Summary
Måling af osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) af celler kan hjælpe med at forstå de regulatoriske mekanismer aquaporiner (AQPs). P f beslutsomhed i sfæriske plantecelleprotoplaster præsenteres her involverer protoplaster isolation og numerisk analyse af deres oprindelige sats på volumen forandring som følge af en osmotisk udfordring under konstant bad perfusion.
Abstract
Studere AQP reguleringsmekanismer er afgørende for forståelsen af vand relationer på både den cellulære og hele planten niveauer. Præsenteret her er en enkel og meget effektiv metode til bestemmelse af den osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) planteprotoplaster, der gælder i princippet også for andre sfæriske celler såsom frøoocyter. Det første trin i assayet er isolation af protoplaster fra plantevæv af interesse ved enzymatisk fordøjelse i et kammer med en egnet isotonisk opløsning. Det andet trin består af en osmotisk udfordring analyse: protoplaster immobiliseret på bunden af kammeret underkastes en konstant perfusion udgangspunkt med en isotonisk opløsning og efterfulgt af en hypotonisk opløsning. Cellen hævelsen er optages på video. I det tredje trin, vises billederne behandles offline for at give mængdemæssige ændringer, og tidsforløbet af ændringerne volumen er korreleret med tidsforløbet af ændringen i osmolakerhed af kammeret perfusionsmediet, ved hjælp af en kurve montering procedure skrevet i Matlab (den »PfFit«), for at give P f.
Introduction
Vandoptagelse og flowet over cellemembraner er en grundlæggende forudsætning for plante eksistens på både cellulær og hele planten niveauer. På celleniveau, aquaporiner (AQPs) spiller en central rolle i reguleringen af den osmotiske koefficient vandpermeabiliteten (P f) af cellemembranen 1-3.
Til dato har flere metoder blevet anvendt til at måle den endogene P f af protoplast fra forskellige planteorganer (dvs. rødder, mesophyll, endodermis etc., Revideret af Chaumont et al. 4). En af de metoder til at måle P f er at udsætte protoplasterne til en osmotisk udfordring og til at overvåge den oprindelige sats på sin ændring volumen (dvs.., Hældningen af den tidlige lineære fase af ændringen volumen). To forskellige metoder blev tidligere beskrevet baseret på denne fremgangsmåde, begge baseret på en øjeblikkelig udveksling af løsninger. Den første består af immobilizing protoplasten med en suge mikropipette og skifte vaskemiddeltilførslen 5 og den anden for at overføre protoplasten fra en løsning til en anden ved hjælp af en mikropipette 6. Disse mikropipette suge og mikropipette overføre metoder, som giver billedet erhvervelse ved starten af den hurtige løsning udveksling (for at fange den tidlige lineære fase af volumen forandring), sandsynligvis indebære en fysisk stress til protoplaster og kræver specialiseret udstyr og ekspert mikromanipulering.
Den her beskrevne metode minimerer forstyrrelse til cellerne, indebærer nogen mikromanipulering og tillader afledning af P-f, når badet perfusion ikke er øjeblikkelig.
Efter enzymatisk nedbrydning, protoplasterne, nedsænket i en isotonisk opløsning, immobiliseres på dækglasset glas bunden af en Plexiglas (alias Lucite eller plexiglas) kammer ved interaktion beregning. Derefter, under en konstant bad perfusionisotonisk opløsning skylles væk af en hypotonisk opløsning generere en hypoosmotisk udfordring protoplasterne. Hævelsen af protoplast er video registreres og derefter, ved at kombinere information om tidsforløbet for badet perfusion og tidsforløbet af cellen hævelse, er P f bestemmes ved billedbehandling og kurvetilpasningsteknikker procedurer.
