De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

Summary

Nós apresentamos uma aplicação de alto rendimento software de análise de imagens para medir o tamanho de esferóides tumorais tridimensionais fotografada com microscopia de campo claro. Esta aplicação fornece uma maneira rápida e eficaz para examinar os efeitos de drogas terapêuticas em esferóides, o que é benéfico para os pesquisadores que desejam usar esferóides em telas de drogas.

Abstract

O número crescente de aplicações de três dimensões (3D) esferóides tumorais como um modelo in vitro para a descoberta de medicamentos exige a sua adaptação aos formatos de triagem em larga escala em todas as etapas de uma tela de drogas, incluindo a análise de imagens de grande escala. Atualmente não há nenhum software de análise de imagem ready-to-use e livre para conhecer este formato em grande escala. A maioria dos métodos existentes envolvem puxando manualmente o comprimento e largura dos esferóides 3D fotografada, o que é um processo tedioso e demorado. Este estudo apresenta uma aplicação de software de análise de imagem de alto rendimento - SpheroidSizer, que mede o maior e menor comprimento axial dos esferóides tumorais 3D fotografada automaticamente e com precisão; calcula o volume de cada indivíduo esferóide tumor 3D; em seguida, exibe os resultados em duas formas diferentes em planilhas para manipulações fáceis na posterior análise de dados. A principal vantagem deste software é o seu poderoso aplicativo de análise de imagem que éadaptado para o grande número de imagens. Ele oferece computação de alto rendimento e fluxo de trabalho de controle de qualidade. O tempo estimado para processar 1.000 imagens é de cerca de 15 min em um laptop minimamente configurado, ou cerca de 1 min em um desempenho de estação de trabalho multi-core. A interface gráfica do usuário (GUI) também é projetado para fácil controle de qualidade, e os usuários podem substituir manualmente os resultados de computador. O método de chave usada neste software é adaptado a partir do algoritmo de contorno ativo, também conhecido como Snakes, o que é especialmente adequado para imagens com iluminação desigual e fundo ruidoso que muitas vezes assola o processamento automatizado de imagens em telas de alto rendimento. O "Inicializar Manual" de cortesia e ferramentas "tração da mão" fornecem a flexibilidade para SpheroidSizer em lidar com vários tipos de esferóides e diversas imagens de qualidade. Esta alta taxa de transferência de software de análise de imagem reduz notavelmente trabalho e acelera o processo de análise. A implementação deste software é beneficial para esferóides tumorais em 3D para tornar-se uma rotina de modelo in vitro para as telas de drogas na indústria e na academia.

Introduction

Tridimensional (3D) esferóides tumorais são "agregados esfericamente simétricas de células tumorais análogas aos tecidos, sem substrato artificial para a fixação das células" ^1-3. A citologia e morfologia do tumor esferóides melhores imita a organização in vivo do tecido do tumor e nas células do que microambientes (2D) de monocamadas bidimensionais. Esferóides tumorais 3D tornaram-se um modelo prático in vitro para exames de alto rendimento de drogas terapêuticas anti-câncer ou examinar a eficácia de drogas candidatos antes in vivo animal ou o teste clínico ^4. Clinicamente, a eficácia de um tratamento anti-cancro é avaliada com base no crescimento do tumor reduzido. Analogamente, o volume de esferóide pode ser usado como uma medida da eficácia para estudos in vitro da droga de cancro. Volume de esferóide (V = 0,5 * Comprimento * Largura ²⁾ é determinado com base no maior e menor comprimento axial (mais comumente conhecido como comprimento e largura)dos esferóides ^{6, 7.} A maioria dos pesquisadores tem que desenhar manualmente o comprimento ea largura de cada esferóide, muitas vezes usando o software oferecido por empresas de microscopia e vendido juntamente com os instrumentos de imagem. Esta técnica torna-se problemática quando as telas de drogas de alto rendimento são realizados e mais de centenas de imagens são produzidas. Alguns estudos recentes relataram o uso de imagem de origem caixas de ferramentas de software de análise abertos, como CellProfiler ^8-10 e ImageJ ¹¹ para desenvolver rudimentares rotinas de segmentação / macros que envolveu a correção de iluminação e limite simples. Estas rotinas muitas vezes precisam ser reajustado para diferentes lotes de imagens de acordo com a condição de iluminação ea imagem mudança contraste; portanto, estes pacotes de software não pode cumprir a exigência robustez da análise de imagem de alto rendimento. Friedrich e colaboradores (2009) utilizaram o software proprietário para medir o volume semi-autom do esferóideaticam ^5. O método descrito no Monazzam papel e dos seus colegas ¹⁰ era um método semi-automático para medir o tamanho do esferóide apenas para um pequeno número de imagens. Portanto, existe uma clara necessidade de ferramentas robustas, flexíveis e automatizados de análise de imagem ready-to-use para os esferóides tumorais 3D.

