À haut débit d'analyse de l'image de Sphéroïdes tumorales: Une application logicielle conviviale pour mesurer la taille de Sphéroïdes automatiquement et avec précision

Summary

Nous présentons une application à haut débit des logiciels d'analyse d'images pour mesurer la taille des sphéroïdes tumoraux tridimensionnelles imagées par microscopie à champ lumineux. Cette application fournit un moyen rapide et efficace pour examiner les effets des médicaments thérapeutiques sur sphéroïdes, ce qui est bénéfique pour les chercheurs qui souhaitent utiliser sphéroïdes dans les écrans de drogue.

Abstract

Le nombre croissant de demandes de sphéroïdes tumoraux (3D) en trois dimensions comme un modèle in vitro pour la découverte de médicaments nécessite leur adaptation aux formats de dépistage à grande échelle à chaque étape d'un dépistage de drogues, y compris l'analyse d'image à grande échelle. Actuellement, il n'ya pas de logiciel d'analyse d'image prête à l'emploi et libre de répondre ce format à grande échelle. La plupart des méthodes existantes impliquent dessin manuellement la longueur et la largeur des sphéroïdes 3D imagés, ce qui est un processus fastidieux et de longue haleine. Cette étude présente un logiciel d'analyse d'image à haut débit - SpheroidSizer, qui mesure le majeur et le mineur longueur axiale des sphéroïdes tumoraux 3D imagés automatiquement et avec précision; calcule le volume de chaque sphéroïde de tumeur 3D individu; puis renvoie les résultats sous deux formes différentes dans des feuilles de calcul pour les manipulations faciles dans l'analyse subséquente des données. Le principal avantage de ce logiciel est l'application d'analyse d'image qui est puissantadapté pour un grand nombre d'images. Il offre à haut débit calcul et contrôle de la qualité workflow. Le temps estimé pour traiter 1000 images est d'environ 15 min sur un ordinateur portable d'une configuration minimale, soit environ 1 min sur un poste de performance multi-core. L'interface utilisateur graphique (GUI) est également conçu pour le contrôle de qualité facile, et les utilisateurs peuvent modifier manuellement les résultats de l'ordinateur. La méthode clé utilisé dans ce logiciel est adapté à partir de l'algorithme de contour actif, aussi connu comme les serpents, ce qui est particulièrement adapté pour les images avec un éclairage inégal et le fond sonore qui frappe souvent le traitement de l'imagerie automatisée dans les écrans à haut débit. Le gratuit "Initialisation manuelle" et des outils "Dessiner à la main" offrent la souplesse nécessaire pour SpheroidSizer dans le traitement de différents types de sphéroïdes et des images de qualité diverses. Ce logiciel d'analyse d'image à haut débit réduit remarquablement travail et accélère le processus d'analyse. La mise en œuvre de ce logiciel est beneficial pour sphéroïdes tumoraux 3D à devenir une routine modèle in vitro pour les écrans de la drogue dans l'industrie et le milieu universitaire.

Introduction

En trois dimensions (3D) des sphéroïdes de tumeur sont des "agrégats à symétrie sphérique de cellules tumorales analogues à des tissus, sans substrat artificiel pour la fixation des cellules" ^1-3. La cytologie et de la morphologie de la tumeur sphéroïdes imite mieux l'vivo d'organisation du tissu tumoral et dans des micro-environnements (2D), que les cellules monocouches bidimensionnelles. Sphéroïdes tumoraux 3D sont devenus un modèle pratique in vitro pour criblages à haut débit des médicaments thérapeutiques anti-cancer ou l'examen de l'efficacité des médicaments candidats avant animaux in vivo ou des essais cliniques ^4. Sur le plan clinique, l'efficacité de tout traitement anti-cancer est évaluée sur la base de la croissance tumorale réduite. De manière analogue, le volume du sphéroïde peut être utilisée comme une mesure de l'efficacité pour des études in vitro de médicaments contre le cancer. Le volume sphéroïde (V = 0,5 * Longueur * Largeur ²⁾ est déterminée sur la base du majeur et mineur longueur axiale (plus communément connu comme la longueur et la largeur)des sphéroïdes ^{6, 7.} La plupart des chercheurs doivent établir manuellement la longueur et la largeur de chaque sphéroïde, souvent en utilisant le logiciel offert par les compagnies de microscopie et vendu avec les instruments d'imagerie. Cette technique devient problématique quand les écrans de drogue à haut débit sont effectuées et plus de centaines d'images sont produites. Des études récentes ont signalé l'utilisation d'ouvrir l'image source boîtes à outils logiciels d'analyse tels que CellProfiler ^8-10 et ¹¹ ImageJ pour développer rudimentaires routines de segmentation / macros qui participent correction de l'éclairage et simple seuillage. Ces routines ont souvent besoin d'être réajusté pour les différents lots d'images en fonction de la condition d'éclairage et de la variation du contraste de l'image; par conséquent, ces logiciels ne peuvent pas satisfaire à l'exigence de robustesse de l'analyse à haut débit de l'image. Friedrich et collaborateurs (2009) ont utilisé un logiciel propriétaire pour mesurer le volume semi-autom de l'ellipsoïdematiquement ^5. La méthode décrite dans Monazzam et le papier de ses collègues ¹⁰ était une méthode semi-automatisée pour mesurer la taille de sphéroïde seulement pour un petit nombre d'images. Par conséquent, il existe un besoin évident d'outils robustes, flexibles, automatisées et d'analyse d'image prête à l'emploi pour les sphéroïdes tumoraux 3D.