Fordelene ved denne metode er, at forsøget er meget effektiv, dvs det er muligt at overvåge nogle celler samtidig i en enkelt analyse, og at det ikke kræver særligt udstyr eller særlig mikromanipuleringsmetoder færdigheder. Der er mulighed for flere ansøgninger for denne metode. For eksempel, bestemmelse af det native Pf af en række celler fra forskellige væv og planter, såsom mesophyll og samle kappe celler fra Arabidopsis blade 7, majs blad mesophyll eller root cortex celler 8-10 eller suspension dyrkede celler 11,12. I Additipå, er det muligt at bestemme Pf af sfæriske dyreceller såsom oocyt celler 11. Et andet eksempel involverer undersøgelse af AQP aktivitet ved forbigående ekspression af deres gen i protoplasterne (eller andre gener, der kan påvirke dem, fx, gener af kinaser) og bestemmelse af deres bidrag til P F; for eksempel ekspression af tomat AQP SlTIP2, 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster af PEG transformation og beslutsomhed for SlTIP2, 2-relateret P F 13. Endelig undersøgelse af effekten på P f forskellige molekyler / stoffer (lægemidler, hormoner, etc.) tilsat til løsninger kan også blive undersøgt, for eksempel af AQP blokker HgCl2 7.
Følgende protokol beskriver isoleringen af protoplaster af Arabidopsis mesofylceller og bestemmelse af deres Pf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af løsninger
- Forbered isotonisk (600 mOsm) og hypotonisk (500 mOsm) opløsninger indeholdende 10 mM KCI, 1 mM CaCl2, og 8 M 2-(N-morpholin) -ethanesulphonic acid (MES), pH 5,7 og justere osmolaritet med de passende mængder af D-sorbitol: 540 mm for isotonisk og 440 mm for hypotonisk væske. Kontroller osmolariteten af opløsningen (inden for 3% af den nominelle værdi) ved hjælp af en osmometer.
- Forbered en tør bestand af 'enzymatisk mix «indeholder følgende enzymer: 0,55 g cellulase 0,1 g Pectolyase, 0,33 g polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (se tabel 1 nedenfor), blandes det tørre pulver ved vortex, lave 5,7 mg portioner og opbevares ved -20 ° C.
2. Isolering af Arabidopsis mesophyll Protoplaster
- Forbered en petriskål (10 cm) med omkring 6 dråber (ca.. 30 pi hver) af isotonisk opløsning.
- Skræl abaxial (lavere) Arabidopsis blad epidermis Cut den skrællet blad i firkanter på omkring 4 x 4 mm 2, og derefter placere firkanterne på isotonisk opløsning falder med den udsatte abaxial nedad, røre løsningen.
- Opløs 5,7 mg af enzymet mix i 165 pi isotonisk opløsning (3,3% w / w) i et 1,5 ml rør, bland forsigtigt ved pipettering i et minut eller så indtil den er opløst, og placere flere lignende dråber af den enzymatiske opløsning i samme Petri skål.
- Overfør bladstykkerne på enzymatiske løsning dråber, lukke skålen forsegling låget med en runde af parafilm og inkuberes i 20 min, svævende skålen i et vandbad indstillet på 28 ° C.
- Tilføj flere flere dråber isotonisk opløsning til fadet (2 dråber pr hvert enzym løsning dråbe). Overfør hvert blad stykke til en ny isotonisk opløsning dråbe, så sekventielt til en anden dråbe (at vaske den enzymatiske opløsning væk). Løft brik i kanten med en pincet, ryst den i anden drop (ligesom en tepose) for at frigøre protoplasterne.Saml dråberne med protoplasterne (ved hjælp af en klippes 100 ul pipettespids) i et 1,5 ml rør.
3. Hypotonisk Challenge Assay: Arabidopsis mesophyll Cell Hævelse
- Forbered perfusion (figur 1A) ved at fylde en kolonne med isotonisk opløsning, og en anden kolonne med hypotonisk opløsning. Åbn ventilen, lade en opløsning strømning (først hypotonisk, så isotonisk) for at fylde slangen hele vejen ned til indsugningsmanifolden (figur 1B). Sørg for der ikke er nogen luftbobler, og derefter lukke ventilen.
