och form krökning. Den aktiva kontur algoritmen avslutas när konturen stabiliserar (konvergerar), det vill säga 477 iterationer för denna bild, eller när den fördefinierade maximalt antal iterationer utförs. I detta exempel är initieringen kontur avsikt förstorad för att bättre visa upp algoritmen. I verkligheten är initieringen vanligtvis mycket nära den faktiska gränsen och mycket färre iterationer behövs för att algoritmen konvergerar. Därefter tar algoritmen morfometriska mätningar av den detekterade sfäroid gränsen. De större och mindre axlar sfäroiddiametern mäts med hjälp av MATLAB bildbehandling verktygslåda (Figur 1C). Den huvudaxel som definieras som linjesegmentet som förbinder ett enda par av de mest avlägsna punkter på konturen, som hänvisas till längden (L). Den mindre axeln definieras som den längsta linje som är vinkelrät mot huvudaxeln, som hänvisas till bredd (W). I detta fall är värdena för L och W är mycket nära eftersomsfäroid är sfäriska. Volymen hos den sfäroid beräknas som V = 0,5 * L * B ^2.

En av funktionerna i SpheroidSizer är dess automatiserad detektion av gränsen för spheroids även på bilder med ojämn eller bullrig bakgrund utnyttja den aktiva konturalgoritm (figur 2B-D). Beräknings bearbetning av ljusa fält bilder är ofta plågas av ojämn bakgrund, vilket vilseleder adaptiva tröskelbaserade metoder för att producera oönskade tröskelresultat. Problemet är särskilt tydligt när flerbrunnsplattor används och väggarna i brunnarna kan skapa skuggeffekter på bilderna. Men eftersom den aktiva kontur algoritmen är inte känslig för en gradvis skuggning förändringen i bakgrunden, är det möjligt att identifiera sfäroid segmentering i dessa bilder med korrekt initiering ljusa fält. Figur 2 visar några exempel på bilder med ojämn eller bullrig bakgrund, liksom ojämn belysning (Figur 2B (figur 2C) eller nekrotiska kärnan (figur 2D). Med automatiserad aktiv konturalgoritm, SpheroidSizer skisserar dessa spheroids korrekt i alla dessa bilder som visas i den röda konturen på den nedre panelen i varje figur.

Kvalitetskontroll inslag i SpheroidSizer är nyckeln till en hög genomströmning arbetsflöde. Den "Manuell Initiera" och "Hand Draw" verktyg är värdefulla gratis verktyg för denna applikation. Bland hundratals eller tusentals bilder, är det oundvikligt att den automatiska algoritmen inte kan identifieras korrekt sfäroiderna i vissa bilder. Såsom illustreras i figur 3A, när felaktig detektering av den sfäroid orsakas på grund av initieringen steg, dvs felaktig storlek eller placering av initieringen kontur i bilden (övre panelen), fungerar "Manual Initialize" verktyg genom att tillåta användaren att korrekt definiera placeringen och storleken på sfärOID manuellt (lägre panelen). Det utlöser aktiva konturalgoritm att inleda med manuellt definierad kontur och köra för att konvergera på den önskade konturen. För dessa tuffa bilder som den ursprungliga bilden i figur 3B, är sfäroid belägen i en störande och bullriga bakgrund. SpheroidSizer inte kunna korrekt identifiera sfäroid med den automatiserade metoden (övre panelen) eller av "Manual Initiera" verktyg med ordentlig initiering (mitten panel). I detta fall kan "Hand Draw" verktyg användas för att rita konturerna av den sfäroid manuellt, såsom visas i det undre fältet. Programmet använder användardefinierad gräns för att mäta stor-och lillaxlarna för sfäroid och beräkna volymen. Alla de korrigerade resultaten omedelbart införlivas i "Resultattabell" och kan därefter exporteras.