Neste estudo, descrevemos SpheroidSizer - um aplicativo de software baseado em MATLAB e open-source para medir o tamanho de esferóides tumorais automaticamente e com precisão. SpheroidSizer é projetado para processar muitos lotes diferentes de imagens de esferóides 3D na mesma sessão. Utilizando o algoritmo de contorno ativo ^12-14, SpheroidSizer pode tolerar mudança contraste da imagem, de forma robusta ignorar a mudança gradual na iluminação de fundo e reconhecer esferóides na imagem. Ele também pode tolerar muitos artefatos usuais, por exemplo, detritos, originado a partir da amostra. O fluxo de trabalho é projetado para que os usuários podem executar contro qualidadel, durante ou após o cálculo. De substituição manual do resultado da análise pode ser facilmente realizado no local. Aproveitando-se da caixa de ferramentas de computação paralela, a velocidade de análise pode ser ainda mais impulsionado pela coordenação de múltiplos núcleos de computação para trabalhar no cálculo simultaneamente no computador de um usuário. Além disso, SpheroidSizer apresenta os resultados em duas formas diferentes para permitir facilitar a interface com as ferramentas de análise a jusante.

Protocol

1. 3D formação esferóides tumor, tratamentos com medicamentos e coleta de imagem são realizados como descrito em nosso estudo anterior ^15.

2. Instalação de Software

1. Instale o software MATLAB licenciado para o computador utilizado para a análise de imagens. As seguintes caixas de ferramentas do MATLAB também são obrigados a ser instalado - Signal Processing caixa de ferramentas, caixa de ferramentas de processamento de imagem, e Parallel Computing toolbox * (* necessário para o modo de computação paralela apenas).
   NOTA: Muitas universidades comprar e manter as licenças de grupo para que o software é livre para ser baixado e usado por cientistas filiados.
2. Instalar programa SpheroidSizer de arquivo SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. Salve o arquivo zip em seu sistema de arquivos local.
   2. Descompacte o arquivo SpheroidSizer.
   3. Salve os arquivos em um diretório / pasta designada, que será posteriormente referido como tele "Diretório de Instalação".
      NOTA: SpheroidSizer foi amplamente testado em um sistema operacional Windows 7. Espera-se para trabalhar em sistemas operacionais alternativos com ajustes mínimos (não foi testado).

3. Preparação para a Análise de Imagem por SpheroidSizer

1. Determine a resolução / escala da imagem do sistema de imagem (escala absoluta da imagem em microns por pixel (mm / pix)).
   NOTA: Se o tamanho de cada pixel no chip da câmera é conhecido, a escala da imagem pode ser calculado como o tamanho ampliação da objetiva x pixel (um / pix). Este valor pode ser obtido a partir do software de imagem equipado com o microscópio como metadados incorporados ou com a ajuda do fornecedor do sistema de imagem. Este valor será exigido no Passo 4.6.
2. Converter todos os formatos de arquivo de imagem proprietárias para os formatos de arquivo aceitos - TIFF, JPEG e outros formatos de arquivo de imagem comuns.
3. Nomeie os arquivos de imagem e organizar directories (Figura 5A).
   NOTA: O software conta com a disposição adequada de estrutura de diretórios e nomes de arquivos para formatar os resultados em formato de placa:
   1. Nomeie os arquivos de imagem com o seguinte formato: [nome da placa] _ [linha] [coluna] [extensão] ou [nome da placa] [espaço] [linha] [coluna] [extensão]... [Linha] segue a ordem alfabética e [coluna] segue a ordem numérica.
      NOTA: Disponível gratuitamente software renomeação lote automática pode ser encontrada para auxiliar os usuários nesta etapa.
   2. Organizar o diretório / pasta com base na experiência da seguinte forma: Cada experimento deve ter um diretório. Sob diretório de cada experimento, deve haver subdiretórios para cada ponto de tempo. No âmbito de cada subdiretório ponto de tempo, deve haver todas as imagens de todas as placas.
      NOTA: Para que os resultados da análise a ser perfeitamente ordenados nos resultados formatados, sugerimos manter o mesmo número de dígitos para cada identificador através do preenchimento de 0 a lEFT, por exemplo, os momentos são nomeados como 000H, 072H, 144H e.