- Seal et dækglas, ved hjælp af silikone fedt (tabel 1), for at gøre en bund for kammeret i plexiglas dias (figur 1B, se også de skemaer af kammeret i figur 1C). For at gøre kammeret bunden (den vender opad blotlagte overflade af dækglasset i fedt ringen) "sticky" til protoplaster, coatmed positiv ladning-bærende protaminsulfat (1% i vand, tabel 1) eller poly-L-lysin (0,1% i vand; tabel 1). Spred denne "lim" over dækglasset ved hjælp af en pipettespids, vent til 1 - 2 minutter, skyl 3 - 4 gange med isotonisk opløsning og ryst væk den resterende opløsning.
- Fyld kammeret op med isotonisk opløsning. Derefter tilsættes en dråbe af protoplaster indeholdende opløsning til kammeret ved hjælp af en klippes pipettespids og vente 3 - 4 min for protoplasterne at bosætte sig. Dæk kammer med et gennemsigtigt låg (figur 1D, 1E) rører løsning overflade (undgå at fange luftbobler under).
- Placer dias (forsigtigt!) På et omvendt mikroskop bord, skal det tilsluttes perfusionssystemet og pumpen (beskytte mod luftbobler i slangen!) Og tænd for isotonisk opløsning flow for konstant perfusion ved 1 ml / min (hurtigere satser kan anvendes op til 4 ml / min).
- Til optagelselydstyrkeændringer er et omvendt mikroskop anvendes med en 20X objektiv og med en CCD-videokamera tilsluttet en pc. Bruge 'CMU 1394 Camera Driver', plugin af ImageJ software (se tabellen af specifikke materialer til download adresser disse to software stykker) til at optage et 60 sek video film af udvalgte immobile protoplaster (formentlig dem, der sidder fast i bunden) med en hastighed på 1 billede / sek (1 Hz). Start optagelsen med en 15 sek vask af isotonisk opløsning (dette udgør baseline), skifte til den hypotonisk opløsning i 45 sekunder (for at gennemføre i alt 60 sek fra starten af perfusion). Gem film i TIF-format. BEMÆRK: Vælg en visning område med så mange celler som muligt, opfylder et af følgende kriterier: kugleformet og med et godt fokuseret celle kontur på deres største omkreds (figur 2A).
4. Analyse af Cell Volume Change Brug ImageJ
BEMÆRK: For at analysereserie af billeder af en hævelse celle, bruge 'Billede Explorer' og 'Protoplast Analyzer' plugins i ImageJ software (skrevet af Xavier DRAYE) 14. Startende med de valgte protoplaster til deres første tidspunkt, vil 'Protoplast Analyzer' plugin registrerer automatisk Protoplasterne kanter (konturer), og beregne den tid løbet af deres områder under eksperimentet (plugins er tilgængelige med det PfFit analyseprogram, nedenfor) .
- Start ImageJ. For at åbne filmen, skal du klikke på "File" på panelet ImageJ, så fortløbende på dropdown menuerne, som de udfolder sig: 'Importer' og derefter 'Billede Explorer'. Fremhæv den valgte film, højreklik på det, og derefter venstre-klik på "Protoplast Analyzer". Gennemse filmen (ved hjælp af en skyder i protoplast- billedet nederst) for at identificere protoplaster, der forbliver stort set ubevægelige under forsøget - disse vil blive analyseret. Tilbage på den første image, ved hjælp af musen, tegne cirkler (plukket fra ImageJ tegneværktøjer) omkring de udvalgte protoplaster (figur 2B), og klik på 'OK' i tabellen af 'parametre afsløring', der optrådte.
- For at starte protoplast- afsløring algoritme, skal du klikke på 'lokal' på protoplast billede toppanelet, så "processen" i rullemenuen. Undersøg de grønne cirkler omkring de udvalgte protoplaster (figur 2C) i hele filmen. Gem 'Result "i en Excel-fil. Afslut ImageJ. BEMÆRK: I tilfælde vises en rød prik (for at angive en dårlig konturtilpassede - som regel på grund af et dårligt image kontrast), gentages med forskellige parametre.
- For at adskille de linjer, der hører til hver celle (som - hvis to eller flere celler blev analyseret samtidigt - vil blive flettet sammen, fordi analysen er udført billede efter billede) i Excel, sortere de gemte data fra celle nummer kolonne (»formål« ).
