Summary
نقدم تطبيق عالية الإنتاجية برمجيات تحليل الصور لقياس حجم الورم الكروية ثلاثية الأبعاد المصورة مع المجهر مشرق الميدان. يوفر هذا التطبيق طريقة سريعة وفعالة لدراسة آثار العقاقير العلاجية على الأجسام الشبه الكروية، وهو مفيد للباحثين الذين يرغبون في استخدام الأجسام الشبه الكروية في شاشات المخدرات.
Abstract
عدد متزايد من تطبيقات ثلاثية الأبعاد (3D) الكروية الورم لتكون نموذجا في المختبر لاكتشاف المخدرات يتطلب تكيفها مع صيغ الفرز على نطاق واسع في كل خطوة من شاشة المخدرات، بما في ذلك تحليل الصور على نطاق واسع. حاليا لا يوجد برنامج تحليل الصور الجاهزة للاستخدام وحرية الوفاء بهذا الشكل على نطاق واسع. تنطوي معظم الطرق القائمة يدويا رسم طول وعرض الأجسام الشبه الكروية 3D تصويرها، وهي عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الدراسة على الإنتاجية العالية تطبيق برامج تحليل الصور - SpheroidSizer، والذي يقيس طول محوري الرئيسية والثانوية للتصوير 3D الكروية الورم تلقائيا وبدقة؛ يحسب حجم كل فرد الورم كروي 3D؛ ثم إخراج النتائج في شكلين مختلفين في جداول البيانات لسهولة التلاعب في تحليل البيانات اللاحقة. الميزة الرئيسية لهذا البرنامج هو قوية صورة تطبيق تحليله هذا هوتكييفها لأعداد كبيرة من الصور. ويوفر حساب الإنتاجية العالية وسير العمل ومراقبة الجودة. الوقت المقدر لمعالجة الصور 1،000 حوالي 15 دقيقة على جهاز كمبيوتر محمول تكوين الحد الأدنى، أو حوالي 1 دقيقة على محطة عمل أداء متعددة النوى. تم تصميم واجهة المستخدم الرسومية (GUI) أيضا لمراقبة الجودة سهلة، ويمكن للمستخدمين تجاوز نتائج الكمبيوتر يدويا. أسلوب الرئيسية المستخدمة في هذا البرنامج هو مقتبس من الخوارزمية كفاف نشط، والمعروف أيضا باسم الأفاعي، الذي هو مناسبة خاصة للصور مع إضاءة خلفية صاخبة متفاوتة والتي غالبا ما يصيب تجهيز التصوير الآلي في شاشات عالية الإنتاجية. المجاملة "تهيئة يدوي" وأدوات "رسم اليد" توفير المرونة اللازمة لSpheroidSizer في التعامل مع أنواع مختلفة من الأجسام الشبه الكروية وصور ذات جودة متنوعة. هذه الإنتاجية العالية برمجيات تحليل الصور بشكل ملحوظ يقلل العمل ويسرع عملية التحليل. تنفيذ هذا البرنامج هو بeneficial لالكروية الورم 3D لتصبح روتينية في نموذج المختبر لشاشات المخدرات في الصناعة والأوساط الأكاديمية.
Introduction
ثلاثي الأبعاد (3D) الكروية الورم هي "المجاميع متماثل كرويا الخلايا السرطانية إلى الأنسجة مماثلة، مع عدم وجود الركيزة الاصطناعي لمرفق الخلية" 1-3. وعلم الخلايا والتشكل من الورم الكروية يقلد بشكل أفضل في الجسم الحي ورم الأنسجة وتنظيم microenvironments من ثنائي الأبعاد (2D) خلايا أحادي الطبقة. أصبحت الكروية الورم 3D نموذجا عمليا في المختبر لغربلة الإنتاجية العالية من الأدوية المضادة للسرطان في الطب العلاجي أو فحص نجاعة الأدوية مرشح من قبل في الجسم الحي الحيوان أو اختبارات سريرية 4. سريريا، يتم تقييم فعالية أي علاج العقاقير المضادة للسرطان على أساس انخفاض نمو الورم. بالقياس، وحجم كروي يمكن استخدامها كمقياس للفعالية للدراسات المخدرات سرطان في المختبر. حجم كروي (V = 0.5 * الطول * العرض 2) يتم تحديدها استنادا إلى طول الرئيسية والثانوية المحوري (المعروفة أكثر باسم الطول والعرض)من الكروية 6، 7. يكون معظم الباحثين لرسم يدويا طول وعرض على كل كروي، وغالبا ما تستخدم البرمجيات التي تقدمها الشركات المجهري وتباع جنبا إلى جنب مع أدوات التصوير. هذه التقنية يصبح مشكلة عندما يتم تنفيذ شاشات المخدرات الإنتاجية العالية ويتم إنتاج أكثر من مئات من الصور. ذكرت بعض الدراسات الحديثة استخدام أدوات العمل مفتوحة مصدر الصورة برامج التحليل مثل CellProfiler 8-10 ويماغيج 11 إلى تطوير بدائية إجراءات تجزئة / وحدات الماكرو التي تشارك تصحيح الإضاءة ومستوى العتبة بسيطة. غالبا ما تحتاج إلى إعادة تعديل لدفعات مختلفة من الصور وفقا لحالة الإضاءة وتغيير تباين الصورة هذه الإجراءات؛ وبالتالي، يمكن حزم البرامج هذه لا تفي بمتطلبات متانة تحليل الصور عالية الإنتاجية. تستخدم فريدريش والمتعاونين (2009) البرمجيات الاحتكارية لقياس حجم شبه أبوا-كروي لatically 5. كانت الطريقة الموضحة في Monazzam ورقة زملائه 10 طريقة شبه الآلي لقياس حجم كروي فقط لعدد قليل من الصور. وبالتالي، هناك حاجة واضحة لأدوات قوية ومرنة ومؤتمتة وتحليل الصور الجاهزة للاستخدام لالكروية الورم 3D.