4. Análise de Imagem do Spheroids por SpheroidSizer

1. Abrir MATLAB, em seguida, abra o "Janela de Comando", digite cd '[Diretório de Instalação]' e pressione [RETURN].
2. Digite "SpheroidSizer1_0" no "Janela de Comando" e pressione [RETURN] para iniciar o programa SpheroidSizer.
3. Clique no botão "Browse" na janela SpheroidSizer1.0 para selecionar o diretório experimento que contém todas as imagens.
4. Selecione "Incluir subpastas" toggle sob o "Folder" campo de texto para processar várias pastas de imagem aninhados sob o diretório designado.
   NOTA: Se a opção "Incluir subpastas" toggle não estiver selecionada, apenas as imagens diretamente sob o diretório são processados, e todas as subpastas são ignorados.
5. Selecione a opção "display on-the-fly" para dispcolocar cada imagem segmentada em cima de sua imagem de origem para o controle de qualidade, como o cálculo está sendo executado.
   NOTA: A velocidade de Computação é mais rápido se a opção "On-the-fly exibição" não é escolhido.
6. Especifique "Resolução" (escala de imagem / resolução em um / pix) das imagens analisadas na caixa, para o programa para converter corretamente as medidas do esferóide de pixel para mM.
   NOTA: Todas as imagens na mesma pasta ou analisados ​​em conjunto devem ser tomadas sob o mesmo microscópio com o mesmo objetivo, de modo que a escala da imagem / resolução permanece constante para cada experimento.
7. (Opcional) os usuários podem acompanhar o passo 5 para as configurações definidas pelo usuário avançado.
8. Clique em "Calcular" para iniciar o cálculo.
   NOTA: O software realiza uma verificação de nome de arquivo automático antes de prosseguir para a computação. Se uma caixa de diálogo aparece indicando - "Erro existe no nome do arquivo", clique em "Sair e lista de erros mostrar"e corrigir os erros em nomes de arquivos listados (ver Passo 3.3). Em seguida, clique em "Calcular" para iniciar o cálculo novamente.
9. Clique no botão "Pause" para parar o cálculo; e computação podem ser retomadas, clicando no mesmo botão que mostra em "Continuar".
   NOTA: O "Resultados da Mesa" exibe o "Folder", "Arquivo", "Volume" (em mm ^3), "comprimento" (em mm), (caixa de seleção) "Válido" "largura" (em mm), e para todos os esferóides analisados ​​(Figura 5C). O volume é calculado com base na medida do eixo maior (comprimento) e um eixo menor (largura) (V = 0,5 * comprimento * largura ^2). A caixa de seleção "Válido" é uma opção para que o usuário escolha se a análise da imagem é válida ou inválida após controle de qualidade, consulte a Etapa 6.