- Til Determine pixel-til-um omregningsfaktor for at få den reelle værdi af P f, snap et billede af en mikrometer lineal via samme 20X mikroskop mål. Træk en linje (plukkes fra ImageJ tegneværktøjerne) langs linealen billede og læse antal pixel svarende til linealen længde i bunden af ImageJ hovedpanelet. Konverter de vilkårlige pixelområde værdier i Excel-filen i um 2. Gem områder tidsforløbet (for hver celle separat) som en tekstfil (to kolonner af tal kun). BEMÆRK: Dette vil være et input til volumen-fitting "PfFit programmet.
5. Modeling Rate of Osmolaritet Ændring i forsøgskammeret Brug ImageJ og Matlab Program P f Fit
- Tilsæt 2 mg xylencyanol (tabel 1 nedenfor) til 100 ml af isotonisk opløsning (til fremstilling af "indikatorfarvestoffet).
- Forbered perfusionssystemet (som i 3.1) med indikatorfarvestoffet og ikke farvet hypotonic opløsning.
- Forsegle en tildækningsslip hjælp silikonefedt til bunden af plexiglas kammer, derefter forsigtigt fylde kammeret med indikatorfarvestoffet, dække den med et dækglas (som med protoplasterne før), og læg den på mikroskop scenen.
- Slut kammer til perfusionssystemet og pumpen, og tænd indikatorfarvestoffet flow for en konstant perfusion på l ml / min.
- Optag en 60 sek film med en sats på 1 Hz. Start optagelsen med 15 sek af indikatorfarvestoffet, skifte til den hypotonisk løsning for 45 sek. Stop optagelserne. Flugter med indikator (i det mindste for 30 sek), og derefter starte en ny film. Gentag omkring 5 - 6 gange, og gemme alle de film
- Brug ImageJ software til at analysere videobilleder af indikatorfarvestoffet transmittans for at opnå et gennemsnit tidsforløbet for skiftende transmittans.
- Start ImageJ Klik på 'Filer', så 'Åbn', og søg efter filmen. For hver film, tegne en 10 pixel bred lodretrektangel overalt på 1. billede af filmen. Klik på 'Billede' på ImageJ hovedpanelet, og klik på 'Crop "i rullemenuen.
- Sådan justeres 60 billeder (i 60 sek film) i en række, skal du klikke igen 'Billede', og klik derefter på hinanden i dropdown menuerne, som de udfolder sig: »Stakke" og "Make Montage« (kolonne 60, række 1). Tegn en 1 pixel høj vandret rektangel overalt langs hele rækken af billeder, og klik på 'Analyze' i ImageJ hovedpanelet, og klik på 'plot profil «i rullemenuen. BEMÆRK: En »Plot af Montage« vises vinduet (ikke vist), og en liste over transmittansdata kan åbnes fra menuen. Hvert billede i filmen er repræsenteret på denne liste med 10 transmittans værdier oprindelse i sin 10 pixel bred rektangel og dermed "tid base" (billedet løbenummer) er 10 gange længere.
- Kopier listerne af transmittansen daten (én liste pr film) til en Excel-fil. Gennemsnittet af transmittans tidsforløb opnået fra flere film af indikatorfarvestoffet hedeture. Generer en tidstro basis ved at multiplicere billedet løbenummer med 0,1. Gem den i gennemsnit tidsforløbet (to kolonner) til en tekstfil. BEMÆRK: Før udligning, hvis det ønskes, plotte individuelle tidsforløb, at afvise eventuelle uregelmæssigheder. Sørg for, at filmen omfatter mindst 5 endelig sek af steady state transmittans af indikatorfarvestoffet.
