Høy gjennomstrømming Bildeanalyse av Tumor Spheroids: Et brukervennlig program for å måle størrelsen på Spheroids automatisk og nøyaktig

Summary

Vi presenterer en høy gjennomstrømming bildeanalyse program for å måle størrelsen på tredimensjonale tumor sfæroider bilde av med lys-felt mikroskopi. Dette programmet gir en rask og effektiv måte å undersøke effektene av terapeutiske legemidler på sfæroider, som er gunstig for forskere som ønsker å bruke sfæroider i narkotika-skjermer.

Abstract

Det økende antall søknader av tredimensjonale (3D) tumor sfæroider som en in vitro modell for drug discovery krever sin tilpasning til storskala screening formater i alle trinn av et medikament skjermen, inkludert stor-skala bildeanalyse. Foreløpig er det ingen klar-til-bruk og gratis bildeanalyse programvare for å møte denne store format. De fleste eksisterende metoder involverer manuelt trekke den lengde og bredde av de avbildes 3D sfæroider, hvilket er en omstendelig og tidkrevende prosess. Denne undersøkelsen gir en høy gjennomstrømning bildeanalyse program - SpheroidSizer, som måler de store og små aksiale lengde av de avbildes 3D tumor sfæroider automatisk og nøyaktig; beregner volumet av hver enkelt 3D tumor sfæroide; Deretter leveres resultatene i to forskjellige former i regneark for enkle manipulasjoner i den etterfølgende dataanalyse. Den største fordelen med denne programvaren er den kraftige bildeanalyse program som ertilpasset for et stort antall bilder. Det gir høy gjennomstrømming beregning og arbeidsflyt kvalitetskontroll. Estimert tid til å behandle 1000 bilder er ca 15 min på et minimalt konfigurert laptop, eller rundt 1 min på en flerkjerneytelse arbeidsstasjon. Det grafiske brukergrensesnittet (GUI) er også designet for enkel kvalitetskontroll, og brukerne kan manuelt overstyre datamaskinen resultater. Nøkkelen metode som brukes i denne programvaren er tilpasset fra den aktive kontur algoritme, også kjent som slanger, som er spesielt egnet for bilder med ujevn belysning og bakgrunnsstøy som ofte plager automatisert bilde behandling i high-throughput-skjermer. Den gratis "Manual Initialize" og "Hånd Draw" verktøy gir fleksibilitet til å SpheroidSizer i å håndtere ulike typer sfæroider og bilder diverse kvalitet. Denne high-throughput bildeanalyse programvare bemerkelsesverdig reduserer arbeidskraft og hastigheter opp analyseprosessen. Implementering av denne programvaren er beneficial for 3D-tumor sfæroider å bli en rutine in vitro modell for narkotika-skjermer i industrien og akademia.

Introduction

Tredimensjonale (3D) tumor sfæroider er "sfærisk symmetriske aggregater av kreftceller analoge til vev, uten kunstig underlag for cellebinding" ^1-3. Den cytologi og morfologi av svulsten sfæroider bedre etterligner in vivo svulstvev organisasjon og microenvironments enn monolayer to-dimensjonale (2D) celler. 3D tumor sfæroider har blitt en praktisk in vitro modell for high-throughput screenings av anti-kreft terapeutiske medikamenter eller undersøke effektiviteten av kandidat stoffer før in vivo dyre-eller klinisk testing ^4.. Klinisk er effekten av en hvilken som helst anti-cancer behandling evaluert basert på redusert tumorvekst. Analogt kan sfæroide volumet bli brukt som et mål på effektiviteten for in vitro kreftlegemiddel studier. Spheroid volum (V = 0,5 * Lengde * Bredde ²⁾ fastsettes basert på den større og mindre aksial lengde (mer kjent som lengde og bredde)av sfæroider ^{6, 7.} De fleste forskere har til å trekke lengden og bredden på hver spheroid manuelt, ofte ved hjelp av programvare som tilbys av mikros selskaper og solgt sammen med imaging instrumenter. Denne teknikken blir problematisk når high-throughput narkotika-skjermer er utført og mer enn hundrevis av bilder blir produsert. Noen nyere studier rapporterte bruk av åpen kildekode programvare for bildeanalyse verktøykasser som CellProfiler ^8-10 og ImageJ ¹¹ å utvikle rudimentære segmenterings rutiner / makroer som er involvert belysning korreksjon og enkel terskelverdier. Disse rutinene trenger ofte å bli re-justeres for ulike grupper av bilder i forhold til belysningen tilstand og kontrasten i bildet endring; Derfor kan disse programvarepakkene ikke møte robust kravet til høy gjennomstrømming bildeanalyse. Friedrich og medarbeidere (2009) brukte proprietær programvare for å måle spheroid volum semi-autommatisk ^fem. Fremgangsmåten som er beskrevet i Monazzam og hans kolleger 'papir ¹⁰ var en semi-automatisert metode for å måle sfæroide størrelse bare for et lite antall bilder. Derfor eksisterer det et klart behov for robuste, fleksible, automatiserte og klar til bruk bildeanalyse verktøy for 3D-tumor sfæroider.