Dans cette étude, nous décrivons SpheroidSizer - un logiciel open-source basé sur MATLAB et de mesurer la taille des sphéroïdes tumoraux automatiquement et avec précision. SpheroidSizer est conçu pour traiter de nombreux lots différents d'images de sphéroïdes 3D dans la même session. Utilisant l'algorithme de contour actif ^12-14, SpheroidSizer peut tolérer l'image de changement de contraste, ignorer robuste changement progressif dans l'éclairage de fond et de reconnaître sphéroïdes dans l'image. Il peut également supporter de nombreux objets usuels, par exemple, les débris, l'origine de l'échantillon. Le flux de travail est conçu de sorte que les utilisateurs peuvent effectuer contro de qualitél pendant ou après le calcul. Écrasement manuel du résultat de l'analyse peut facilement être réalisé sur place. Profitant de la boîte à outils informatique parallèle, la vitesse d'analyse peut être encore renforcé par la coordination des multiples cœurs de calcul de travailler sur le calcul simultanément sur l'ordinateur d'un utilisateur. En outre, SpheroidSizer émet les résultats sous deux formes différentes pour faciliter l'interface avec des outils d'analyse en aval.

Protocol

1. 3D formation des sphéroïdes tumoraux, les traitements médicamenteux et collection d'images sont réalisées comme décrit dans notre précédent article ^15.

2. L'installation du logiciel

1. Installez le logiciel de MATLAB licence sur l'ordinateur utilisé pour l'analyse d'image. Les boîtes à outils suivantes de MATLAB sont également nécessaires pour être installé - Signal Processing boîte à outils, boîte à outils de traitement de l'image, et Parallel Computing Toolbox * (* nécessaire pour le mode de calcul parallèle uniquement).
   NOTE: De nombreuses universités achètent et entretiennent des licences de groupe pour que le logiciel est libre d'être téléchargé et utilisé par des scientifiques affiliés.
2. Installer programme SpheroidSizer de fichier SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. Enregistrez le fichier zip dans votre système de fichiers local.
   2. Décompressez le fichier SpheroidSizer.
   3. Enregistrer les fichiers dans un répertoire / dossier désigné, qui sera par la suite appelé til "Répertoire d'installation".
      REMARQUE: SpheroidSizer a été testé sur un système d'exploitation Windows 7. Il est prévu pour fonctionner sur des systèmes d'exploitation alternatifs avec un minimum d'ajustements (non testé).

3. Préparation pour l'analyse de l'image par SpheroidSizer

1. Déterminer l'échelle de résolution de l'image de / du système d'imagerie (échelle absolue de l'image en microns par pixel (pm / pix)).
   REMARQUE: Si la taille de chaque pixel sur la puce de la caméra est connue, l'échelle de l'image peut être calculé comme la taille grossissement de l'objectif x pixels (pm / pix). Cette valeur peut être obtenue à partir du logiciel d'imagerie équipé avec le microscope métadonnées intégrées ou avec l'aide de l'éditeur du système d'imagerie. Cette valeur sera nécessaire à l'étape 4.6.
2. Convertir tous les formats de fichiers d'image exclusifs pour les formats de fichiers acceptés - TIFF, JPEG et d'autres formats de fichiers d'image courants.
3. Nom des fichiers image et organiser directories (figure 5A).
   REMARQUE: Le logiciel repose sur la mise en page correcte de la structure de répertoire et les noms de fichiers à reformater les résultats en format de plaque:
   1. Nommez les fichiers d'image dans le format suivant: [nom de la plaque] _ [ligne] [colonne] [extension] ou [nom de la plaque] [espace] [ligne] [colonne] [extension]... [Suite] suit l'ordre alphabétique et [colonne] suit l'ordre numérique.
      NOTE: Gratuit logiciel de renommage automatique des lots peut être trouvé pour aider les utilisateurs à cette étape.
   2. Disposer le répertoire / dossier sur la base de l'expérience de la façon suivante: Chaque expérience doit avoir un répertoire. Sous le répertoire de chaque expérience, il devrait y avoir des sous-répertoires pour chaque point de temps. Sous chaque point sous-répertoire de temps, il devrait y avoir toutes les images de toutes les plaques.
      REMARQUE: Pour que les résultats d'analyse de façon optimale triés dans les résultats formatés, nous suggérons de garder le même nombre de chiffres pour chaque identifiant en remplissant des 0 sur la lauche, par exemple, des points de temps sont nommés comme 000H, 072h et 144H.