في هذه الدراسة، ونحن تصف SpheroidSizer - تطبيق البرمجيات مفتوحة المصدر على أساس MATLAB وقياس حجم الأجسام الشبه الكروية الورم تلقائيا وبدقة. تم تصميم SpheroidSizer لمعالجة العديد من دفعات مختلفة من الصور من الأجسام الشبه الكروية 3D في نفس الدورة. باستخدام خوارزمية كفاف نشط 12-14، يمكن أن يتسامح مع SpheroidSizer تغيير الصورة النقيض من ذلك، تجاهل بقوة التغيير التدريجي في الإضاءة الخلفية والتعرف على الأجسام الشبه الكروية في الصورة. فإنه يمكن أيضا تحمل العديد من القطع الأثرية المعتادة، على سبيل المثال، والحطام، نشأت من العينة. تم تصميم سير العمل بحيث يمكن للمستخدمين أداء الجودة كنترولل أثناء أو بعد حساب. الكتابة اليدوية للنتيجة التحليل يمكن بسهولة أن يؤديها على الفور. الاستفادة من الأدوات الحوسبة المتوازية، وسرعة تحليل يمكن عززت مزيدا من التنسيق النوى والحوسبة متعددة للعمل على حساب وقت واحد على جهاز الكمبيوتر الخاص بالمستخدم. علاوة على ذلك، SpheroidSizer إخراج النتائج في شكلين مختلفين للسماح سهولة التواصل مع أدوات تحليل المصب.
Protocol
يتم تنفيذ 1. 3D الكروية الورم تشكيل وعلاجات المخدرات وجمع الصور كما هو موضح في ورقتنا السابقة 15.
2. تثبيت البرامج
- تثبيت البرامج المرخصة MATLAB على أجهزة الكمبيوتر المستخدمة لتحليل الصور. وهناك حاجة أيضا لأدوات العمل التالية من MATLAB ليتم تثبيتها - معالجة الإشارات الأدوات، أدوات معالجة الصور، والحوسبة المتوازية الأدوات * (* اللازمة لوضع الحوسبة المتوازية فقط).
ملاحظة: كثير من الجامعات شراء وصيانة تراخيص مجموعة بحيث البرنامج مجاني ليتم تحميلها واستخدامها من قبل العلماء التابعة لها. - تثبيت البرنامج من ملف SpheroidSizer SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
- حفظ ملف مضغوط في نظام الملفات المحلية.
- بفك الملف SpheroidSizer.
- حفظ الملفات في الدليل المعين / مجلد، والذي سيحال بعد ذلك إلى كما روقال انه "دليل التثبيت".
ملاحظة: SpheroidSizer وقد تم اختبار على نطاق واسع على نظام التشغيل ويندوز 7. ومن المتوقع أن تعمل على أنظمة التشغيل البديلة مع التعديلات الطفيفة (لم تختبر).
3. التحضير لتحليل الصور بواسطة SpheroidSizer
- تحديد دقة / حجم صورة نظام التصوير (مقياس مطلق للصورة في ميكرون لكل بكسل (ميكرون / بيكسل)).
ملاحظة: إذا كان من المعروف حجم كل بكسل على رقاقة الكاميرا، يمكن حساب حجم الصورة مثل حجم التكبير الهدف العاشر بكسل (ميكرون / بيكس). ويمكن الحصول على هذه القيمة من برامج التصوير مجهزة المجهر كما الفوقية جزءا لا يتجزأ أو بمساعدة من بائع نظام التصوير. وسوف تكون هناك حاجة هذه القيمة في الخطوة 4.6. - تحويل أي الملكية تنسيقات ملفات الصور إلى تنسيقات الملفات المقبولة - TIFF، JPEG، وغيرها من صورة تنسيقات الملفات المشتركة.
- تسمية ملفات الصور وترتيب directoriوفاق (الشكل 5A).
ملاحظة: البرنامج يعتمد على التخطيط السليم للبنية الدليل وأسماء لإعادة النتائج في شكل لوحة:- تسمية ملفات الصور في الشكل التالي: [لوحة الاسم] _ [الصف] [العمود] [ملحق] أو [اسم لوحة] [الفضاء] [الصف] [العمود] [ملحق].. [الصف] يتبع الترتيب الأبجدي و[العمود] يتبع الترتيب العددي.
ملاحظة: يمكن الاطلاع متاحة بحرية البرامج التلقائي إعادة تسمية دفعة لمساعدة المستخدمين في هذه الخطوة. - ترتيب دليل / مجلد استنادا إلى التجربة على النحو التالي: يجب أن يكون لكل تجربة دليل واحد. تحت الدليل كل تجربة، ويجب أن يكون هناك الدلائل لكل نقطة زمنية. تحت كل نقطة دليل فرعي الوقت، يجب أن يكون هناك كل الصور من جميع لوحات.