I denne studien, beskriver vi SpheroidSizer - en MATLAB-basert og open-source program for å måle størrelsen på tumor sfæroider automatisk og nøyaktig. SpheroidSizer er utviklet for å behandle mange forskjellige grupper av bilder av 3D sfæroider i samme økt. Utnytte den aktive konturen algoritmen ^12-14, kan SpheroidSizer tolerere bildekontrast endring, robust ignorere gradvis endring i bakgrunnsbelysningen og gjenkjenne sfæroider i bildet. Det kan også tåle mange vanlige gjenstander, for eksempel, rusk, stammer fra prøven. Arbeidsflyten er utformet slik at brukerne kan utføre kvalitet control løpet av eller etter beregningen. Manuell overskrivning av analyseresultatet kan lett bli utført på stedet. Å dra nytte av parallell databehandling verktøykasse, kan analysen hastigheten bli ytterligere styrket ved å samordne flere databehandling kjerner å jobbe på beregningen samtidig på en brukers datamaskin. Videre SpheroidSizer utganger resultatene i to forskjellige former for å gi enkel tilkopling med nedstrøms analyseverktøy.

Protocol

En. 3D tumor sfæroider formasjon, medikamentell behandling og bildesamling blir utført som beskrevet i vår tidligere artikkel ^15.

2. Installasjon av programvare

1. Installer lisensiert MATLAB programvare på datamaskinen som brukes for bildeanalyse. Følgende verktøykasser fra MATLAB er også nødvendig for å bli installert - Signal Processing verktøykasse, bildebehandling verktøykasse, og Parallel Computing verktøykasse * (* behov for parallell databehandling modus).
   MERK: Mange universiteter kjøpe og vedlikeholde konsernets lisenser, slik at programvaren er fritt lastes ned og brukes av tilknyttede forskere.
2. Installer SpheroidSizer program fra SpheroidSizer.zip fil (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
   1. Lagre zip-filen i det lokale filsystemet.
   2. Pakk den SpheroidSizer filen.
   3. Lagre filene i en angitt katalog / mappe, som vil senere bli referert til som than "Installasjon Directory".
      MERK: SpheroidSizer har blitt grundig testet på en Windows 7-operativsystemet. Det er forventet å arbeide med alternative operativsystemer med minimale justeringer (ikke testet).

Tre. Forberedelse til bildeanalyse av SpheroidSizer

1. Bestem bildeskalaen / oppløsningen på bildesystem (absolutt skala på bildet i mikron per piksel (mikrometer / pix)).
   MERK: Hvis størrelsen på hver piksel på kameraet chip er kjent, kan bildeskalaen beregnes som objektivforstørrelsen x pikselstørrelse (mikrometer / pix). Denne verdien kan fås fra bildebehandlingsprogrammer utstyrt med mikroskop som embedded metadata eller med hjelp fra bildebehandlingssystemleverandøren. Denne verdien vil være nødvendig i trinn 4.6.
2. Konverter noen proprietære filformater til de aksepterte filformater - TIFF, JPEG, og andre vanlige bildeformater.
3. Navn bildefiler og ordne directories (Figur 5A).
   MERK: Programvaren er avhengig av riktig oppsett av katalogstruktur og filnavn å formatere resultatene inn plate format:
   1. Nevn de bildefiler i følgende format: [plate navn] _ [rad] [kolonne] [forlengelse] eller [plate navn] [mellomrom] [rad] [kolonne] [forlengelse]... [Rad] følger alfabetisk rekkefølge og [kolonne] følger nummerrekkefølge.
      MERK: Fritt tilgjengelig automatisk batch døpe programvare kan bli funnet for å hjelpe brukere i dette trinnet.
   2. Ordne katalogen / mappen basert på forsøket på følgende måte: Hver eksperiment bør ha en katalog. Under hvert eksperiment katalog, bør det være underkataloger for hvert tidspunkt. Under hvert tidspunkt underkatalog, bør det være alle bildene fra alle platene.
      MERK: For at analyseresultatene for å bli optimalt sortert i de formaterte resultater, foreslår vi å holde samme antall siffer for hver identifikator ved å fylle 0 er på left, f.eks, er tidspunkter navngitt som 000h, 072H, og 144H.