5. Configurações definidas pelo usuário avançadas

1. Clique no botão "Avançado" na SpheoidSizer1.0 janela para abrir a janela de configurações avançadas, a fim de ajustar as configurações definidas pelo usuário (Figura 5B).
2. Digite os nomes dos arquivos de interesse na "Output Format" e caixas de "saída da lista" na janela Configurações Avançadas, em "Input".
3. Digite um número de "2-10" na caixa "Reduzir". Este é um coeficiente para o software para reduzir o tamanho de imagem em computação, a fim de melhorar a velocidade de computação. Quanto maior o número, maior será a velocidade de computação. O padrão "Reduzir" está definido para 10.
4. Digite a extensão do arquivo de imagem a-ser-processados ​​na caixa "Incluir tipo".
5. Entre as extensões de arquivo de imagem ou fins que não vão ser processados ​​pelo programa na caixa "Excluir tipo" como se segue: "_crude.jpg".
6. Escolha "None" para "Cor Especial" para processar 8 bits e 16 bits colou imagens corretamente; escolha "12 bits" para "Cor Especial" para processar imagens a cores de 12 bits corretamente
7. Marque a opção "Use computação paralela" se o computador utilizado para a análise de imagem é equipado com múltiplas CPUs e / ou CPUs multi-core. Se isso for verdade, então vá para o passo 5.7.1; se não, então pular etapas 5.7.1 e 5.7.2.
   NOTA: Um erro ocorrerá se o computador a ser utilizado não suporta a configuração escolhida.
   1. Marque a opção "Use Computação Paralela" na janela de Configurações Avançadas.
      NOTA: Só use o modo de computação paralela, quando 4 ou mais núcleos estão disponíveis para o computador.
   2. Digite um número de 4-12 nos "# Trabalhadores" (computação núcleos) caixa.
      NOTA: Este número não tem de ser igual ou menor do que o número de núcleos de computação em computador do utilizador. Um máximo de 12 é imposta pelo MATLAB computação paralela caixa de ferramentas suporta o máximo de 12 núcleos. Quando a computação paralela é sering executado, uma pequena caixa de diálogo é exibida solicitando que o usuário para esperar a computação paralela ao fim; o cálculo não pode ser interrompido, e nem é o recurso de "On-the-fly exibição" que está sendo executado no modo de computação paralela.

6. Controle de Qualidade

1. Clique na célula correspondente na "Tabela de resultados" para confirmar o contorno limite preciso de um esferóide nas imagens analisadas,
   NOTA: As imagens originais eo controle de qualidade vai aparecer no lado direito para revisão. O usuário pode examinar todas as imagens em seqüência usando a seta para baixo no teclado.
2. Refinar o limite do esferóide sobre a imagem seleccionada, utilizando os dois instrumentos seguintes, se necessário:
   1. Clique no botão "Inicializar Manual" para exibir a imagem original. Em seguida, clique e segure o botão direito do mouse fora do esferóide e arraste a ferramenta elipse para cobrir o esferóide sobre a imagem original.
      NOTA: A umalgoritmo ctive-contorno inicia usando o contorno enviado pelo usuário e executa a convergir para o contorno desejado esferóide. O "Resultados da Mesa" será atualizado automaticamente com os novos resultados. A ferramenta "Inicializar Manual" permite que o usuário fornecer manualmente inicialização para ativa-contorno.
   2. Clique no botão "Mão sorteio" para exibir a imagem original. Em seguida, use o mouse ou uma tela de toque habilitado para desenhar com precisão o limite do esferóide.
      NOTA: Este esquema é medido diretamente para gerar eixos maior e menor, que são atualizados na "Tabela de Resultados". A ferramenta "Hand Sorteio" só é usado quando a função "Inicializar Manual" não convergem para o limite desejado do esferóide.
3. Desmarque a caixa de seleção na coluna "Valid" na linha correspondente da "tabela de resultados", quando uma imagem não contém qualquer esferóide válida após a inspeção. Um "; Rótulo inválido "aparece no canto superior esquerdo da imagem de controle de qualidade. Se "Válido" estiver desmarcada, os valores de todas as medições estão vazias para o esferóide nos arquivos de resultados formatados e saída exportados.
   Nota: Os seguintes atalhos de teclado estão disponíveis para uso na "Tabela de resultado": "seta para baixo" próxima imagem; "V" de válido / inválido; "M" para a ferramenta "Inicializar Manual" e "h" para a ferramenta "Desenhar Hand".

7. Salvar e exportar dados

1. Clique no botão "Estudo Export" na janela SpheroidSizer1.0 para exportar o estado intermediário da análise, se o usuário precisa para sair do software antes de terminar o projeto. Especifique o nome eo diretório do arquivo a ser salvo.
2. Clique no botão "Importar Study" para trazer de volta o resultado estado intermediário acima do "Estudo Export" e continuar a work sobre ele.
   NOTA: Os arquivos estaduais intermediários estão em um formato MATLAB nativa (mat.) E não são diretamente legíveis por quaisquer outros programas de software. Um recurso de segurança embutido no software torna as exportações automáticas do projeto aberto no caso de o programa sai involuntariamente. Quando necessário, o usuário pode encontrar esse arquivo, cujo nome começa com "~ tmp", que contém o carimbo de tempo correspondente no [Diretório de Instalação].
3. Clique em "Results Format" na janela SpheroidSizer1.0 para salvar os resultados.
   NOTA: Duas formas de resultados são salvos no diretório do experimento. Os nomes de arquivos exportados podem ser configurados na janela de configurações avançadas (ver Protocolo Passo 5.2). O arquivo de saída é um formato de mesa delineado-guia que organiza o valor de volume no formato de placa original na ordem de um número da placa ascendente para cada ponto de tempo; e todos os momentos são organizados em ordem crescente (Figura 5D). A lista output arquivo é uma tabela delineado-guia que contém todas as medidas na forma de listas ordenadas (Figura 5E).