4. Analyse de l'image de la Sphéroïdes par SpheroidSizer

1. Ouvrir MATLAB, puis ouvrez le "Command Window", tapez cd '[Répertoire d'installation] "et appuyez sur [RETURN].
2. Tapez "SpheroidSizer1_0" dans le "Command Window" et appuyez sur [RETURN] pour lancer le programme SpheroidSizer.
3. Cliquez sur le bouton "Parcourir" dans la fenêtre de SpheroidSizer1.0 pour sélectionner le répertoire de l'expérience qui contient toutes les images.
4. Sélectionnez "Inclure les sous-dossiers" bascule sous le champ de texte "Dossier" à traiter plusieurs dossiers d'images imbriquées dans le répertoire désigné.
   NOTE: Si "Inclure les sous-dossiers" basculement n'est pas sélectionné, seules les images directement dans le répertoire sont traités, et tous les sous-dossiers sont ignorés.
5. Sélectionnez l'option "affichage à la volée" à dispmettre chaque image segmentée au-dessus de son image source pour le contrôle de la qualité que le calcul est en cours d'exécution.
   NOTE: La vitesse de calcul est plus rapide si l'option "on-the-fly affichage" n'est pas choisi.
6. Spécifiez «Résolution» (échelle de l'image / résolution um / pix) des images analysées dans la boîte, pour le programme pour convertir correctement les mesures du sphéroïde de pixel en um.
   NOTE: Toutes les images dans le même dossier ou analysés ensemble devraient être prises sous le même microscope avec le même objectif de sorte que l'échelle de l'image / résolution reste constant pour chaque expérience.
7. (Facultatif) les utilisateurs peuvent suivre l'étape 5 pour les paramètres définis par l'utilisateur avancé.
8. Cliquez sur "Calculer" pour démarrer le calcul.
   REMARQUE: Le logiciel effectue une vérification automatique de nom de fichier avant de procéder au calcul. Si une boîte de dialogue apparaît indiquant - "Erreur existe dans le nom de fichier", cliquez sur "Quitter et la liste des erreurs montrer"et corriger les erreurs dans les noms de fichiers répertoriés (voir étape 3.3). Ensuite, cliquez sur "Calculer" pour recommencer le calcul.
9. Cliquez sur le bouton "Pause" pour interrompre le calcul; et le calcul peut être reprise en cliquant sur le même bouton montrant «Continuer».
   REMARQUE: Le "Tableau des résultats" affiche le "Dossier", "Fichier", "Volume" (en mm ^3), "Longueur" (en pm), "largeur" ​​(en pm), et «valide» (case à cocher) pour tous les sphéroïdes analysés (Figure 5C). Le volume est calculé sur la base de l'axe majeur mesurée (longueur) et l'axe mineur (largeur) (V = 0,5 * Longueur * Largeur ^2). La case à cocher «valide» est une option pour l'utilisateur de choisir si l'analyse de l'image est valide ou invalide après contrôle de la qualité, voir l'étape 6.