4.. Bildeanalyse av Spheroids ved SpheroidSizer

1. Åpen MATLAB, åpne deretter "Command Window", skriv cd '[Installasjon Directory]' og trykk [RETURN].
2. Skriv "SpheroidSizer1_0" i "Command Window", og trykk [RETURN] for å starte SpheroidSizer programmet.
3. Klikk på "Browse"-knappen i SpheroidSizer1.0 vinduet for å velge forsøket katalog som inneholder alle bildene.
4. Velg "Inkluder undermapper" toggle under "Folder" tekstfeltet for å behandle flere nestede bildemapper under utpekt katalogen.
   MERK: Hvis «Inkluder undermapper" vippe er ikke valgt, bare bildene direkte under katalogen er behandlet, og alle undermapper blir ignorert.
5. Velg "On-the-fly display" alternativet til displå hver segmenterte bilde på toppen av sin kildebildet for kvalitetskontroll som beregningen blir gjennomført.
   MERK: Beregningshastigheten er raskere hvis "On-the-fly display" alternativet er ikke valgt.
6. Spesifiser "Resolution" (image skala / oppløsning i mikrometer / pix) av de analyserte bildene i boksen, for programmet å korrekt konvertere sfæroide målinger fra pixel til mikrometer.
   MERK: Alle bildene i samme mappe eller analyseres sammen bør tas under samme mikroskop med samme mål, slik at bildeskalaen / oppløsning forblir konstant for hvert forsøk.
7. (Valgfritt) brukere kan følge trinn 5 for avanserte brukerdefinerte innstillinger.
8. Klikk på "Compute" for å starte beregning.
   MERK: Programvaren utfører en automatisk filnavn sjekk før du går videre til beregning. Hvis en dialogboks dukker opp som indikerer - "Feil eksisterer i filnavn", klikk på "Avslutt og viser liste over feil"og fikse feilene i børsnoterte filnavn (Se trinn 3.3). Deretter klikker du på "Compute" for å starte beregningen på nytt.
9. Klikk på "Pause"-knappen for å stoppe beregningen; og beregning kan gjenopptas ved å klikke på samme knapp som viser "Fortsett".
   NB: "Resultater" viser "mappe", "File", "Volume" (i mm ^3), "lengde" (i mikrometer), "bredde" (i mm), og "Gyldig" (kryss) for alle de analyserte sfæroider (figur 5C). Volumet beregnes basert på den målte hovedakse (lengde) og mindre aksen (bredde) (V = 0,5 * Lengde * Bredde ^2). Den "Gyldig" boksen er et alternativ for brukeren å velge om analysen av bildet er gyldig eller ugyldig etter kvalitetskontroll, se trinn 6.