Representative Results

SpheroidSizer é projetada para produzir detecção automática, delimitação e mensuração dos esferóides 3D, com mão de obra extremamente reduzida e de forma aguda o aumento da eficiência para grandes quantidades de imagens. Figura 1A mostra o fluxo de trabalho de SpheroidSizer. Os passos básicos de computação incluem inicialização automática, o algoritmo de contorno ativo e contorno quantificação. Após automatizado de computação, o recurso de controle de qualidade utiliza uma combinação de "Inicializar Manual" e ferramentas "tração da mão" para salvar qualquer segmentação imperfeito. Figura 1B ilustra o algoritmo de contorno detalhado automatizado ativo. A etapa de inicialização (iteração 0) utiliza os passos básicos de processamento de imagem para gerar tamanho aproximado e localização do esferóide e gerar um contorno iniciação esférica com um tamanho estimado. O contorno iniciação alimenta o algoritmo de contorno ativo. Por sua vez ele itera para ajustar de acordo com a imagem localgradiente de forma e curvatura. O algoritmo de contorno activo termina quando o contorno estabiliza (converge), ou seja, 477 iterações para esta imagem, ou quando o número máximo pré-definido de iterações é executado. Neste exemplo, o contorno de inicialização é propositadamente ampliada para melhor mostrar o algoritmo. Na realidade, a inicialização é normalmente muito perto do limite real e muito menos iterações são necessários para o algoritmo de convergir. Posteriormente, o algoritmo leva medidas morfométricas do limite esferóide detectado. Os eixos maior e menor do esferóide são mensurados usando MATLAB toolbox de processamento de imagem (Figura 1C). O eixo principal é definido como o segmento de linha de ligação de um único par de os pontos mais distantes do contorno, o que é referido comprimento (L). O eixo menor é definida como a linha mais longa perpendicular ao eixo principal, que é a que se refere a largura (W). Neste caso, os valores de L e W são muito estreita desde oesferóide é esférica. O volume do esferóide é calculada como V = 0,5 * L * W ^2.

Uma das características de SpheroidSizer é a sua detecção automática do limite dos esferóides mesmo em imagens com fundo irregular ou com ruído utilizando o algoritmo de contorno ativo (Figuras 2B-D). Processamento computacional de imagens de campo luminoso é frequentemente assolada por fundo irregular, o que engana os métodos baseados em limiarização adaptativa para produzir resultados indesejados limiarização. O problema é particularmente evidente quando as placas multi-poços são utilizados e as paredes dos poços pode criar efeitos de sombreamento sobre as imagens. No entanto, porque o algoritmo de contorno activo não é sensível à mudança protecção gradual no fundo, que é capaz de identificar a segmentação do esferóide nestas imagens de campo brilhante com uma inicialização adequada. Figura 2 mostra alguns exemplos de imagens com fundo irregular ou ruidoso, como desigual iluminação (Figura 2B (figura 2C) ou necrótica (Figura 2D). Com o algoritmo automatizado contorno activo, SpheroidSizer delineia esses esferóides com precisão em todas estas imagens, como mostrado no contorno vermelho no painel inferior de cada figura.