5. Paramètres définis par l'utilisateur avancées

1. Cliquez sur le bouton "Avancé" dans la SpheroidSizer1.0 fenêtre pour faire apparaître la fenêtre des configurations avancées pour régler les paramètres définis par l'utilisateur (figure 5B).
2. Entrez les noms de fichiers d'intérêt dans le "Format de sortie" et "Liste des boîtes de sortie" dans la fenêtre des configurations avancées sous "Input".
3. Entrez un numéro de "2-10" dans la case "Réduire". Il s'agit d'un coefficient pour le logiciel afin de réduire la taille de l'image dans le calcul afin d'améliorer la vitesse de calcul. Plus le nombre est élevé, plus la vitesse de calcul. La valeur par défaut "Réduire" est réglé sur 10.
4. Entrez l'extension de fichier d'image à être transformés dans la case "Inclure le type".
5. Entrez les extensions de fichier d'image ou terminaisons qui ne vont pas à être traitées par le programme dans la zone "Exclure de type» comme suit: «_crude.jpg".
6. Choisissez "Aucun" pour "Couleur spéciale" pour traiter 8 bits et 16 bits colou des images correctement; choisissez "12 bits" pour "Couleur spéciale" pour traiter des images de couleurs de 12 bits correctement
7. Cochez la case "Utiliser Parallel Computing" si l'ordinateur utilisé pour l'analyse d'images est équipé de plusieurs processeurs et / ou multi-core. Si cela est vrai, alors passez à l'étape 5.7.1; sinon, sauter les étapes 5.7.1 et 5.7.2.
   NOTE: Une erreur se produit si l'ordinateur utilisé ne prend pas en charge la configuration choisie.
   1. Cochez l'option "Utiliser Parallel Computing" dans la fenêtre des configurations avancées.
      REMARQUE: utilisez uniquement le mode de calcul parallèle quand 4 ou plusieurs noyaux sont disponibles pour l'ordinateur.
   2. Entrez un numéro 4-12 dans les "travailleurs #" (calcul noyaux) boîte.
      NOTE: Ce nombre doit être inférieur au nombre de cœurs de calcul dans l'ordinateur de l'utilisateur ou égale à. Un maximum de 12 est prélevée par la MATLAB Parallel Computing Toolbox prend en charge un maximum de 12 cœurs. Lorsque le calcul parallèle est soitment exécuté, une petite boîte de dialogue s'affiche pour vous demander à l'utilisateur d'attendre pour le calcul parallèle à la fin; le calcul ne peut être mis en pause, et ni la fonction "On-the-fly affichage" en cours d'exécution en mode de calcul parallèle.

6. Quality Control

1. Cliquez sur la cellule correspondant à la "Table de résultats" pour confirmer le contour de délimitation précise d'un sphéroïde dans les images analysées,
   REMARQUE: Les images d'origine et le contrôle de la qualité sera affiché sur le côté droit pour examen. L'utilisateur peut examiner toutes les images séquentiellement en utilisant la flèche vers le bas sur le clavier.
2. Affiner la limite de la sphéroïde sur l'image sélectionnée à l'aide des deux outils suivants, si nécessaire:
   1. Cliquez sur le bouton "Initialisation manuelle" pour afficher l'image originale. Alors cliquez et maintenez la souris juste à l'extérieur de l'ellipsoïde et faites glisser l'outil Ellipse pour couvrir le sphéroïde sur l'image originale.
      NOTE: L'unalgorithme ctive contour initie à l'aide du contour soumis par l'utilisateur et exécute à converger sur le plan sphéroïde souhaitée. Le «Tableau des résultats» sera automatiquement mis à jour avec les nouveaux résultats. L'outil "Initialisation manuelle" permet à l'utilisateur de fournir manuellement l'initialisation de contour actif.
   2. Cliquez sur le bouton "main tirage" pour afficher l'image originale. Ensuite, utilisez la souris ou d'un écran tactile permis de dessiner précisément la limite de l'ellipsoïde.
      NOTE: Ce schéma est directement mesurée à générer axes majeur et mineur, qui sont actualisés dans le «Tableau des résultats". L'outil "main tirage" est utilisé uniquement lorsque la fonction "Initialisation manuelle" ne converge à la limite souhaitée de l'ellipsoïde.
3. Décochez la case dans la colonne "Oui" dans la ligne correspondante de la "table des résultats", quand une image ne contient pas de sphéroïde valide lors de l'inspection. Une "; Étiquette non valide »s'affiche dans le coin supérieur gauche de l'image de contrôle de qualité. Si "Oui" n'est pas cochée, les valeurs de toutes les mesures sont vides pour le sphéroïde dans les fichiers de résultats formatés et de sortie exportés.
   REMARQUE: les raccourcis clavier suivants sont disponibles à utiliser dans le "tableau de résultats": "flèche vers le bas" pour l'image suivante; "V" pour valide / invalide; "M" pour outil "Initialisation manuelle" et "h" pour l'outil "Dessiner à la main".