- Start Matlab montering program P f Fit (den såkaldte indikator Fit 'panel, figur 3) til at beregne de forskellige parametre i osmolaritet tidsforløbet. BEMÆRK: baseret på de kendte indledende og afsluttende koncentrationer af løsningen i badet, er tidsforløbet af den skiftende osmotiske koncentration af opløsningen beregnes ud fra den koncentration tidsforløb (beregnet til gengæld fra indikatorfarvestoffet transmittans), forudsat det følger de samme dynamik somkoncentration farvestof. P f Fit er et program til rådighed til brug gratis. Den "PfFit_Installer_web.exe« kan downloades fra: P f Fit brugervejledning "med detaljerede forklaringer og definitioner er tilgængelig via Jove som en supplerende fil, som hjælper til at sætte brugeren med P f Fit program.
- I »Indikator Fit 'panel, importere data fra den gennemsnitlige tid løbet af indikatorfarvestoffet transmittans (' Indikator datafil«, figur 3A) og indsæt manuelt de aktuelle eksperiment parametre og de indledende gæt af parametrene »bredde« og » 'Klik beskrive tidsforløbet for koncentrationen indikator (figur 3B. t_half Kør "for at se afbildninger af tidsforløbet af indikatorfarvestoffet koncentration (reelle data og pasform, figur 4A), og modellerede (beregnet) bad osmolaritet (figur 4B). BEMÆRK: agood fit til data er afgørende (en anbefaling: starte med værdierne i figur 3).
6. Bestemmelse af P-f ved hjælp af Matlab Fitting Program P f Fit
BEMÆRK: Ud over de grundlæggende antagelser med hensyn til opførsel af en protoplast som en sand og perfekt osmometer 11, bestemmelse af P-F hviler på den formodning, at P f kan ændre sig med tiden, at denne dynamik P f ligger til grund for tid løbet af ændringen cellevolumen og at tre parametre tilstrækkeligt til at beskrive den: P-fi (den oprindelige værdi af P-f), Slope Pf (hastigheden af den lineære ændring P f) og Delay (tidsrummet fra begyndelsen af badet osmolaritet ændring indtil starten af cellevolumen ændring). Forskellige modeller kan testes, herunder forskellige kombinationer af disse parametre og deres værdier, herunder Null-værdier 11. P
- Skift til 'Lydstyrke Fit' (figur 5). Vælg til import filen områder data (tekstfil med tidsforløbet for »områder« i de analyserede protoplaster, figur 5A). Vælg 'Sidste Indikatorarmatur' som parameter kilde (figur 5B, se »P f Fit brugervejledning" for alternativer). BEMÆRK: Disse parametre (figur 5D) anvendes derefter til at regenerere osmotikum ændring i badet for de mængder tilpasningsproceduren.
- I 'Lydstyrke Fit' (figur 5C), initialisere (udfylde de indledende gæt for) P f parametre: P f, hældning Pf og forsinkelse (en anbefaling: start med 1, 1, og 30, henholdsvis), Valgte model 'gruppe' (en anbefaling: starte med II og mark »kontrol« for alle tre parametre, der skal monteres). Klik på 'Kør', så øjeæble den foreløbige tal (figur 5E) og justere forsinkelsen parameter og længden af pladen, hvis det er nødvendigt.
- Undersøge resultaterne grafen (figur 6) til at vurdere fit kvalitet og optage pasformen fejl. Skift initialiseringsskærmens parametre et par fold hver, og re-'Run «. BEMÆRK: Må ikke blive afskrækket, når programmet bliver hængende - bare genstarte programmet!
- Gentag denne procedure flere gange, startende med forskellige kombinationer af initialiseringsparametre, sigter til den laveste værdi af den pasform fejl.
- Kopiere listen af FIT resultaterne direkte fra skærmen, eller finde dem i than PfFit-genereret '_FIT_Vol_Results.txt' fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme P f og sammenligne aktiviteten af forskellige AQPs er mesophyll protoplaster fra Arabidopsis blad anvendes. Disse protoplaster blev fundet at have lave basale (baggrund) P f niveauer 7 og kan tjene som en funktionel-ekspressionssystem for at muliggøre reproducerbare P f målinger.