ملاحظة: من أجل نتائج التحليل ليتم فرزها على النحو الأمثل في نتائج تنسيق، فإننا نقترح الإبقاء على نفس عدد الأرقام لكل المعرف عن طريق ملء 0 على لترEFT، على سبيل المثال، يتم تسمية نقاط الوقت كما 000H، 072H، 144H و.
- تسمية ملفات الصور في الشكل التالي: [لوحة الاسم] _ [الصف] [العمود] [ملحق] أو [اسم لوحة] [الفضاء] [الصف] [العمود] [ملحق].. [الصف] يتبع الترتيب الأبجدي و[العمود] يتبع الترتيب العددي.
4. تحليل الصور من الأجسام الشبه الكروية من قبل SpheroidSizer
- مفتوحة MATLAB، ثم فتح "نافذة الأوامر"، اكتب cd '[دليل التثبيت]' ثم اضغط على [RETURN].
- اكتب "SpheroidSizer1_0" في "إطار الأوامر" ثم اضغط على [RETURN] لإطلاق برنامج SpheroidSizer.
- انقر على زر "استعراض" في نافذة SpheroidSizer1.0 لتحديد الدليل التجربة يحتوي على كافة الصور.
- حدد "تضمين المجلدات الفرعية" تبديل تحت "المجلد" حقل النص لمعالجة عدة مجلدات الصور المتداخلة تحت الدليل المعين.
ملاحظة: إذا كان "تضمين المجلدات الفرعية" لم يتم تحديد تبديل، تتم معالجة الصور تحت الدليل مباشرة فقط، ويتم تجاهل كافة المجلدات الفرعية. - حدد "عرض على ذبابة" خيار DISPوضع كل صورة مجزأة على رأس صورة مصدره لمراقبة الجودة كما يتم تنفيذ الحساب.
ملاحظة: سرعة الحاسوب أسرع إذا لم يتم اختيار "على ذبابة على شاشة" الخيار. - تحديد "الحل" (مقياس الصورة / القرار في ميكرون / بيكسل) من الصور التي تم تحليلها في منطقة الجزاء، لبرنامج لتحويل القياسات كروي بشكل صحيح من بكسل إلى ميكرومتر.
ملاحظة: يجب أن تؤخذ جميع الصور في نفس المجلد أو تحليلها معا تحت نفس المجهر مع نفس الهدف بحيث يظل مقياس الصورة / قرار ثابت لكل تجربة. - يمكن للمستخدمين (اختياري) اتباع الخطوة 5 لإعدادات محددة المستخدم المتقدم.
- انقر على "حساب" لبدء الحساب.
ملاحظة: البرنامج يقوم على الاختيار التلقائي اسم الملف قبل الشروع في الحساب. إذا يظهر مربع حوار يصل تشير - "موجود خطأ في اسم الملف"، انقر فوق "إنهاء وتظهر قائمة من الأخطاء"وإصلاح الأخطاء في أسماء الملفات المدرجة (انظر الخطوة 3.3). ثم، انقر على زر "حساب" لبدء الحساب مرة أخرى. - انقر فوق زر "إيقاف مؤقت" لإيقاف الحساب؛ والحساب يمكن استئناف بالضغط على الزر نفسه تظهر على "متابعة".
ملاحظة: يعرض "جدول النتائج" في "المجلد"، "ملف"، "وحدة التخزين" (مم 3)، "طول" (في ميكرون)، (خانة الاختيار) "صالح" "العرض" (في ميكرون)، و لجميع الأجسام الشبه الكروية تحليل (الشكل 5C). يتم حساب حجم استنادا إلى محور قياس الكبرى (طول) والمحور البسيط (العرض) (V = 0.5 * الطول * العرض 2). خانة الاختيار "صالح" هو خيار للمستخدم لاختيار ما إذا تحليل الصورة صالحة أو غير صالحة بعد مراقبة الجودة، راجع الخطوة 6.
5. إعدادات محددة المستخدم المتقدم
- انقر على زر "متقدم" في SpheroidSizer1.0 النافذة لإظهار إطار تكوينات متقدمة من أجل ضبط الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم (الشكل 5B).
- أدخل أسماء من الاهتمام في "الإخراج تنسيق" ومربعات "قائمة الإخراج" في إطار تكوينات متقدمة تحت عنوان "الإدخال".
- إدخال رقم من "2-10" في مربع "الحد". هذا هو معامل لبرنامج لتقليل حجم الصور في حساب من أجل تحسين سرعة الحساب. أكبر عدد هو، وأسرع من سرعة الحساب. يتم تعيين الافتراضي "تقليل" إلى 10.
- أدخل ملحق ملف صورة ليكون المجهزة في مربع "تضمين نوع".
- دخول ملحقات ملف الصورة أو النهايات التي لا تسير لتتم معالجتها بواسطة البرنامج في مربع "استثناء نوع" كما يلي: "_crude.jpg".