För att bestämma prestandan hos SpheroidSizer i större datamängder, vi först jämföra drifttid genomanalysera samma uppsättning av 288 bilder med hjälp av 1) manuella mätningar med mikroskop leverantör medföljande programvara; 2) SpheroidSizer med en single-core vanlig bärbar dator; och 3) SpheroidSizer med en multi-core parallella beräkningar prestanda arbetsstation. De manuella mätningar följer vår typiska protokoll innan utveckla programvaran: längd och bredd på varje sfäroid dras för hand och mättes med säljaren programmet (sett de röda linjerna i den övre panelen i figur 4A); då användaren kopior ner värdena för mätningarna. SpheroidSizer bearbetar varje bild genom att generera sfäroiden gräns (som visas i röd kontur i den nedre panelen i figur 4A), som mäter den axiella större och mindre längd, och exportera resultatet i kalkylblad. Som framgår av tabell 1, bygger på en beräkning från 288 bilder, tar det i genomsnitt 31,67 sek för att mäta en sfäroid per bild manuellt; medan det bara tar SpheroidSizer mindre än 2 sek & # 160, när man kör på en single-core vanlig bärbar dator; och mindre än 1 sekund när man kör på en 12-core prestanda arbetsstation. Därför är bildanalys över 18x snabbare per bild med SpheroidSizer än manuella mätningar. Det minskar dramatiskt arbetskraft när mer än tusen bilder analyseras. Därefter jämför vi variationen i mätningarna av de 24 spheroids som visas i figur 4A mellan manuella mätningar och SpheroidSizer. De 24 sfäroider mäts tre gånger av båda metoderna; och standardavvikelsen för varje individuell sfäroid beräknas. Som framgår av figur 4B, standardavvikelsen från SpheroidSizer (grön linje och prickar) är nära noll med undantag för de tre spheroids som korrigeras vid kvalitetskontrollsteg, som fortfarande visar mindre standardavvikelse än de från den manuella mätningar metoden. Allt detta tyder på att SpheroidSizer utför bildanalys desto mer effektivt och korrekt.

e_content "> Vi har genomfört en drog skärm med hjälp av humana BON-1 3D tumör sfäroider för att ta reda på vilka föreningar i kombination med en hsp90-hämmare är de potentiella kandidaterna för provning av antitumöreffekter in vivo. Human BON-1 3D tumör spheroids var vuxen på agaros-belagda plattor med 96 brunnar som beskrivs i föregående papper ^15. Åtta olika föreningar med sex seriespäd plus media och fordon screenades för sin enkel-och kombinatoriska effekter med 10 nM och 20 nM Hsp90 hämmare i dubbletter respektive. Två spheroids var användes för varje koncentration av den individuella föreningen eller de kombinerade föreningar. Fyra 96-brunnars plattor med totalt 384 sfäroider användes. Alla sfäroiderna avbildades vid 0, 72, 144, 168, och 192 timmar. Totalt 1920 avbildar producerades från detta experiment. Det tog SpheroidSizer bara 30 minuter att slutföra computational analys av de 1920 bilder med ytterligare 50 min för kvalitetskontroll och dataexport. SpheroidSizer påskyndar bildanalys processen enormt. Figur 5A visar en skärmdump av arrangemangen mapp och filnamn för detta experiment som ett exempel för protokoll Steg 3.3. Figurerna 5B-E visar skärmdumpar av de bildanalys popup-fönster och resultat . använda SpheroidSizer som illustrationer för Protokoll steg 4, 5 och 7 Ta volymerna av de 3D-spheroids från formaterade resultat tabellen exporterades från SpheroidSizer, gjorde vi grafer - tillväxt av 3D tumör spheroids på sammansatta behandlingar mot tiden för behandlingar. Två representativa grafer från detta experiment visas i figur 5F och 5G. Figur 5F visar att de kombinerade behandlingar av hsp90 hämmare och kladribin (grön linje) hämmar tillväxten av 3D spheroids mer än den enda behandlingen av hsp90-hämmare (lila linje) eller kladribin (orange linje), vilket tyder på att de kombinerade behandlingar av hsp90-hämmare och kladribin kan ha anti-tumör-effekter in vivo. Figur 5G visar att de kombinerade behandlingar av hsp90 hämmare och adriamycin (grön linje) inte hämmar tillväxten av 3D spheroids mer än den enda behandlingen av adriamycin (orange linje) eller hsp90 hämmare (lila linje), vilket tyder på att den kombinerade behandlingar av hsp90-inhibitor och adriamycin kanske inte har antitumöreffekter in vivo. Detta experiment hjälpte oss att bättre välja de föreningar för att testa sina antitumöreffekter in vivo och SpheroidSizer är nyckeln till en snabb experimentell dataanalys.