Protoplaster fra en moden blad fra en 6 uger gamle Arabidopsis planter blev isoleret og tre genkonstruktioner med AQP gener fra Arabidopsis (AtPIP2, 1) og majs (ZmPIP1, 2 og ZmPIP2 4) var forbigående (og separat) udtrykt ved brug af PEG-transformationen Fremgangsmåde 15. Antages det, at tilfælde af transformationen er samtidig for et stort antal af plasmider, der anvendes til den celle, uanset deres art og er baseret på de resultater, der viste en succesrate på 100% til synkroniseret transient ekspression af to plasmider i en celle tidligere rapporteret for andre plantearter systemer15,16, blev co-transformeret med en vektor, der koder for forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) for at mærke de transformerede protoplaster (Figur 7).
For P f assays blev protoplaster sæt i den eksperimentelle kammer (figur 1B), og GFP-mærkede protoplaster blev overvåget ved video, mens de oprindeligt blev skyllet med isotonisk opløsning (600 mOsm) og derefter med hypotonisk opløsning (500 mOsm), ved hjælp af perfusion (figur 1A).
De tidsforløb for ændringer celle volumen (figur 8A) blev opnået for hver celle i to etaper: først, 'Image Explorer "og" Protoplast Analyzer' plugins blev brugt til at generere tidsforløbet af ændringer i cellen kontur området (figur 2), og derefter blev Matlab montering program P f Fit (Figur 5) bruges til at importere THESe områder og konvertere dem til cellevolumener. P f-værdier (figur 8C) blev afledt for hver celle ved hjælp af P f Fit programmet (figur 5), baseret på tidsforløbet af cellevolumener og derudover på den importerede gennemsnit tidsforløbet for transmittansen ændringer af indikator Dye (figur 3), omdannes til tidsforløbet for indikatorfarvestoffet koncentrationsændring (Figur 4A), og derefter - at tidsforløbet for badet osmolaritet ændring (figur 4B, 6A og 8B). Det er værd at bemærke, at delC forskellen i osmotiske koncentrationer i cellen (Cin), og i badet (Cout), dvs., Den drivende kraft for det vand tilstrømning, skyldtes næsten kun på ændringer af Cout (figur 6A ). I dette eksperiment Pf øges under assayet (figur 6B).
P f f af kontrol transformeret med GFP alene (figur 8C).
Figur 1: volumen-analysesystem. (A) Den eksperimentelle opsætning: Perfusionen systemet indeholder opløsning reservoirer (infusionsteknikker kolonner 'Cols'), slange (T), ventiler (V) og en peristaltisk pumpe (P) forbundet til plexiglaskasser diassæt på mikroskopet bordet. HS = hypotonisk opløsning, isotonisk opløsning, Cm kamera. (B) En forstørret afbildning af plexiglas objektglasset med den eksperimentelle kammer (CHR) og slangen bundet via et indløb (I) manifoldforbindelsesorganet. Opløsningen suges fra kammeret via et udløb (Out) til pumpen. (C) En skematisk tegning af plexiglas dias (mod uret: ovenfra, lang side-visning og korte side-visning): a = dækglas, den centrale afdeling bunden; b = klar tape (tabel 1), der tjener som en bund for tilførte og den udsugede løsning riller, der fører til og fra den centrale afdeling; når Scotch tape udskiftes (kun lejlighedsvis), er et hul skåret i den under kammeret; C = en plexiglas blok limet til dias; D = en stikkontakt stik hul. Tal er mm (men tegningen er ikke målestokstro). (D) En forstørret afbildning af den midterste del af objektglasset med det gennemsigtige låg (også plexiglas) delvis dækker det centrale kammer (pile). (E) Skematisk tegning (øverst og udsigt side) af det gennemsigtige dæksel. Størrelsen af det gennemsigtige dæksel håndtaget (grøn plast i D) er vilkårlig. Andre detaljer er som i C.