- اختيار "لا" ل "اللون الخاص" لمعالجة 8 بت و 16 بت عمودأو الصور بشكل صحيح؛ اختيار "12 بت" ل "اللون الخاص" لمعالجة الصور الملونة 12 بت بشكل صحيح
- تحقق "استخدام الحوسبة المتوازية" إذا تم تجهيز أجهزة الكمبيوتر المستخدمة لتحليل الصور مع وحدات المعالجة المركزية متعددة و / أو وحدات المعالجة المركزية متعددة النوى. إذا كان هذا صحيحا، ثم انتقل إلى الخطوة 5.7.1؛ إذا لم يكن كذلك، ثم انتقل خطوات 5.7.1 و5.7.2.
ملاحظة: سوف يحدث خطأ إذا كان الكمبيوتر قيد الاستخدام لا يعتمد التكوين الذي تم اختياره.- التحقق من "استخدام الحوسبة المتوازية" الخيار في إطار تكوينات متقدمة.
ملاحظة: استخدام وضع الحوسبة المتوازية فقط عندما تكون 4 أو أكثر النوى المتوفرة للكمبيوتر. - إدخال رقم 4-12 في "# العمال" (الحوسبة النوى) مربع.
ملاحظة: هذا الرقم يجب أن تكون مساوية أو أقل من عدد من النوى الحوسبة في جهاز الكمبيوتر المستخدم. تفرض أقصى 12 من MATLAB الأدوات الحوسبة المتوازية تدعم الحد الأقصى من 12 النوى. عندما الحوسبة المتوازية وتكونجي تنفيذها، ويعرض مربع حوار صغير يطلب من المستخدم لانتظار الحوسبة المتوازية لإنهاء؛ لا يمكن أن يكون مؤقتا حساب، وكما هو ميزة "عرض على ذبابة" يتم تنفيذه في وضع الحوسبة المتوازية.
- التحقق من "استخدام الحوسبة المتوازية" الخيار في إطار تكوينات متقدمة.
6. مراقبة الجودة
- انقر فوق الخلية المقابلة في "جدول النتائج" لتأكيد الحدود كفاف دقيقة من كروي في تحليل الصور،
ملاحظة: سوف تظهر الصور الأصلية ومراقبة الجودة حتى على الجانب الأيمن للمراجعة. يمكن للمستخدم فحص جميع الصور بالتتابع باستخدام السهم لأسفل على لوحة المفاتيح. - حدد حدود كروي على الصورة المحددة باستخدام أدوات التاليين، إذا لزم الأمر:
- انقر فوق الزر "دليل تهيئة" لعرض الصورة الأصلية. ثم النقر والاستمرار على الماوس الأيمن خارج كروي واسحب أداة القطع الناقص لتغطية كروي على الصورة الأصلية.
ملاحظة: لخوارزمية التفاعلية الذي نظمه-كفاف يبدأ باستخدام كفاف المقدمة المستخدم وينفذ للتجمع في مخطط كروي المطلوب. "جدول النتائج" سيتم تحديثها تلقائيا مع نتائج جديدة. "دليل تهيئة" أداة تسمح للمستخدم لتوفير التهيئة يدويا لنشط كفاف. - انقر فوق الزر "رسم اليد" لعرض الصورة الأصلية. ثم استخدام الماوس أو الشاشة التي تعمل باللمس لتمكين رسم بدقة حدود كروي.
ملاحظة: يتم قياس هذا المخطط مباشرة لتوليد المحاور الرئيسية والثانوية، والتي يتم تحديثها في "نتائج الجدول". يتم استخدام "اليد رسم" الأداة الوحيدة عند فشل "دليل تهيئة" أداة لتتلاقى على الحدود المرجوة من كروي.
- انقر فوق الزر "دليل تهيئة" لعرض الصورة الأصلية. ثم النقر والاستمرار على الماوس الأيمن خارج كروي واسحب أداة القطع الناقص لتغطية كروي على الصورة الأصلية.
- قم بإلغاء تحديد خانة الاختيار في العمود "صالح" في الصف المقابل من "نتائج الجدول"، عندما لا تحتوي على أي صورة كروي سارية المفعول عند التفتيش. و"يبدو التسمية غير صالح "في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة مراقبة الجودة؛ إذا "صالح" لم يتم التحقق منه، وقيم كل القياسات فارغة لكروي في الملفات نتائج منسقة والمخرجات المصدرة.
ملاحظة: هي اختصارات لوحة المفاتيح التالية متاحة للاستخدام في "جدول النتيجة": "السهم لأسفل" للصورة التالية؛ "الخامس" لصالحة / غير صالح؛ "م" ل "دليل تهيئة" أداة و "ح" ل "رسم اليد" الأداة.
7. حفظ وتصدير البيانات
- انقر على زر "دراسة تصدير" في إطار SpheroidSizer1.0 لتصدير حالة وسطية من التحليل، إذا كان المستخدم يحتاج إلى الخروج من البرنامج قبل الانتهاء من المشروع. تحديد اسم والدليل من الملف ليتم حفظها.
- انقر فوق زر "استيراد دراسة" لاعادة نتيجة حالة وسيطة أعلاه من "دراسة تصدير" والاستمرار في العك على ذلك.
ملاحظة: الملفات هي الدولة الوسيطة في شكل MATLAB الأم (حصيرة). وليست قابلة للقراءة مباشرة من قبل أي برامج أخرى. وهناك ميزة السلامة في صلب البرنامج يجعل الصادرات التلقائي للمشروع مفتوح في حال خروجها من البرنامج عن غير قصد. عند الحاجة، يمكن للمستخدم العثور على هذا الملف، الذي يبدأ ب "~ تمة" الذي يحتوي على طابع زمني المقابلة في [دليل التثبيت] الاسم. - انقر على زر "نتائج تنسيق" في إطار SpheroidSizer1.0 لحفظ النتائج.