7. Sauvegarde et exportation de données

1. Cliquez sur le bouton "étude sur les exportations" dans la fenêtre de SpheroidSizer1.0 d'exporter l'état intermédiaire de l'analyse, si l'utilisateur a besoin pour quitter le logiciel avant de terminer le projet. Indiquez le nom et le répertoire du fichier à enregistrer.
2. Cliquez sur le bouton «Étude Importer" pour ramener le résultat de l'état intermédiaire au-dessus de "étude sur les exportations" et continuer à trak-dessus.
   REMARQUE: Les fichiers intermédiaires de l'Etat sont dans un format natif MATLAB (mat.) Et ne sont pas directement lisible par d'autres programmes de logiciels. Un dispositif de sécurité intégré dans le logiciel rend les exportations automatiques du projet ouvert dans le cas où le programme quitte involontairement. Si nécessaire, l'utilisateur peut trouver ce fichier, dont le nom commence par "~ tmp" qui contient l'horodatage correspondant dans le [répertoire d'installation].
3. Cliquez sur "Résultats de la définition" dans la fenêtre de SpheroidSizer1.0 pour enregistrer les résultats.
   NOTE: Deux formes de résultats sont enregistrés dans le répertoire de l'expérience. Les noms de fichiers exportés peuvent être configurés dans la fenêtre des configurations avancées (voir Protocole étape 5.2). Le fichier de format de sortie est une table de tab-délimité qui organise la valeur du volume dans le format de plaque d'origine de l'ordre d'un numéro de plaque d'ascendant pour chaque point de temps; et tous les points de temps sont organisées dans un ordre ascendant (figure 5D). La liste ofichier utput est une table de tab-délimité qui contient l'ensemble des mesures, sous la forme de listes ordonnées (figure 5E).

Representative Results

SpheroidSizer est conçu pour produire de détection automatique, la délimitation et la mesure des sphéroïdes 3D, avec le travail remarquablement réduites et une efficacité accrue aiguë de grandes quantités d'images. Figure 1A montre le flux de travail de SpheroidSizer. Les étapes de calcul de base comprennent l'initialisation automatique, algorithme de contour actif et le contour quantification. Après calcul automatisé, la fonction de contrôle de qualité utilise une combinaison de "Initialisation manuelle" et des outils "Dessiner à la main" pour sauver une segmentation imparfaite. Figure 1B illustre l'algorithme de contour détaillé automatisé active. L'étape d'initialisation (itération 0) utilise des étapes de base de traitement d'image pour générer la taille et l'emplacement approximatif de la sphéroïde et de générer un contour d'initiation sphérique avec une taille estimée. Le contour de l'ouverture alimente l'algorithme de contour actif. À son tour, il parcourt à ajuster en fonction de l'image localegradient et la forme de courbure. L'algorithme de contour actif se termine lorsque le contour se stabilise (converge), c'est à dire 477 itérations pour cette image, ou lorsque le nombre maximal prédéfini d'itérations a été exécuté. Dans cet exemple, le contour d'initialisation est volontairement élargi pour mieux mettre en valeur l'algorithme. En réalité, l'initialisation est généralement très proche de la frontière réelle et beaucoup moins d'itérations sont nécessaires pour l'algorithme de converger. Par la suite, l'algorithme prend des mesures morphométriques de la frontière sphéroïde détecté. Les axes majeurs et mineurs de l'ellipsoïde sont mesurés en utilisant MATLAB boîte à outils de traitement d'image (figure 1C). L'axe majeur est défini comme étant le segment de droite reliant une seule paire de points les plus éloignés du contour, qui est appelé la longueur (L). Le petit axe est défini comme étant la ligne la plus longue perpendiculaire à l'axe majeur, qui est appelée la largeur (W). Dans ce cas, les valeurs de L et W sont très proches puisque lesphéroïde est sphérique. Le volume de l'ellipsoïde est calculée comme étant V = 0,5 * L * W ^2.

L'une des caractéristiques est sa SpheroidSizer de détection automatique de la limite des sphéroïdes même sur des images avec un fond irrégulier ou bruyant en utilisant l'algorithme de contour actif (Figures 2B-D). Traitement informatique des images de champ lumineux est souvent minée par un fond inégal, qui égare les méthodes à base de seuillage adaptatifs pour produire des résultats de seuillage indésirables. La question est particulièrement évident lorsque les plaques multi-puits sont utilisés et parois des puits peuvent créer des effets d'ombre sur les images. Cependant, parce que l'algorithme de contour actif n'est pas sensible à l'évolution progressive de l'ombrage en arrière-plan, il est en mesure d'identifier sphéroïde segmentation dans ces images lumineuses sur le terrain avec une bonne initialisation. Figure 2 montre quelques exemples d'images avec un fond inégal ou bruyant, comme inégale illumination (Figure 2B (figure 2C) ou noyau nécrotique (figure 2D). Avec l'algorithme de contour actif automatisé, ces sphéroïdes SpheroidSizer délimite avec précision dans tous ces images comme le montre le contour rouge sur le panneau inférieur de chaque figure.