O recurso de SpheroidSizer de controle de qualidade é a chave para um fluxo de trabalho de alto rendimento. O "Inicializar Manual" e ferramentas "tração da mão" são as ferramentas complementares valiosas para esta aplicação. Entre centenas ou milhares de imagens, é inevitável que o algoritmo automatizado não é capaz de detectar correctamente os esferóides em algumas imagens. Como ilustrado na Figura 3A, quando a detecção imprópria do esferóide é causada devido à etapa de inicialização, ou seja, tamanho inadequado ou localização do contorno iniciação na imagem (painel superior), a ferramenta "Inicializar Manual" funciona, permitindo que o usuário corretamente definir a localização e tamanho do spheroid manualmente (painel inferior). Ele aciona o algoritmo de contorno ativo para iniciar com o contorno definido manualmente e executar a convergir para o contorno desejado. Por essas imagens difíceis como a imagem original na Figura 3B, o esferóide está localizado em um fundo perturbador e barulhento. SpheroidSizer não é capaz de identificar corretamente o esferóide pelo método automatizado (painel superior) ou pela ferramenta "Inicializar Manual" com inicialização adequada (painel do meio). Neste caso, a ferramenta "Desenhar mão" pode ser utilizado para desenhar manualmente o contorno do esferóide, tal como ilustrado na parte inferior do painel. O programa usa o limite definido pelo usuário para medir os eixos maior e menor do esferóide e calcular o volume. Todos os resultados são imediatamente corrigidos incorporada no "Resultados da Mesa" e pode ser exportado em conformidade.

Para determinar o desempenho de SpheroidSizer em conjuntos de dados maiores, primeiro comparar o tempo de operação poranalisar o mesmo conjunto de 288 imagens usando um) a medição manual com o fornecedor microscópio software fornecido; 2) SpheroidSizer com um laptop normal single-core; e 3) SpheroidSizer com um multi-core desempenho de computação paralela da estação de trabalho. As medições manuais para o nosso protocolo típico antes de desenvolver o software: o comprimento ea largura de cada esferóide são desenhados à mão e medida usando o programa de fornecedores (como visto as linhas vermelhas na parte superior do painel da Figura 4A); em seguida, as cópias do utilizador estabelece os valores das medições. SpheroidSizer processa cada imagem, gerando o limite esferóide (como mostra o contorno vermelho no painel inferior da Figura 4A), a medição da maior e menor comprimento axial, e exportar os resultados em folhas de cálculo. Como pode ser visto na Tabela 1, com base no cálculo das 288 imagens, que leva uma média de 31.67 segundos para medir um esferóide por imagem manualmente; enquanto ele só tem SpheroidSizer menos de 2 segundos e # 160; quando executado em um laptop normal single-core; e menos de 1 segundo quando rodando em um desempenho de estação de trabalho de 12 núcleos. Portanto, a análise de imagens é mais de 18x mais rápido por imagem usando SpheroidSizer de medições manuais. Ele reduz drasticamente o trabalho quando são analisados ​​mais de milhares de imagens. Em seguida, comparar a variabilidade nas medições dos 24 esferóides mostrados na Figura 4A entre as medições manuais e SpheroidSizer. Os 24 esferóides são medidos três vezes por ambos os métodos; e o desvio padrão de cada indivíduo esferóide é calculado. Como visto na Figura 4B, o desvio padrão de SpheroidSizer (linha verde e pontos) é próximo de zero, exceto para os três esferóides que são corrigidos na etapa de controle de qualidade, que ainda mostram o desvio padrão menor do que os do método de medição manual. Todos estes indicam que SpheroidSizer executa a análise de imagem de forma mais eficiente e com precisão.