5. Avanserte brukerdefinerte innstillinger

1. Klikk på "Avansert"-knappen i SphereoidSizer1.0 vinduet for å få opp avanserte konfigurasjoner vinduet for å tilpasse brukerdefinerte innstillinger (Figur 5B).
2. Skriv inn filnavnene av interesse i "Format Output" og "List Output" boksene i Avansert-konfigurasjoner under "Input".
3. Skriv inn et nummer fra "2-10" i "Reduce" boksen. Dette er en koeffisient for programvaren å redusere bildestørrelsen i beregningen for å øke beregningshastigheten. Jo høyere tallet er, jo raskere beregning hastighet. Standard "Reduce" er satt til 10 år.
4. Oppgi å-være-behandlet bildefil forlengelse i "Inkluder type" boksen.
5. Skriv inn bilde filtyper eller avslutninger som ikke kommer til å bli behandlet av programmet i "Ekskluder type" boksen som følger: "_crude.jpg".
6. Velg "Ingen" for "Special Color" å behandle 8 bit og 16 bit coleller bilder skikkelig; velge "12 bit" for "Special Color" for å behandle 12-bits fargebilder ordentlig
7. Sjekk "Bruk Parallel Computing" hvis datamaskinen brukes for bildeanalyse er utstyrt med flere prosessorer og / eller multi-core prosessorer. Hvis dette er sant, så gå til trinn 5.7.1; hvis ikke, så hoppe over trinn 5.7.1 og 5.7.2.
   MERK: Det vil oppstå en feil hvis datamaskinen som brukes ikke støtter den valgte konfigurasjon.
   1. Sjekk "Bruk Parallel Computing" i Avansert-konfigurasjoner.
      MERK: Bruk bare parallell databehandling modus når 4 eller flere kjerner er tilgjengelig for datamaskinen.
   2. Skriv inn et nummer 4-12 i "# Workers" (computing kjerner) boksen.
      MERK: Dette nummeret må være lik eller mindre enn antall data kjerner i brukerens datamaskin. Maksimalt 12 pålegges av MATLAB parallell databehandling verktøykasse støtter maksimalt 12 kjerner. Når parallell databehandling væreing henrettet, en liten dialog boks skjermer ber brukeren om å vente på den parallelle beregninger til slutt; beregningen kan ikke bli stanset, og heller ikke er "On-the-fly display"-funksjonen blir utført i parallell databehandling modus.

6. Quality Control

1. Klikk på den tilsvarende celle i "Resultater" for å bekrefte nøyaktig grense konturen av en sfæroide i de analyserte bilde
   MERK: De originale og kvalitetskontroll bilder vil dukke opp på høyre side for gjennomgang. Brukeren kan se gjennom alle bildene i rekkefølge ved å bruke pil ned på tastaturet.
2. Avgrense grensen av spheroid på det valgte bildet ved hjelp av følgende to verktøy, hvis det er nødvendig:
   1. Klikk på "Manual Initialize" knappen for å vise originalbildet. Deretter klikk-og-hold musa rett utenfor spheroid og dra ellipse verktøyet for å dekke spheroid på originalbildet.
      MERK: enctive-contour algoritmen starter å bruke den bruker sendt kontur og utfører til sammen på ønsket spheroid disposisjon. Den "Resultater" vil bli automatisk oppdatert med de nye resultatene. "Manuell Initialize" verktøyet lar brukeren å gi initialisering manuelt for aktiv-kontur.
   2. Klikk på "Hand Draw"-knappen for å vise originalbildet. Deretter kan du bruke musen eller en touch-aktivert skjerm til nettopp trekke grensen av spheroid.
      MERK: Denne disposisjonen er direkte målt for å generere større og mindre akser, som oppdateres i "Resultater". Den "Hand Draw" verktøyet brukes bare når "Manuell Initialize" verktøyet ikke å konvergere på ønsket grensen av spheroid.
3. Ikke kryss i "Gyldig"-kolonnen i den tilsvarende raden i "Resultater", når et bilde ikke inneholder noen gyldig spheroid ved inspeksjon. En "; Ugyldig "etiketten vises øverst i venstre hjørne av kvalitetskontroll image. Hvis "Gyldig" er avmerket, verdiene av alle målingene er tomme for spheroid i de eksportformaterte og utgang resultater filer.
   MERK: Følgende hurtigtaster er tilgjengelige for bruk i "Result Table": "pil ned" for neste bilde; "V" for gyldig / ugyldig; "M" for "Manuell Initialize" verktøyet og "h" for "Hand Draw"-verktøyet.

7. Lagre og eksportere data

1. Klikk på "Export Study"-knappen i SpheroidSizer1.0 vinduet for å eksportere den mellomliggende tilstand av analysen, hvis brukeren trenger å avslutte programmet før du fullfører prosjektet. Angi navnet på og katalogen til filen skal lagres.
2. Klikk på "Importer Study"-knappen for å bringe tilbake den ovenfor mellomliggende tilstand resultat fra "Export Study" og fortsette å work på det.
   MERK: De mellomliggende statlige filene er i en innfødt MATLAB format (matte.) Og er ikke direkte kan leses av andre programmer. En sikkerhetsfunksjon innebygd i programvaren gjør automatiske eksport av det åpne prosjektet i tilfelle programmet avsluttes utilsiktet. Ved behov, kan brukeren finne denne filen, med navn som starter med "~ tmp" som inneholder tilsvarende tidsstempel i [Installasjon Directory].
3. Klikk på "Formater Resultater" i SpheroidSizer1.0 vinduet for å lagre resultatene.
   MERK: To former for resultatene lagres i forsøket katalog. De eksporterte filnavn kan konfigureres i Avansert-konfigurasjoner (se protokoll Trinn 5.2). Formatet utgangsfilen er en tab-avgrenset tabell som organiserer volumverdien til den opprinnelige plate-format i størrelsesorden en stigende plate nummer for hvert tidspunkt; og alle tidspunkter er organisert i en stigende rekkefølge (figur 5D). Listen output fil er en fane-avgrenset tabell som inneholder alle målingene i form av bestilte lister (figur 5E).