La fonction de contrôle de qualité de SpheroidSizer est la clé pour un flux de travail à haut débit. Le "Initialisation manuelle" et des outils "Dessiner à la main» sont les outils complémentaires utiles pour cette application. Parmi des centaines ou des milliers d'images, il est inévitable que l'algorithme automatisé n'est pas capable de détecter correctement les sphéroïdes en quelques images. Comme le montre la figure 3A, lorsque la détection incorrecte du sphéroïde est due à l'étape d'initialisation, soit la taille ou l'emplacement du contour de l'initiation à l'image (en haut) inadéquat, la fonction "Initialisation manuelle" fonctionne en permettant à l'utilisateur de bien définir l'emplacement et la taille de la spheroid manuellement (panneau inférieur). Il déclenche l'algorithme de contour actif pour lancer avec contour défini manuellement et exécuter à converger sur le contour souhaité. Pour ces images difficiles comme l'image originale de la figure 3B, le sphéroïde est situé dans un arrière plan gênant et bruyant. SpheroidSizer n'est pas en mesure d'identifier correctement l'ellipsoïde par la méthode automatisée (en haut) ou par la fonction "Initialisation manuelle" avec une initialisation correcte (panneau du milieu). Dans ce cas, l'outil "Hand Draw" peut être utilisé pour dessiner manuellement le contour de l'ellipsoïde, comme illustré dans le panneau inférieur. Le programme utilise la limite définie par l'utilisateur pour mesurer les axes majeur et mineur de l'ellipsoïde et le calcul du volume. Tous les résultats corrigés sont immédiatement incorporés dans le "Tableau des résultats" et peuvent être exportés en conséquence.

Pour déterminer la performance de SpheroidSizer dans de plus grands ensembles de données, on compare d'abord la durée de fonctionnement parl'analyse de la même série de 288 images en utilisant 1) des mesures manuelles avec un microscope fournisseur de logiciel fourni; 2) SpheroidSizer avec un single-core ordinateur portable ordinaire; et 3) SpheroidSizer avec un poste de travail à plusieurs noyaux de la performance de traitement parallèle. Les mesures manuelles suivent notre protocole typique avant de développer le logiciel: la longueur et la largeur de chaque sphéroïde sont dessinés à la main et mesurées en utilisant le programme de fournisseur (comme on le voit les lignes rouges dans le panneau supérieur de la figure 4A); puis l'utilisateur copie vers le bas les valeurs de mesure. SpheroidSizer traite chaque image en générant la limite de sphéroïde (comme le montre le contour rouge dans le panneau inférieur de la figure 4A), la mesure de la longueur axiale majeur et mineur, et exporter les résultats dans les feuilles de calcul. Comme on le voit dans le tableau 1, sur la base du calcul de 288 images, il faut une moyenne de 31.67 secondes pour mesurer un sphéroïde par image manuellement; alors il ne faut SpheroidSizer moins de 2 s & # 160; lors de l'exécution sur un single-core ordinateur portable ordinaire; et moins de 1 seconde lors de l'exécution sur un poste de travail sur le rendement de 12 noyau. Par conséquent, l'analyse de l'image est sur 18x plus rapide par image à l'aide SpheroidSizer de mesures manuelles. Il réduit considérablement le travail lorsque plus de milliers d'images sont analysées. Ensuite, nous comparons la variabilité des mesures des 24 sphéroïdes illustrés à la figure 4A entre les mesures manuelles et SpheroidSizer. Les 24 sphéroïdes sont évalués à trois reprises par les deux méthodes; et l'écart type de chaque sphéroïde individuel est calculée. Comme on le voit sur ​​la figure 4B, l'écart-type de SpheroidSizer (ligne verte et des points) est proche de zéro, sauf pour les trois sphéroïdes qui sont corrigés à l'étape de contrôle de qualité, qui montrent encore plus petit écart-type que ceux de la méthode d'évaluation d'emploi. Tous ceux-ci indiquent que SpheroidSizer effectue l'analyse d'image de manière plus efficace et précise.