Tabell 1. Jämförelse av drifttid på bildanalys mellan manuella mätningar och SpheroidSizer vid analys av samma uppsättning av 288 bilder. Vänligen c.slicka här för att se en större version av den här tabellen.

Figur 1 SpheroidSizer -... Ett open-source program för att mäta sfäroid storlek A) Kärn arbetsflöde för ansökan B) Illustration av den aktiva konturalgoritm i olika skeden av iteration. Observera att initieringen kontur (iteration 0) var avsiktligt förstorat för att visa upp algoritmen. C) De större och mindre mätningar och beräkning av volymen av SpheroidSizer axiell längd. L - huvudaxel: linjesegmentet som förbinder ett enda par avlägsnaste punkter på konturen (hänvisas till längd); W - mindre axel: den längsta linje som är vinkelrät mot huvudaxeln (hänvisad till bredd).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid">
D) Bilder av sfäroider med nekrotisk kärna Figur 2. Representativa resultat från den automatiska segmentering av SpheroidSizer, visar robusthet mot olika bildförhållanden. A) Typiskt bra kvalitet bilder. B) bilder med olika ljusstyrka och kontrast. C) Bilder med distraherande skräp. . Bilder på den övre panelen i varje figur är käll / originalbilder; bilder på den undre panelen av varje figur är kvalitetskontroll bilder; och röd kontur är sfäroid segmente teckningar av automatiserad beräkning.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Figur 3. Illustration av den "Manuell Initiera" och "Hand Draw" verktyg. A) Den "Manual Initiera" verktyg gör en teckning av en passande ellips form över sfäroid för initiering, när felaktiga spheroid segmentering sker efter den automatiska initieringen. B ) Den "Hand Draw" verktyg gör exakt handen ritning av sfäroid gränsen, när felaktiga sfäroida segmente uppstå med både automatisk och manuell initiering. Den blå linjen runt sfäroid visar initieringen kontur; den röd kontur är den identifierade sfäroid gränsen. Observera att sfäroid i "Manuell Initiera" i A) och sfäroid i "Hand Draw" i B) är avsikt förstoras för att bättre visa upp verktygen.

Figur 4. Jämförelse av bildanalys prestanda mellan SpheroidSizer och manuella mätningar vid analys av samma uppsättning av 24 bilder. A) Representativa sfäroider för att visa hur längd och bredd av sfäroider bestäms genom manuella mätningar och SpheroidSizer. Topp 24 bilder innehåller handritade längd / bredd på varje sfäroid i röda linjer med manuella mätningar; lägre 24 bilder (samma 24 bilder) innehåller datorritade sfäroid gränsen i röd kontur med hjälp SpheroidSizer. B) Standardavvikelsen för längd eller bredd från tre mätningar på varje enskild spheroid.