ملاحظة: يتم حفظ شكلين من نتائج في الدليل التجربة و. يمكن تكوين أسماء تصديرها في إطار تكوينات المتقدم (انظر البروتوكول الخطوة 5.2). ملف الإخراج الشكل هو الجدول يرسم علامة التبويب التي تنظم قيمة حجم في شكل لوحة الأصلي في الترتيب من رقم لوحة تصاعدي لكل نقطة زمنية؛ ويتم تنظيم جميع النقاط الوقت في ترتيب تصاعدي (الشكل 5D). قائمة سملف utput هو الجدول يرسم علامة التبويب التي تحتوي على كافة القياسات في شكل القوائم المرتبة (الشكل 5E).
Representative Results
تم تصميم SpheroidSizer لانتاج الكشف الآلي، وترسيم وقياس الأجسام الشبه الكروية 3D، مع انخفاض ملحوظ العمالة وزيادة كفاءة حاد لكميات كبيرة من الصور. ويبين الشكل 1A سير العمل من SpheroidSizer. وتشمل الخطوات الأساسية التهيئة حساب الآلي، خوارزمية كفاف كفاف نشطة والكمي. بعد حساب الآلي، يستخدم ميزة مراقبة الجودة مزيج من "تهيئة يدوي" وأدوات "رسم اليد" لإنقاذ أي تجزئة الكمال. يوضح الشكل 1B خوارزمية كفاف نشطة الآلي تفصيلا. الخطوة تهيئة (التكرار 0) يستخدم خطوات معالجة الصور الأساسية لتوليد تقريبي حجم وموقع كروي وتوليد كفاف بدء كروية مع حجم المقدرة. كفاف بدء يغذي خوارزمية كفاف نشطة. بدوره أنه بالتكرار لضبط وفقا للصورة المحليةالانحدار وشكل انحناء. الخوارزمية كفاف نشط ينتهي عندما تستقر كفاف (CONVERGES)، أي 477 مرات التكرار لهذه الصورة، أو عندما يتم تنفيذ الحد الأقصى لعدد محدد مسبقا من التكرارات. في هذا المثال، يتم تكبير كفاف التهيئة عمدا لعرض أفضل الخوارزمية. في الواقع، والتهيئة عادة قريبة جدا من الحدود الفعلية وهناك حاجة لعدد أقل بكثير من التكرار لخوارزمية لتتلاقى. في وقت لاحق، الخوارزمية تأخذ القياسات المورفولوجية للحدود كروي الكشف عنها. يتم قياس المحاور الرئيسية والثانوية للكروي باستخدام MATLAB معالجة الصور الأدوات (الشكل 1C). يتم تعريف المحور الرئيسي باسم شريحة خط يربط زوج واحد من أبعد نقطة على كفاف، والتي يشار اليها على طول (L). يتم تعريف المحور البسيط باعتباره أطول خط عمودي على المحور الرئيسي، الذي يشار إليه العرض (W). في هذه الحالة، قيم L و W هي قريبة جدا منذكروي كروية. يتم حساب حجم كروي كما V = 0.5 * L * W 2.
واحدة من ميزات SpheroidSizer هو الكشف الآلي للحدود من الأجسام الشبه الكروية حتى على الصور مع خلفية صاخبة متفاوتة أو باستخدام خوارزمية كفاف نشط (أرقام 2B-D). وغالبا ما تعاني المعالجة الحاسوبية من الصور مجال مشرق من خلال الخلفية غير المتكافئ، الذي يضلل الأساليب القائمة على مستوى العتبة التكيف لتحقيق نتائج غير مرغوب فيها مستوى العتبة. المسألة واضحة وخصوصا عندما تستخدم لوحات متعددة جيدا وجدران الآبار قد خلق تأثيرات التظليل على الصور. ومع ذلك، لأن خوارزمية كفاف النشطة ليست حساسة لتغيير التظليل تدريجيا في الخلفية، وأنها قادرة على تحديد كروي تجزئة في هذه الصور مع حقل مشرق التهيئة المناسبة. الشكل 2 يوضح بعض الأمثلة من الصور مع خلفية غير المستوية أو صاخبة، مثل متفاوتة الإضاءة (الشكل 2B (الشكل 2C) أو نخرية الأساسية (الشكل 2D). مع خوارزمية الآلي كفاف نشطة، SpheroidSizer يحدد هذه الأجسام الشبه الكروية بدقة في جميع هذه الصور كما هو مبين في كفاف الحمراء في اللوحة السفلى من كل شخصية.