Representative Results

SpheroidSizer er utviklet for å produsere automatisert deteksjon, avgrensning og måling av 3D sfæroider, med bemerkelsesverdig redusert arbeidskraft og akutt økt effektivitet for store mengder bilder. Figur 1a viser arbeidsflyten av SpheroidSizer. Kjernen beregningsmåten omfatter automatisert initialisering, aktiv kontur algoritme og kontur kvantifisering. Etter automatisert beregning, bruker kvalitetskontroll funksjonen en kombinasjon av "Manual Initialize" og "Hånd Draw" verktøy for å berge noen ufullkommen segmentering. Figur 1B viser detaljert automatisert aktiv kontur algoritme. Den innledende trinn (0. iterasjon) benytter basisbildeprosesseringstrinn for å generere omtrentlige størrelsen og plasseringen av den sfæroide og generere en sfærisk kontur initiering med en beregnet størrelse. Innvielsen kontur trekkes inn i den aktive konturen algoritmen. I sin tur gjentar det å justere i henhold til det lokale bildetgradient og form kurvatur. Den aktive konturen algoritmen er ferdig når konturen stabiliserer (konvergerer), dvs. 477 iterasjoner for dette bildet, eller når den forhåndsdefinerte maksimale antall gjentakelser blir henrettet. I dette eksemplet er initialisering kontur hensikt forstørret for bedre å frem algoritmen. I virkeligheten er initialisering vanligvis svært nær den faktiske grensen og mye færre iterasjoner er nødvendig for algoritmen til å konvergere. Deretter tar algoritmen morfometriske målinger av den detekterte sfæroide grense. De store og små aksene i spheroid måles MATLAB bildebehandling verktøykasse (figur 1C). Den store akse er definert som den linjesegment kobler et enkelt par av de fjerneste punkter på konturen, som er referert til lengden (L). Den mindre aksen er definert som den lengste linje vinkelrett på hovedaksen, som er referert til bredden (W). I dette tilfelle verdiene av L og W er svært nær ettersomspheroid er sfærisk. Volumet av den sfæroide er beregnet som V = 0,5 * L * W ^2.

En av funksjonene i SpheroidSizer er dens automatisert deteksjon av grensen av sfæroider selv på bilder med ujevn eller støyende bakgrunn utnytte den aktive konturen algoritmen (Tall 2B-D). Computational behandling av lyse feltet bilder er ofte plaget av ujevn bakgrunn, som villeder adaptive thresholding-baserte metoder for å produsere uønskede thresholding resultater. Problemet er spesielt tydelig når det multi-brønn plater blir brukt og veggene i brønnene kan skape skygge på bildene. Imidlertid, fordi den aktive kontur algoritmen er ikke følsom for den gradvise endringen i skyggelegging bakgrunn, er det i stand til å identifisere sfæroide segmentering i disse lyse feltbilder med riktig initialisering. Figur 2 viser noen eksempler på bilder med ujevn eller støyende bakgrunn, som ujevn belysning (Figur 2B (figur 2C) eller nekrotisk kjerne (figur 2D). Med automatisert aktive kontur algoritme, delineates SpheroidSizer Disse sfæroider nøyaktig i alle disse bildene som vist i den røde konturen på det nedre panel i hver figur.