e_content "> Foi realizada uma tela de drogas usando esferóides BON-1 de tumores humanos em 3D para saber quais compostos em combinação com um inibidor da hsp90 são os potenciais candidatos para testar os efeitos anti-tumorais in vivo. esferóides tumorais BON-1 3D Humanos foram cultivadas em placas de 96 poços revestidas de agarose como descrito no documento anterior ^15. Oito compostos diferentes com seis diluições em série mais meios e veículos foram testados para os seus efeitos individuais e combinatórias com 10 nM e 20 nM de inibidor de Hsp90 em duplicado, respectivamente. Dois esferóides foram utilizados para cada concentração do composto individual ou os compostos combinados. Foram utilizadas quatro placas de 96 poços com um total de 384 esferóides. Todos os esferóides foram fotografadas a 0, 72, 144, 168, e 192 horas. Um total de 1.920 imagens foram produzidas a partir desta experiência. Demorou SpheroidSizer apenas 30 min para completar a análise computacional dos 1.920 imagens com um 50 min adicional para o controle de qualidade e exportação de dados. SpheroidSizer acelera o processo de análise de imagem enormemente. Figura 5A mostra uma captura de tela dos arranjos pastas e nomes de arquivos para esta experiência como um exemplo para Protocolo Passo 3.3. Figuras 5B-E mostra as capturas de tela da análise de imagem janelas pop-up e resultados . usando SpheroidSizer como ilustrações para o protocolo passos 4, 5 e 7 Tomando os volumes dos esferóides 3D a partir dos resultados tabela formatada exportado de SpheroidSizer, fizemos gráficos - crescimento de esferóides tumorais 3D sobre tratamentos compostos versus tempo de tratamentos. Dois gráficos representativos desta experiência são mostrados na Figura 5F e 5G. Figura 5F mostra que os tratamentos combinados de inibidor hsp90 e cladribina (linha verde) inibem o crescimento de esferóides 3D mais do que o único tratamento de inibidor hsp90 (linha roxa) ou cladribina (linha laranja), sugerindo que os tratamentos combinados de inibidor e hsp90 cladribina pode ter ef antitumoralfects in vivo. Figura 5G mostra que os tratamentos combinados de inibidor de Hsp90 e adriamicina (linha verde) não inibe o crescimento de 3D ​​esferóides mais do que o tratamento único de adriamicina (linha laranja) ou inibidor de hsp90 (linha roxa), sugerindo que o tratamentos combinados de inibidor de Hsp90 e adriamicina não pode ter efeitos anti-tumorais in vivo. Esta experiência nos ajudou a melhor escolha dos compostos para testar os seus efeitos anti-tumorais in vivo e SpheroidSizer é a chave para a análise de dados experimentais rápida.

Tabela 1. Comparação do tempo de operação em análise de imagem entre as medidas manuais e SpheroidSizer ao analisar o mesmo conjunto de 288 imagens. favor clamber aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Figura 1 SpheroidSizer -... Uma aplicação de software de código aberto para medir o tamanho do esferóide A) O fluxo de trabalho do núcleo da aplicação B) Ilustração do algoritmo de contorno ativo em diferentes estágios de iteração. Por favor, note que o contorno de inicialização (iteração 0) foi propositalmente ampliada, a fim de mostrar o algoritmo. C) As maiores e menores medidas de comprimento axial e cálculo do volume por SpheroidSizer. L - eixo maior: o segmento de linha de ligação de um único par de pontos mais distantes do contorno (referido comprimento); W - eixo menor: a linha mais longa perpendicular ao eixo maior (referida largura).

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Figura 2. Resultados representativos da segmentação automática de SpheroidSizer, demonstrando robustez contra várias condições de imagem. A) imagens de boa qualidade típica. B) imagens com diferentes brilho e contraste. C) Imagens com escombros distração. D) Imagens de esferóides com núcleo necrótico . Imagens no topo do painel de cada figura são as / imagens originais de origem; imagens no painel inferior de cada figura são as imagens de controle de qualidade; eo contorno vermelho é a segmentação esferóide desenhada por cálculo automatizado.

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Figura 3. Ilustração da "Inicializar Manual" e "Hand Empate" ferramentas. A) A ferramenta "Manual Inicializar" permite que o desenho de uma forma de elipse montagem em todo o esferóide para inicialização, quando a segmentação esferóide imprecisas ocorre após a inicialização automática. B ) A ferramenta "Hand Sorteio" permite que o desenho da mão precisa do limite esferóide, quando segmentações esferóides imprecisos ocorrer com a inicialização tanto automatizado e manual. A linha azul ao redor do esferóide mostra o contorno de inicialização; o contorno vermelho é o limite esferóide identificados. Por favor, note que o esferóide em "Inicializar Manual" em A) e do esferóide em "Desenhar Hand" em B) é propositadamente ampliadas para melhor mostrar as ferramentas.

Comparação de imagem desempenho análise entre SpheroidSizer e medições manuais quando se analisa o mesmo conjunto de 24 imagens Figura 4.. A) esferóides representativos para mostrar como o comprimento e largura de esferóides são determinados por medições manuais e SpheroidSizer. Top 24 imagens contêm desenhado à mão comprimento / largura de cada esferóide em linhas vermelhas usando medições manuais; menores de 24 imagens (as mesmas 24 imagens) contêm desenhado por computador limite esferóide em contorno vermelho usando SpheroidSizer. B) O desvio padrão de comprimento ou largura de três medições em cada esferóide individual.