ميزة مراقبة جودة SpheroidSizer هو المفتاح لسير عمل عالية الإنتاجية. في "تهيئة يدوي" وأدوات "رسم اليد" هي أدوات مجانية قيمة لهذا التطبيق. من بين المئات أو الآلاف من الصور، فإنه لا مفر منه أن خوارزمية الآلي ليست قادرة على الكشف عن الأجسام الشبه الكروية بشكل صحيح في بعض الصور. كما هو موضح في الشكل 3A، عندما يتم الكشف عن سبب غير لائق للكروي بسبب خطوة التهيئة، أي حجم غير لائق أو موقع كفاف الشروع في الصورة (اللوحة العلوية)، "دليل تهيئة" أداة تعمل عن طريق السماح للمستخدم بشكل صحيح تحديد موقع وحجم spherسيد يدويا (اللوحة السفلى). فإنه يتسبب الخوارزمية كفاف نشطة لبدء مع كفاف تعريف يدويا وتنفيذ لتتلاقى على المخطط المطلوب. لهذه الصور صعبة مثل الصورة الأصلية في الشكل 3B، ويقع كروي في خلفية تشتيت وصاخبة. SpheroidSizer ليست قادرة على تحديد كروي بشكل صحيح من خلال طريقة الآلي (اللوحة العلوية) أو عن طريق "دليل تهيئة" أداة التهيئة المناسبة مع (لوحة المتوسطة). في هذه الحالة، يمكن استخدام "رسم اليد" أداة لرسم الخطوط العريضة للكروي يدويا كما هو موضح في اللوحة السفلى. يستخدم البرنامج الحدود المعرفة من قبل المستخدم لقياس المحاور الرئيسية والثانوية للكروي وحساب وحدة التخزين. يتم دمج كل النتائج على الفور تصحيح في "جدول النتائج" ويمكن وفقا لتصديرها.
لتحديد أداء SpheroidSizer في مجموعات البيانات الكبيرة، ونحن أول مقارنة وقت العملية من قبلتحليل نفس المجموعة من الصور باستخدام 288 1) دليل القياسات مع المجهر بائع البرنامج الذي تم توفيره؛ 2) SpheroidSizer مع جهاز كمبيوتر محمول العادية أحادية النواة؛ و 3) SpheroidSizer مع محطة العمل متعددة النواة أداء الحوسبة المتوازية. دليل القياسات اتباع بروتوكول نموذجي لدينا قبل وضع البرنامج: يتم رسمها على طول وعرض كل كروي من جهة، وتقاس باستخدام برنامج بائع (كما رأينا الخطوط الحمراء في لوحة العلوي من الشكل 4A)؛ ثم نسخ المستعمل أسفل قيم القياسات. SpheroidSizer بمعالجة كل صورة عن طريق توليد الحدود كروي (كما هو مبين في مخطط الحمراء في اللوحة السفلى من الشكل 4A)، وقياس طول الرئيسية والثانوية المحوري، وتصدير النتائج في جداول البيانات. كما رأينا في الجدول رقم 1، على أساس حساب من 288 الصور، فإنه يأخذ في المتوسط 31.67 ثانية لقياس كروي واحد لكل صورة يدويا؛ في حين يستغرق سوى SpheroidSizer أقل من 2 ثانية و # 160؛ عند تشغيل الكمبيوتر المحمول العادية أحادية النواة؛ وأقل من 1 ثانية عند تشغيل محطة عمل الأداء 12 النواة. وبالتالي، تحليل الصور هو أكثر من 18X أسرع في الصورة باستخدام SpheroidSizer من دليل القياسات. أنه يقلل بشكل كبير العمل عند أكثر من آلاف الصور وتحليلها. المقبل، ونحن مقارنة التغير في قياسات 24 الكروية هو مبين في الشكل 4A بين القياسات اليدوية وSpheroidSizer. يتم قياس 24 الكروية ثلاث مرات من قبل كل من الأساليب؛ ويتم حساب الانحراف المعياري لكل كروي الفردية. كما رأينا في الشكل 4B، الانحراف المعياري من SpheroidSizer (الخط الأخضر والنقاط) قريبة من الصفر باستثناء الكروية الثلاثة التي يتم تصحيحها في خطوة لمراقبة الجودة، والتي لا تزال تظهر الانحراف المعياري أصغر من تلك التي من طريقة دليل القياسات. كل هذه تشير إلى أن SpheroidSizer ينفذ تحليل الصور بشكل أكثر كفاءة ودقة.