e_content "> Nous avons effectué un dépistage de drogues en utilisant sphéroïdes BON-1 tumorales 3D humains pour savoir qui des composés en combinaison avec un inhibiteur de Hsp90 sont les candidats potentiels pour tester les effets anti-tumoraux in vivo. sphéroïdes tumoraux BON-1 3D humaines ont été cultivées sur des plaques de 96 puits d'agarose revêtues telles que décrites dans le document précédent ^15. huit composés différents avec six dilutions en série ainsi que les médias et les véhicules ont été criblés pour leurs effets uniques et combinatoires avec 10 nM et 20 inhibiteur nM de hsp90 dans les doubles respectivement. Deux sphéroïdes étaient utilisé pour chaque concentration du composé individuel ou les composés associés. Quatre plaques de 96 puits dont le total des 384 sphéroïdes ont été utilisés. Toutes les sphéroïdes ont été imagées à 0, 72, 144, 168, et 192 heures. Un total de 1920 images ont été produites à partir de cette expérience. SpheroidSizer Il a fallu seulement 30 min pour terminer l'analyse informatique des images 1920 avec un 50 minutes supplémentaires pour le contrôle de la qualité et de l'exportation de données. SphéroidSizer accélère le processus d'analyse d'image énormément. figure 5A montre une capture d'écran des arrangements de dossier et les noms de fichiers pour cette expérience comme un exemple pour le protocole étape 3.3. Figures 5B-E montre les captures d'écran de l'analyse d'image des fenêtres pop-up et les résultats . utilisant SpheroidSizer comme illustrations pour le protocole étapes 4, 5 et 7 Prendre les volumes des sphéroïdes 3D à partir de la table de résultats formaté exportés de SpheroidSizer, nous avons fait des graphiques - croissance de sphéroïdes tumoraux 3D sur des traitements composés en fonction du temps de traitement. Deux graphes représentatifs de cette expérience sont présentés dans la figure 5F et 5G. La figure 5F montre que les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et de la cladribine (ligne verte) inhibent la croissance de 3D sphéroïdes plus que le seul traitement de l'inhibiteur de la hsp90 (ligne violette) ou la cladribine (ligne orange), ce qui suggère que les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et cladribine peut avoir des ef anti-tumoralfets in vivo. Figure 5G montre que les traitements combinés de l'inhibiteur de Hsp90 et adriamycine (ligne verte) n'inhibe pas la croissance de la 3D sphéroïdes plus que le seul traitement de l'adriamycine (ligne orange) ou un inhibiteur de Hsp90 (ligne violette), ce qui suggère que la les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et de l'adriamycine peuvent ne pas avoir des effets anti-tumoraux in vivo. Cette expérience nous a permis de mieux sélectionner les composés à tester leurs effets anti-tumoraux in vivo et SpheroidSizer est la clé de l'analyse des données expérimentales rapide.

Tableau 1. Comparaison de la durée de fonctionnement sur ​​l'analyse de l'image entre des mesures manuelles et SpheroidSizer lorsque l'on analyse le même jeu d'images 288. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette table.

Figure 1 SpheroidSizer -... Un logiciel open-source pour mesurer la taille de l'ellipsoïde A) Le noyau flux de travail de l'application B) Illustration de l'algorithme de contour actif à différents stades de l'itération. S'il vous plaît noter que le contour d'initialisation (itération 0) a été délibérément agrandi afin de présenter l'algorithme. C) Les majeurs et mineurs des mesures de longueur axiale et le calcul du volume par SpheroidSizer. L - axe majeur: le segment de droite reliant une seule paire de points les plus éloignés du contour (appelée longueur); W - petit axe: la ligne la plus longue perpendiculaire à l'axe principal (ci-largeur).

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Figure 2. Des résultats représentatifs de la segmentation automatique des SpheroidSizer, montrant la robustesse contre les diverses conditions de l'image. A) des images de bonne qualité typique. B) Images avec la luminosité et le contraste différent. C) Images avec des débris de distraction. D) Images de sphéroïdes avec noyau nécrotique . Images à la face supérieure de chaque figure sont les sources / images originales; des images sur le panneau inférieur de chaque figure sont les images de contrôle de qualité; et le contour rouge est la segmentation du sphéroïde dessinée par calcul automatisé.

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Figure 3. Illustration de la "Initialisation manuelle" et "main dessiner" des outils. A) L'outil «Manuel d'initialisation" permet le dessin d'une forme d'ellipse de montage à travers le sphéroïde pour l'initialisation, quand inexactes sphéroïde segmentation se produit après l'initialisation automatique. B ) L'outil "main tirage" permet dessin à la main précise de la frontière sphéroïde, quand segmentations sphéroïde inexactes se produisent avec l'initialisation à la fois automatique et manuel. La ligne bleue autour du sphéroïde montre le contour d'initialisation; le contour rouge est la limite sphéroïde identifié. S'il vous plaît noter que le sphéroïde dans "Initialisation manuelle" en A) et le sphéroïde dans "Hand Draw" en B) est volontairement élargi pour mieux mettre en valeur les outils.

Figure 4. Comparaison de l'image des performances d'analyse entre SpheroidSizer et mesures manuelles lors de l'analyse de la même série de 24 images. A) sphéroïdes représentatifs pour montrer comment la longueur et la largeur de sphéroïdes sont déterminées par des mesures manuelles et SpheroidSizer. Top 24 images contiennent dessinées à la main longueur / largeur de chaque sphéroïde lignes rouges à l'aide de mesures manuelles; inférieurs de 24 images (les mêmes 24 images) contiennent sphéroïde frontière tracée par ordinateur en utilisant le contour rouge SpheroidSizer. B) Ecart type de longueur ou de la largeur de trois mesures sur chaque sphéroïde individu.