Figura 5. Um exemplo representativo da utilização de esferóideSizer em tela de drogas - análise de imagem em imagens dos esferóides que foram coletados a partir de uma tela de drogas usando esferóides tumorais BON-1 3D A) A captura de tela dos arranjos das pastas e nomes de arquivos para este projeto B) A captura de tela do avançado.. janela configurações em SpheroidSizer. C) A captura de tela da janela SpheroidSizer1.0 com resultados exibidos Table. D) A captura de tela do arquivo de saída formato exportado de SpheroidSizer. E) A captura de tela do arquivo de saída lista exportada de SpheroidSizer. F) Crescimento de esferóides tumorais em 3D sobre os tratamentos com inibidor hsp90 e cladribina G) Crescimento de esferóides tumorais em 3D sobre os tratamentos com inibidor hsp90 e adriamicina.. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>

Discussion

Este estudo apresenta um programa rápido, flexível, eficiente e automatizado - SpheroidSizer para determinação precisa do tamanho do tumor esferóides 3D. SpheroidSizer é fácil de usar e não requer entrada do usuário mínima. Os passos mais críticos para a execução precisa, suave e bem sucedida de SpheroidSizer incluem: que os esferóides são espelhados no centro do campo, sem tocar a borda do poço; todos os arquivos a serem analisados ​​em conjunto, como um projeto deve ser trabalhada sob o mesmo microscópio com o mesmo objetivo; todos os arquivos a serem analisados ​​estão corretamente nomeadas e organizadas conforme indicado no protocolo; e as configurações definidas pelo usuário corretas são inseridas antes de computação.

As vantagens de SpheroidSizer incluem a sua capacidade para tolerar mudanças graduais fundo da imagem, bem como para gerar contornos suaves que correspondem às formas esféricas gerais dos esferóides utilizando o algoritmo de contorno activo. Desempenho de ativocontorno pode ser comprometida em duas situações: má inicialização, ou a presença de outras bordas locais distrair o contorno desejado. Especificamente em nossos casos testados, a segunda situação, por vezes, acontece quando o núcleo de necrose de uma grande esferóide atrai o contorno ativo, resultando em menor contorno que está sendo relatado. Vale a pena notar que outros métodos baseados em limiares automáticos também sofrem nesta situação, a menos que o limite é definido especificamente com a mão. Por isso, o software apresenta esforço para ajudar os usuários a detectar e corrigir segmentação comprometida, fornecendo recursos de controle de qualidade fáceis. Se o erro de segmentação acontece de má inicialização, usos pode usar "Manual Inicializar" ferramenta para substituir a inicialização automática. Quando a qualidade da imagem é muito pobre para o contorno ativo, os usuários podem facilmente "Hand Empate" o contorno que alimenta quantificação. Software existente, como CellProfiler pode ser adaptado para essa aplicação em uma boutique de semi-automatizadon. O fluxo de trabalho pode ser complicado quando grandes quantidades de imagens com diferentes condições de imagem são apresentados ou quando um subconjunto de imagens necessita de intervenção mais humana de medir corretamente. SpheroidSizer fornece uma suíte tudo-em-um para cálculo e controle de qualidade para gerenciar o fluxo de trabalho de alto rendimento de análise de imagem.

SpheroidSizer está actualmente limitada a detecção de um esferóide por imagem e apenas mede o comprimento axial do esferóide. O programa pode ser alargado para suportar mais necessária quantificação por investigadores, tais como a quantificação de esferóides com necrótica, detectar múltiplos esferóides de uma imagem ou de controlo a forma de esferóides. Além disso, o programa pode ser modificado para detectar e medir o tamanho de tumores excisados ​​a partir de animais ou humanos, o que, certamente, ser benéficos para os investigadores na realização in vivo pré-clínicos ou de investigação clínica. Pós-processamento dos esferóides detectados também pode ser investigado objetivoção a reduzir o esforço humano necessário para o controle de qualidade e continuar a melhorar o rendimento. SpheroidSizer é uma aplicação de análise de imagem generalizada para esferóides tumorais 3D que são produzidos a partir de quaisquer tipos de células, e, portanto, pode ser usado por uma comunidade de pesquisa do câncer de largura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software