e_content "> أجرينا الشاشة المخدرات باستخدام الأجسام الشبه الكروية BON-1 3D السرطانية البشرية لمعرفة ما الذي يضاعف في تركيبة مع مثبطات hsp90 هي المرشحين المحتملين لاختبار تأثيرات مضادة للورم في الجسم الحي. كانت الأجسام الشبه الكروية الورم BON-1 3D الإنسان نمت على لوحات 96 جيدا المغلفة الاغاروز كما هو موضح في ورقة سابقة 15. تم فحص ثمانية مركبات مختلفة مع ستة التخفيفات المسلسل بالإضافة إلى وسائل الإعلام وسيلة للآثار واحدة واندماجي مع 10 نانومتر و 20 نانومتر hsp90 المانع في التكرارات على التوالي. وكان اثنان من الأجسام الشبه الكروية المستخدمة لكل تركيز مركب الفردية أو المركبات مجتمعة. استخدمت أربع لوحات 96 جيدا مع مجموع 384 الكروية. تم تصوير جميع الأجسام الشبه الكروية في 0، 72، 144، 168، و 192 ساعة. أنتجت ما مجموعه 1،920 الصور من هذه التجربة، واستغرق الأمر 30 دقيقة فقط SpheroidSizer لاستكمال التحليل الحسابي من 1،920 الصور مع 50 دقيقة إضافية لمراقبة الجودة وتصدير البيانات. الكرويةidSizer يسرع عملية تحليل الصور بشكل كبير. الشكل 5A يظهر لقطة شاشة من الترتيبات مجلد وأسماء لهذه التجربة كمثال لبروتوكول الخطوة 3.3. أرقام 5B-E يظهر لقطات الشاشة من تحليل الصور النوافذ المنبثقة والنتائج . باستخدام SpheroidSizer الرسوم التوضيحية للبروتوكول خطوات 4، 5، و 7 أخذ كميات من الأجسام الشبه الكروية 3D من الجدول نتائج تنسيق تصديرها من SpheroidSizer، التي قطعناها على أنفسنا الرسوم البيانية - نمو الورم الكروية 3D على العلاج المركب مقابل الوقت من العلاجات. وترد اثنين من الرسوم البيانية ممثل من هذه التجربة في الشكل 5F و5G. ويبين الشكل 5F أن العلاجات مجتمعة المانع hsp90 وو cladribine (الخط الأخضر) تمنع نمو 3D الكروية أكثر من علاج واحد من مثبطات hsp90 (الخط البنفسجي) و cladribine أو (الخط البرتقالي)، مما يشير إلى أن العلاجات مجتمعة hsp90 المانع و قد يكون و cladribine المضادة للورم EFتأثيرات سلبية في الجسم الحي. ويبين الشكل 5G أن العلاجات مجتمعة المانع hsp90 وأدرياميسين (الخط الأخضر) لا تمنع نمو 3D الكروية أكثر من علاج واحد من أدرياميسين (الخط البرتقالي) أو مثبطات hsp90 (الخط الأرجواني)، مما يدل على أن العلاجات مجتمعة المانع hsp90 وأدرياميسين لا يجوز أن يكون لها آثار مضادة للورم في الجسم الحي. ساعدت هذه التجربة لنا أفضل اختيار لاختبار المركبات تأثيرات مضادة للورم في الجسم الحي وSpheroidSizer هو المفتاح لتحليل البيانات التجريبية العاجل.
الجدول 1. مقارنة بين وقت العملية على تحليل الصور بين القياسات اليدوية وSpheroidSizer عند تحليل نفس مجموعة من 288 صورة. الرجاء ج لعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
الشكل 1 SpheroidSizer -. على تطبيق البرمجيات المفتوحة المصدر لقياس حجم كروي لA) وسير العمل الأساسية لتطبيق B) توضيحات من الخوارزمية كفاف نشطة في مراحل مختلفة من التكرار. يرجى ملاحظة أن كفاف التهيئة (التكرار 0) تم توسيع عمدا من أجل تسليط الضوء على الخوارزمية. C) وقياسات طول محوري الرئيسية والثانوية وحساب مستوى الصوت عن طريق SpheroidSizer. L - المحور الرئيسي: قطاع خط يربط زوج واحد من أبعد نقطة على كفاف (المشار إليها طول)؛ W - المحور البسيط: أطول خط عمودي على محور رئيسي (المشار إليها العرض).
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. نتائج الممثل من تجزئة الآلي SpheroidSizer، والتي تبين قوة ضد مختلف الظروف الصورة. A) وصور ذات نوعية جيدة النموذجية. ب) الصور مع السطوع والتباين مختلفة. C) الصور مع الحطام تشتيت. D) صور الكروية مع جوهر نخرية . الصور في لوحة أعلى كل شخصية هي المصدر / الصور الأصلية؛ الصور في اللوحة السفلى من كل شخصية هي الصور مراقبة الجودة؛ ومخطط الحمراء هو تجزئة كروي رسمها حساب الآلي.
hres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
الرقم 3. توضيحات من "تهيئة يدوي" و "اليد رسم" الأدوات. أ) "دليل تهيئة" أداة تسمح للرسم شكل القطع الناقص المناسب عبر كروي للتهيئة، وعندما يحدث غير دقيقة كروي تجزئة بعد التهيئة الآلي. B ) إن "اليد رسم" أداة تسمح ناحية دقة رسم الحدود كروي، عندما تحدث الإنقسامات كروي دقيق مع كل من الآلية واليدوية التهيئة. الخط الازرق حول كروي يدل على كفاف التهيئة؛ مخطط الحمراء هي الحدود التي تم تحديدها كروي. يرجى ملاحظة أن كروي في "تهيئة يدوي" في A) وكروي في "رسم اليد" في B) يتم تكبير عمدا لعرض أفضل الأدوات.
الشكل 4. مقارنة أداء تحليل الصور بين SpheroidSizer ودليل القياسات عند تحليل نفس مجموعة من 24 صور. أ) الأجسام الشبه الكروية الممثل لإظهار كيف يتم تحديد طول وعرض الأجسام الشبه الكروية من قبل دليل القياسات وSpheroidSizer. أعلى 24 تحتوي على صور مرسومة باليد طول / عرض كل كروي في الخطوط الحمراء باستخدام قياسات دليل؛ انخفاض 24 صور (نفس الصور 24) يحتوي مرسومة الكمبيوتر الحدود كروي في مخطط الحمراء باستخدام SpheroidSizer. ب) الانحراف المعياري لطول أو عرض من ثلاثة قياسات على كل كروي الفردية.