Figur 5. Ett representativt exempel på utnyttjande av SfärSizer på läkemedel skärm - bildanalys på sfäroider "bilder som samlades in från ett läkemedel skärm med hjälp av BON-1 3D tumör spheroids A) En skärmbild av arrangemangen mapp och filnamn för detta projekt B) En skärmdump av den avancerade.. konfigurationer fönster i SpheroidSizer. C) En skärmdump av SpheroidSizer1.0 fönster med visas Resultattabell. D) En skärmdump av formatet utdatafilen exporteras från SpheroidSizer. E) En skärmdump av listan utdatafilen exporteras från SpheroidSizer. F) Tillväxt av 3D tumör sfäroider vid behandlingarna med hsp90 hämmare och kladribin. G) Tillväxt av 3D tumör sfäroider vid behandlingarna med hsp90 hämmare och adriamycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>

Discussion

Denna studie presenterar en snabb, flexibel, effektiv och automatiserad program - SpheroidSizer för noggrann bestämning av storleken på 3D-tumör sfäroider. SpheroidSizer är enkel att använda och kräver minimal inmatning från användare. De mest kritiska stegen för exakt, problemfri och framgångsrikt driva SpheroidSizer inkluderar: att sfäroiderna avbildas i centrum av området utan att röra kanten av brunnen; alla filer som ska analyseras tillsammans som ett projekt ska avbildas under samma mikroskop med samma syfte; alla filer som ska analyseras är korrekta namnet och sätt som framgår av protokollet; och korrekta användardefinierade inställningar anges innan beräkning.

Fördelarna med SpheroidSizer innefattar dess förmåga att tolerera gradvis bakgrund förändring i bilden samt för att generera mjuka konturer, vilka motsvarar de allmänna sfäriska former av sfäroiderna som utnyttjar aktiv kontur-algoritm. Utförande av aktivkontur kan äventyras i två situationer: dålig initiering, eller förekomst av andra lokala kanter distraherande från den önskade konturen. Speciellt i våra testade fall, den andra situationen ibland hända när den nekrotiska kärnan i en stor sfäroid lockar aktiva konturen vilket resulterar i mindre kontur rapporteras. Det är värt att notera att andra automatiserade tröskelbaserade metoder lider även i denna situation, om inte tröskelvärdet är specifikt inställd för hand. Programvaran lägger därför fram för att hjälpa användarna upptäcka och åtgärda äventyras segmentering genom att erbjuda enkla kvalitets kontrollfunktioner. Om segmente fel händer från dålig initiering, kan användnings använda "Manuell Initiera" verktyg för att åsidosätta den automatiska initieringen. När bildkvaliteten är för dålig för aktiv kontur, kan användarna enkelt "Hand Draw" konturen som matar in kvantifiering. Befintlig programvara såsom CellProfiler kan anpassas för denna applikation i en semi-automatiserad Fashion. Arbetsflödet kan vara besvärlig när stora mängder bilder med olika avbildningsbetingelser presenteras eller när en delmängd av bilder behöver mer mänsklig inblandning för att mäta korrekt. SpheroidSizer ger en allt-i-en svit för beräkning och kvalitetskontroll för att hantera hög genomströmning bildanalys arbetsflöde.

SpheroidSizer är för närvarande begränsad till att upptäcka en sfäroid per bild och endast mäter den axiella längd sfäroid. Programmet kan utökas för att stödja ytterligare kvantifiering krävs av forskare såsom kvantifiering på sfäroider med nekrotisk kärna, upptäcka flera spheroids i en bild eller övervakning av formen på sfäroider. Vidare kan programmet modifieras för att detektera och mäta storleken på de exciderade tumörer från djur eller människa, som säkerligen kommer att vara till nytta för forskare när de utför in vivo pre-klinisk eller klinisk forskning. Efterbearbetning av de upptäckta spheroids kan också undersökas målning till att minska människans ansträngning som krävs för kvalitetskontroll och ytterligare förbättra genomströmningen. SpheroidSizer är en generaliserad bildanalys ansökan om 3D tumör sfäroider som produceras från alla celltyper, och därför kan användas av ett brett cancerforskarsamhället.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software