2 / 51652fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Analyse af hævelse protoplaster billeder ved hjælp af den »Protoplast Analyzer 'plugin. (A) en, det første billede af filmen med protoplaster, b, som i en, men gule cirkler indikere valget foretaget efter en gennemgang af filmen, før konturerne detekteres automatisk, c, fra den første indtil det sidste billede de grønne cirkler stramt følge konturerne af de "artige" protoplaster undergår analyse. (B) "Time'-retters plots (med enheder af billedet nummer på abscisse) af de beregnede områder inden for protoplast konturer (» Område «, i kvadratiske pixel ) for hver sporet (og nummererede) protoplast. (c) parametre input panel af "Protoplast analysator plugin. Fire 'parametre detektion' kan justeres til at finjustere protoplast detektionsalgoritmen. »Antal grænserne pixels »Parameter den mindste tykkelse af protoplast- kontur (standard værdi: 5). Den "relative vægt« parameteren påvirker grå niveau tærskel forskel mellem den indre protoplast område og den ydre grænse (default: 2). Den "største omkreds forholdet" fastsat en tærskelværdi for at udelukke protoplaster når deres form afviger fra en cirkel. Denne parameter er forholdet protoplast omkreds til omkredsen af en perfekt cirkel, der har samme areal som protoplast (standard: 1,05). Den "maksimale stigning område« (% stigning per gang trin) parameteren udelukker protoplaster med kontur område stiger over parameterværdien (standard værdi: 5%). Endelig plugin også håndterer små protoplast bevægelser, men vil stoppe sporing protoplaster, der bevæger sig hurtigt, eller som forsvinder fra billedet området. Filmen kan køres igen lige så mange gange som nødvendigt, og en enkelt protoplast kan analyseres igen separat..com / filer / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den "Indikator Fit 'panel af P f Fit program. Denne del oversætter indikatoren transmittans tidsforløbet i bad osmolaritet tidsforløb. (A) Søg efter den gemte datafil med tidsforløbet for transmittansmålinger ændringer af indikatorfarvestoffet. (B) Brug enten den tidligere gemte listen over variabler og parametre, eller Indsæt manuelt de 5 variable værdier fra den aktuelle eksperiment: »true_C_init« og »true_C_end« (de osmolariteter i den oprindelige bad løsning og P f -assay løsning perfunderet via bad), 't_start_wash«(Varigheden af baseline prøveudtagning på det indledende indikatorfarvestoffet niveau),» threshold_% "(% af baseline værdi, hvor programmet automatisk registrerer afgang fra baseline transmittans, 1 - 5% er som regel den mest effektive),» N_steady_st_pts (antallet af prøver - med 10 prøver, der repræsenterer hver Indikatorfarvestoffet billede taget - som middelværdi i slutningen steady state niveau af indikatorfarvestoffet, afgørende for omdannelsen af indikatorfarvestoffet koncentration til den osmotikum koncentration) og indledende gæt for to af de fire parametre indikatorfarvestoffet transmittans sigmoidal tidsforløb, er bredden og t halvt (Ca. relateret til varigheden af overgangen del af sigmoid, og dens midtpunkt, henholdsvis; t halvdel kan være negativ!). To bedst tilpassede parametre, foruden "bredden" og t halvdelen opnås uden behov for startgætES: LAG (flush_lag «), den tid mellem ventilen åbning til ankomsten af opløsningen i badet, og» C_init «, uden en fysisk betydning, men er nødvendige for beskrivelsen af osmolaritet tidsforløbet (se Supplemental P f Fit brugervejledning.
Figur 4:. Indikator koncentrationen i badet og osmolaritet mediet (A) Tidsforløbet for indikatorfarvestoffet koncentrationen beregnes direkte fra data (prikker), og fra den bedst tilpassede parametre (linje), som det er vaskes væk af en ikke farvet opløsning. (B) Den beregnede tidsforløbet for osmolaritet ændring af badopløsningen, forudsat at den følger de samme dynamik som ændringen af indikatorfarvestoffet koncentration.