Figure 5. Un exemple représentatif de l'utilisation de sphéroïdeSizer dans l'écran de la drogue - l'analyse d'image sur les images des sphéroïdes qui ont été recueillies à partir d'un écran de drogue en utilisant sphéroïdes tumoraux BON-1 3D A) Une capture d'écran du régime de dossiers et de fichiers de ce projet B) Une capture d'écran de la pointe.. fenêtre configurations dans SpheroidSizer. C) Une capture d'écran de la fenêtre SpheroidSizer1.0 avec les résultats affichés tableau. D) Une capture d'écran du fichier de sortie de format d'exportation de SpheroidSizer. E) Une capture d'écran du fichier de sortie de liste exportée de SpheroidSizer. F) La croissance des sphéroïdes tumoraux 3D sur les traitements avec un inhibiteur de Hsp90 et la cladribine. G) Croissance des sphéroïdes tumoraux 3D sur les traitements avec un inhibiteur de Hsp90 et adriamycine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ P>

Discussion

Cette étude présente un moyen rapide, flexible, efficace et automatisé programme - SpheroidSizer pour la détermination précise de la taille des sphéroïdes tumoraux 3D. SpheroidSizer est facile à utiliser et nécessite un apport minime de l'utilisateur. Les étapes les plus critiques pour la course précise, sans heurt et réussie de SpheroidSizer comprennent: que les sphéroïdes sont imagés dans le centre du champ sans toucher le bord du puits; tous les fichiers à analyser comme un seul projet doivent être visualisés sous le même microscope avec le même objectif; tous les fichiers à analyser sont correctement désignés et agencés comme indiqué dans le protocole; et les paramètres définis par l'utilisateur correctes sont entrées avant calcul.

Les avantages de SpheroidSizer comprennent sa capacité à tolérer de fond de changement progressif dans l'image, ainsi que pour générer des contours lisses qui correspondent aux formes sphériques générales des sphéroïdes en utilisant l'algorithme de contour actif. Performance des actifscontour peut être compromise dans deux situations: une mauvaise initialisation, ou la présence d'autres bords locales distraire du contour désiré. Spécifiquement dans nos cas testés, la deuxième situation se produit parfois lorsque le noyau nécrotique d'un grand sphéroïde attire le contour actif résultant en plus petit contour ont été signalés. Il est à noter que d'autres procédés à base de seuil automatisés souffrent également dans cette situation, à moins que le seuil est fixé plus précisément à la main. Le logiciel met donc en avant l'effort pour aider les utilisateurs de détecter et de remédier à la segmentation compromis en fournissant faciles fonctionnalités de contrôle de qualité. Si l'erreur de segmentation se produit d'une mauvaise initialisation, les utilisations peuvent utiliser "Manuel d'initialisation" outil pour remplacer l'initialisation automatique. Lorsque la qualité de l'image est trop pauvre pour contour actif, les utilisateurs peuvent facilement "main dessiner" le contour qui alimente la quantification. Les logiciels existants tels que CellProfiler peut être adapté pour cette application dans un fashio semi-automatisén. Le flux de travail peut être fastidieux lorsque de grandes quantités d'images à différentes conditions d'imagerie sont présentés ou quand un sous-ensemble d'images a besoin de plus d'intervention humaine pour mesurer correctement. SpheroidSizer fournit une suite tout-en-un pour le calcul et le contrôle de la qualité pour gérer analyse à haut débit de l'image workflow.

SpheroidSizer est actuellement limitée à la détection d'une sphéroïde par image et ne mesure que la longueur axiale de la sphéroïde. Le programme peut être étendu afin de soutenir davantage la quantification nécessaire par des chercheurs tels que la quantification sur sphéroïdes avec noyau nécrotique, détection de multiples sphéroïdes dans une image ou le suivi de la forme de sphéroïdes. En outre, le programme peut être modifié pour détecter et mesurer la taille des tumeurs excisées de l'animal ou humain, qui va certainement être bénéfique pour les chercheurs lors de la conduite in vivo pré-clinique ou clinique. Post-traitement des sphéroïdes détectés peut également être étudiée butment à réduire l'effort humain nécessaire pour le contrôle de qualité et d'améliorer encore le rendement. SpheroidSizer est une application d'analyse d'image généralisée pour sphéroïdes tumoraux 3D qui sont produites à partir de tous les types de cellules, et peuvent donc être utilisés par une communauté de recherche sur le cancer de large.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software