Kvalitetskontroll funksjon i SpheroidSizer er nøkkelen til en høy gjennomstrømming arbeidsflyt. "Manuell Initialize" og "Hånd Draw" verktøy er verdifulle gratis verktøy for dette programmet. Blant hundrevis eller tusenvis av bilder, er det uunngåelig at den automatiserte algoritmen er ikke i stand til riktig oppdage sfæroider i noen bilder. Som illustrert i figur 3A, når feilaktig deteksjon av den sfæroide forårsakes på grunn av klargjøringstrinn, det vil si feil størrelse eller plassering av initiering kontur i bildet (topp-panelet), arbeider "Manual Initialize"-verktøyet ved å tillate brukeren å riktig definere plasseringen og størrelsen på SPHEROID manuelt (nedre panel). Det utløser den aktive konturen algoritme for å sette i gang med manuelt definert kontur og gjennomføre til sammen på ønsket disposisjon. For disse tøffe bilder som originalbildet i Figur 3B, er spheroid ligger i et distraherende og støyende bakgrunn. SpheroidSizer er ikke i stand til skikkelig identifisere spheroid ved automatisert metode (øverste panel) eller av "Manual Initialize" verktøy med riktig initialisering (midtre panelet). I dette tilfellet kan "Hand Draw"-verktøyet brukes til å tegne omrisset av den sfæroide manuelt som vist i det nedre panel. Programmet benytter den brukerdefinerte grense for å måle de store og små aksene av sfæroide, og beregne volumet. Alle de korrigerte resultater er umiddelbart innlemmet i "Resultater", og kan følgelig eksporteres.

For å bestemme ytelsen til SpheroidSizer i større datasett, vi først sammenligne driftstiden vedanalysere det samme settet med 288 bilder med en) manuelle målinger med mikroskop leverandør medfølgende programvaren; 2) SpheroidSizer med en single-core vanlig laptop; og 3) SpheroidSizer med en multi-core parallell databehandling ytelse arbeidsstasjon. De manuelle målingene følger våre typiske protokollen før utvikle programvaren: lengden og bredden på hver spheroid er tegnet for hånd og målt med leverandøren program (sett de røde linjene i den øvre delen av figur 4A); så brukeren kopiene ned verdiene av målinger. SpheroidSizer behandler hvert bilde ved å generere spheroid grensen (som får rødt omriss i nedre panel av figur 4A), måle aksial større og mindre lengde, og eksportere resultatene i regneark. Som det fremgår av tabell 1, basert på beregningen av 288 bilder, tar det et gjennomsnitt på 31,67 sek for å måle en sfæroide per bilde manuelt; mens det tar bare SpheroidSizer mindre enn 2 sek & # 160; når du kjører på en single-core vanlig laptop; og mindre enn ett sekund når du kjører på en 12-core ytelse arbeidsstasjon. Derfor er bildeanalyse enn 18x raskere per bilde ved hjelp SpheroidSizer enn manuelle målinger. Det reduserer dramatisk arbeidskraft når mer enn tusen bildene analyseres. Deretter sammenligner vi variasjonen i målinger av de 24 sfæroider vist i figur 4A mellom manuelle målinger og SpheroidSizer. De 24 sfæroider måles tre ganger av begge metoder; og standardavviket for hver enkelt spheroid beregnes. Som vist i figur 4B, er standardavviket fra SpheroidSizer (grønn linje og prikker) er nær null med unntak av de tre sfæroider som er korrigert ved kvalitetskontrolltrinn, noe som fremdeles viser mindre standardavvik enn de fra den manuelle målinger metoden. Alt dette viser at SpheroidSizer utfører bildeanalyse mer effektivt og nøyaktig.