الشكل 5. مثال ممثل استخدام كرويبحجم الشاشة في المخدرات - تحليل الصور على صور الأجسام الشبه الكروية 'التي تم جمعها من شاشة المخدرات باستخدام الأجسام الشبه الكروية الورم BON-1 3D A) لقطة شاشة الترتيبات مجلد وأسماء الملفات لهذا المشروع B) لقطة شاشة متقدمة. تكوينات في إطار SpheroidSizer. C) لقطة شاشة SpheroidSizer1.0 نافذة مع نتائج عرض الجدول. D) لقطة شاشة ملف الإخراج تنسيق تصديرها من SpheroidSizer. E) لقطة شاشة ملف الإخراج القائمة التي تم تصديرها من SpheroidSizer. F) نمو الورم 3D الأجسام الشبه الكروية على العلاج مع مثبطات hsp90 وو cladribine. G) نمو الورم 3D الأجسام الشبه الكروية على العلاج مع مثبطات hsp90 وأدرياميسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. </ ع>
Discussion
تقدم هذه الدراسة برنامجا سريعة ومرنة وفعالة ومؤتمتة - SpheroidSizer لتحديد دقيق لحجم الورم الكروية 3D. SpheroidSizer هي سهلة الاستخدام ويتطلب الحد الأدنى من إدخال المستخدم. الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لدقيقة والسلسة والناجحة لSpheroidSizer ما يلي: أن يتم تصوير الأجسام الشبه الكروية في وسط الميدان دون لمس حافة البئر؛ يجب تصوير كل الملفات التي سيتم تحليلها معا في مشروع واحد تحت نفس المجهر مع نفس الهدف؛ تتم تسمية كافة الملفات بشكل صحيح ليتم تحليلها وترتيبها كما هو مبين في البروتوكول؛ ويتم إدخال الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم الصحيح قبل حساب.
وتشمل مزايا SpheroidSizer قدرته على تحمل التغيير التدريجي الخلفية في الصورة وكذلك لتوليد ملامح ناعمة والتي تتوافق مع الأشكال كروية العامة للالأجسام الشبه الكروية باستخدام خوارزمية كفاف نشطة. أداء نشطيمكن المساس كفاف في حالتين: الفقراء التهيئة، أو وجود حواف المحلية الأخرى تشتيت من كفاف المطلوب. وتحديدا في قضايانا اختبار، والحالة الثانية يحدث أحيانا عندما جوهر نخرية من كروي كبير يجذب كفاف كفاف نشطة مما أدى إلى أصغر يجري الإبلاغ عنها. تجدر الإشارة إلى أن أساليب القائم على عتبة الآلي الأخرى تعاني أيضا في هذه الحالة إلا إذا تم تعيين عتبة تحديدا باليد. وبالتالي فإن البرنامج يضع قدما جهدا لمساعدة المستخدمين على اكتشاف ومعالجة تجزئة للخطر من خلال توفير ميزات سهلة لمراقبة الجودة. إذا حدث خطأ تجزئة من سوء التهيئة، يمكن استخدام الاستخدامات "دليل تهيئة" أداة لتجاوز التهيئة الآلي. عندما جودة الصورة رديئة جدا بالنسبة كفاف النشطة، يمكن للمستخدمين بسهولة "اليد رسم" كفاف التي تغذي الكمي. البرامج الموجودة مثل CellProfiler يمكن تكييفها لهذا التطبيق في البلا شبه الآلين. سير العمل يمكن أن تكون مرهقة عندما يتم عرض كميات كبيرة من الصور مع ظروف التصوير المختلفة أو عند مجموعة فرعية من الصور يحتاج الى مزيد من التدخل البشري لقياس صحيح. يوفر SpheroidSizer جناح الكل في واحد لحساب ومراقبة الجودة لإدارة الإنتاجية العالية تحليل الصور سير العمل.
SpheroidSizer يقتصر حاليا على الكشف عن كروي واحد في الصورة ويقيس فقط طول محوري من كروي. ويمكن تمديد البرنامج لدعم مزيد من التحديد الكمي التي يحتاجها الباحثون مثل الكمي على الأجسام الشبه الكروية مع جوهر نخرية، والكشف عن الأجسام الشبه الكروية متعددة في صورة واحدة أو رصد شكل الأجسام الشبه الكروية. علاوة على ذلك، يمكن تعديل البرنامج لكشف وقياس حجم الأورام رفعه من الحيوان أو الإنسان، والتي ستكون بالتأكيد مفيدة للباحثين عند إجراء المجراة ما قبل السريرية أو البحوث السريرية. ويمكن أيضا تجهيز آخر من الأجسام الشبه الكروية الكشف عن الهدف من التحقيقجي إلى تقليل جهد البشرية اللازمة لمراقبة الجودة وتحسين الإنتاجية أخرى. SpheroidSizer هو معمم تطبيق تحليل الصور لالكروية الورم 3D التي يتم إنتاجها من أي أنواع الخلايا، وبالتالي يمكن استخدامها من قبل مجتمع أبحاث السرطان واسعة.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر مؤسسة ريموند وبيفرلي ساكلر لدعمهم في أبحاثنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | microscope for imaging | |
| Vostro 1720 | Dell Inc. | single-core regular laptop | |
| HP Z820 | HP Inc. | multi-core performance workstation | |
| MATLAB and Simulink R2013a | Mathworks, Inc, Natick, MA | MATLAB software |
References
- Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
- Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
- Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
- Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
- Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
- Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
- Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).