e_content "> Vi gjennomførte en narkotika-skjermen ved hjelp av menneskelige BON-en 3D tumor sfæroider å finne ut hvilke forbindelser i kombinasjon med en Hsp90 inhibitor er de potensielle kandidater for testing av anti-tumor effekter in vivo. Menneske BON-en 3D-tumor sfæroider ble dyrket på agarose-belagt 96-brønners plater som beskrevet i forrige papir ^15. Åtte forskjellige forbindelser med seks seriefortynning pluss media og kjøretøyet ble screenet for sine enkle og kombinatoriske effekter med 10 nM og 20 nM Hsp90 inhibitor i duplikater hhv. To ving ble brukes for hver konsentrasjon av den individuelle forbindelse eller de kombinerte forbindelser. fire 96-brønners plater med totalt 384 sfæroider ble anvendt. Alle sfæroider ble fotografert ved 0, 72, 144, 168 og 192 timer. Totalt 1920 bilder ble fremstilt fra dette eksperimentet. Det tok SpheroidSizer bare 30 minutter å fullføre beregningsanalyse av de 1920 bildene med en ekstra 50 min for kvalitetskontroll og eksport av data. SpheroidSizer hastigheter opp bildeanalyse prosessen enormt. Figur 5A viser et skjermbilde av mappen ordninger og filnavn for dette eksperimentet som et eksempel for Protocol Trinn 3.3. Figurene 5B-E viser skjermbilder av bildeanalyse pop-up vinduer og resultater . hjelp SpheroidSizer som illustrasjoner til Protocol trinn 4, 5, og 7 Tar volumene av 3D sfæroider fra den formaterte resultattabellen eksportert fra SpheroidSizer, gjorde vi grafer - vekst av 3D tumor sfæroider på sammensatte behandlinger versus tid av behandlinger. To representative grafer fra dette forsøk er vist på figur 5F og 5G. Figur 5F viser at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og cladribin (grønn linje) inhibere veksten av 3D sfæroider mer enn én behandling av Hsp90 inhibitorer (purple linje) eller cladribin (oransje linje), noe som tyder på at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og kladribin kan ha anti-tumor effects in vivo. Figur 5G viser at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og adriamycin (grønn linje) ikke hemmer veksten av 3D sfæroider mer enn én behandling av adriamycin (oransje linje) eller Hsp90 inhibitorer (purple linje), noe som tyder på at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og adriamycin kanskje ikke har anti-tumoreffekt in vivo. Dette eksperimentet hjalp oss å velge forbindelsene for å teste deres anti-tumorvirkninger in vivo og SpheroidSizer er nøkkelen til den raske eksperimentelle dataanalyse.

Tabell 1. Sammenligning av driftstiden på bildeanalyse mellom manuelle målinger og SpheroidSizer når analysere det samme settet med 288 bilder. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av denne tabellen.

Figur 1 SpheroidSizer -... En åpen kildekode-program for å måle spheroid størrelse A) Kjernen arbeidsflyten av søknaden B) Illustrasjon av den aktive konturen algoritmen på ulike stadier av iterasjon. Vær oppmerksom på at initialisering kontur (iterasjon 0) ble med vilje forstørres for å vise frem algoritmen. C) De større og mindre målinger aksial lengde og beregning av volumet av SpheroidSizer. L - hovedakse: linjesegment kobler et enkelt par med fjerneste punkter på konturen (referert til lengden); W - akse: den lengste linje vinkelrett på hovedaksen (referert til bredde).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figur 2. Representative resultater fra den automatiserte segmentering av SpheroidSizer, viser robusthet mot ulike bildeforhold. A) bilder Typisk god kvalitet. B) med forskjellig lysstyrke og kontrast. C) Bilder med distraherende rusk. D) Bilder av sfæroider med nekrotisk kjerne . Bilder på den øvre delen av hver figur er kilde / originalbildene; bilder på den nedre panel av hver figur er kvalitetskontroll bilder; og den røde omrisset er den sfæroide segmentering tegnet ved automatisert beregning.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Figur 3.. Illustrasjon av "Manual Initialize" og "Hand Draw" verktøy. A) "Manuell Initialize" verktøyet lar tegningen av en passende ellipse form over spheroid for initialisering, når unøyaktig spheroid segmentering skjer etter den automatiserte initialisering. B ) Den "Hand Draw"-verktøyet gir nøyaktig hånd tegning av spheroid grensen, når unøyaktige sfæroide segmentations oppstå med både automatiske og manuelle initialisering. Den blå linjen rundt spheroid viser initialisering kontur; den røde omrisset er det identifisert spheroid grensen. Vær oppmerksom på at spheroid i "Manuell Initialize" i A) og spheroid i "Hand Draw" i B) er med hensikt forstørret for å bedre vise frem verktøy.

Figur 4. Sammenligning av bildeanalyse ytelse mellom SpheroidSizer og manuelle målinger ved å analysere det samme settet av 24 bilder. A) Representative sfæroider for å vise hvordan den lengde og bredde av sfæroider som er bestemt av manuelle målinger og SpheroidSizer. Topp 24 bilder inneholder håndtegnet lengde / bredde på hver spheroid i røde linjer ved hjelp av manuelle målinger; lavere 24 bilder (de samme 24 bilder) inneholder data trukket spheroid grensen i rødt omriss hjelp SpheroidSizer. B) Standardavvik av lengde eller bredde fra tre målinger på hver enkelt spheroid.

Figur 5. Et representativt eksempel på utnyttelse av SpheroidSizer i narkotika skjermen - bildeanalyse på Sfæroidene 'bilder som ble samlet inn fra en narkotika-skjermen ved hjelp av BON-en 3D-tumor sfæroider A) Et skjermbilde av mappen ordninger og filnavn for dette prosjektet B) Et skjermbilde av den avanserte.. konfigurasjoner vindu i SpheroidSizer. C) Et skjermbilde av SpheroidSizer1.0 vindu med vises Resultater. D) Et skjermbilde av formatet utdatafilen eksportert fra SpheroidSizer. E) Et skjermbilde av listen output file eksportert fra SpheroidSizer. F) Vekst av 3D-tumor sfæroider ved behandlinger med Hsp90 hemmer og kladribin. G) Vekst av 3D-tumor sfæroider ved behandlinger med Hsp90 hemmer og adriamycin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>

Discussion

Denne studien presenterer en rask, fleksibel, effektiv og automatisert program - SpheroidSizer for nøyaktig bestemmelse av størrelsen på 3D-tumor sfæroider. SpheroidSizer er enkel å bruke og krever minimalt med brukerundersøkelser. De mest kritiske trinn for nøyaktig, jevn og vellykket drift av SpheroidSizer omfatter: at sfæroidene er avbildes i sentrum av feltet uten å berøre kanten av brønnen; alle filene som skal analyseres sammen som ett prosjekt bør bli fotografert under samme mikroskop med samme mål; alle filene som skal analyseres er riktig navn og arrangert som angitt i protokollen; og riktige brukerdefinerte innstillingene er lagt inn før beregning.

Fordelene med SpheroidSizer omfatter dens evne til å tolerere en gradvis endring i bakgrunnen av bildet, så vel som å generere glatt kontur som svarer til de generelle sfæriske former av sfæroider utnytte den aktive kontur algoritmen. Utførelse av aktivkontur kan bli svekket i to situasjoner: dårlig initialisering, eller tilstedeværelse av andre lokale kanter distraherende fra ønsket kontur. Spesielt i våre testede tilfeller den andre situasjonen ofte skje når nekrotisk kjerne av et stort sfæroide tiltrekker den aktive kontur som resulterer i mindre kontur blir rapportert. Det er verdt å merke seg at andre automatiserte terskelbaserte metoder også lider i denne situasjonen, med mindre terskel er spesielt satt for hånd. Programvaren legger derfor frem innsats for å hjelpe brukere å oppdage og utbedre kompromittert segmentering ved å tilby enkle kvalitetskontroll funksjoner. Hvis segmentering feil skjer fra fattige initialisering, kan bruksområder bruke "Manuell Initialize" verktøyet for å overstyre den automatiserte initialisering. Når bildekvaliteten er for dårlig for aktiv kontur, kan brukere enkelt "Hand Draw" konturen som strømmer inn kvantifisering. Eksisterende programvare som CellProfiler kan tilpasses for dette programmet i en semi-automatisert moten. Den arbeidsflyt kan være uhåndterlige når store mengder av bilder med forskjellige avbildningsbetingelser er presentert, eller når en undergruppe av bildene krever mer menneskelig inngrep for å måle korrekt. SpheroidSizer gir en alt-i-ett-suite for beregning og kvalitetskontroll for å håndtere høy gjennomstrømming bildeanalyse arbeidsflyt.

SpheroidSizer er for tiden begrenset til detektering av en sfæroide per bilde, og bare måler den aksiale lengden av den sfæroide. Programmet kan bli utvidet til ytterligere støtte kvantifisering nødvendig av forskere som kvantifisering av sfæroider med nekrotisk kjerne, å detektere flere sfæroider i ett bilde eller overvåking av formen av sfæroider. Videre kan programmet bli modifisert til å detektere og måle størrelsen av tumorer skåret ut fra dyr eller menneske, som vil helt sikkert være fordelaktig for forskere ved gjennomføring av in vivo pre-kliniske og kliniske undersøkelser. Post-prosessering av de detekterte sfæroider kan også undersøkes sikteing på å redusere menneskelig innsats som trengs for kvalitetskontroll og ytterligere forbedre gjennomstrømningen. SpheroidSizer er en generalisert bildeanalyse-program for 3D-tumor sfæroider som er produsert fra noen celletyper, og derfor kan brukes ved et stort kreftforskning fellesskap.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		microscope for imaging
Vostro 1720	Dell Inc.		single-core regular laptop
HP Z820	HP Inc.		multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software