Figur 5:. 'Lydstyrke Fit' panel af P f Fit program (A) Browse for området tidsforløbet datafil for det analyserede protoplast (B) Vælg 'Sidste Indikatorarmatur' mulighed for at importere eksperimentets parametre fra. . sidste løb gennem "Indikator Fit" (se Supplemental P f Fit Brugervejledning til alternativer) (C) "Model Type '/' Klasse: Klasse I indeholder den enkleste model 1, Klasse II - modeller 2. - 5. klasse III - modeller 6 - 8. Modellerne forskellige med hensyn til, hvilke parametre fastsættes, og som er ved at blive justeret (dvs. frit variabel.) under montering procedure (kryds i feltet for at gøre det muligt at variere), og hvorvidt ' SlopePf «og / eller» Forsinkelse «, er ugyldige. Tilstandenls 1 - 6 er drøftet af Moshelion et al. 11. »Kombinationer lister parameterdataene valg dikteret af valget af 'Model Type' / 'gruppe'. Blandt modeller med en lignende pasform resultat - vælg den enkleste! Initialiser »P f ',' Hældning Pf« (»Slope_Pf«) og »forsinkelse« parametre som vist (flere detaljer om »forsinkelse« i E nedenfor). (D) De variabler og parametre, der beskriver tidsforløbet for skiftende bad osmotikum er input enten manuelt eller som beskrevet i B. (E) En foreløbig plot, ved at trykke "Kør", af et tidsforløb for volumen ændring påberåbes (beregnet fra cellen kontur-områder) for at hjælpe med valget af den oprindelige værdi for »Forsinkelse« parameter. Skøn efter eyeballing, den samlede længde af den basislinje fra 1. punkt indtil starten af celle volumen ændring (den "inklusive forsinkelse: Summen af »t-start-vask '+' LAG '/' flush-lag '+ den" fysiologiske "» forsinkelse «). Indsæt denne værdi som et input parameter for »forsinkelse« i »VolumeFit 'panel og' Kør 'igen (se også supplerende P f Fit brugervejledning).
Figur 6: Resultaterne af beslaget (A) "Bag kulisserne": de beregnede endelige tidsforløb for de osmotikum koncentrationer i de to rum:. Badet (Cout, grøn linje) og cellen (Cin, blå linje; Cin er beregnes på grundlag af protoplast volumen ændringer og en antagelse om, at plasmamembranen er gennemtrængelig kun til vand - den "perfekte og sande osmometer" 11) og tidsforløbet af forskellen mellem dem (delC, Rød linje), der er den drivende kraft for vandgennemstrømning, 'Eo-tlag «markerer afslutningen på' skyl-lag" og starten af hypotonisk udfordring (her kun på omkring 21 sek). Rød boks: den fejl pasformen værdi (fit-ERR, se definition i B nedenfor) (B) Det endelige resultat af montering af volumen tidsforløb;. Grønne boks: »inputvariabler« er værdier, der indtastes via P f Fit / 'VolumeFit' panel (defineret i figur 5A legende). Sort boks: »Exptl-Vol" og "monteret-Vol« er de eksperimentelle data og mængden beregnes ved hjælp af den bedst tilpassede parametre, henholdsvis 'Eo-tlag «er det samme som i A,' Eo-Delay 'markerer starten af volumenændring. »Område med 3% 'markerer lydstyrken som areal steg med 3%, den formodede grænse til cellemembranen evne til at strække uden at briste. »PF (skaleret)" er tidsforløbet for indretning based beregnede P f, der spænder over de værdier, der er angivet under den røde boks som "Span af P-f '. Røde felt: »MONTERET PARAMETRE 'er værdierne af de bedst tilpassede parametre:» Pf I' (den oprindelige P-f), »forsinkelse« (perioden mellem starten af hypotonisk udfordring og starten af ændringen (hvilket, efter modellen 5 anvendt i dette eksempel, er også starten på en ændring i P f værdi), og »hældning-P f '(den konstante ændring i P f værdi« fit_ERR' vist i A. - minimering mål for Matlab montering procedure - er "root-mean-square" afvigelse (dvs. en kvadratroden af et gennemsnit kvadreret afvigelse) af en grøn prik fra den sorte linje), præsenteret som% af baseline volumen It. er med denne værdi, at den relative succes af gentagen montering med forskellige parameter initialisering værdier vurderes. ANote forsigtighed: Som bedste tilpasning parameterværdier kunne være resultatet af et lokalt minimum findes i fejl minimering procedure - at kontrollere, at en global minimum er fundet, er der flere kørsler påkrævet med forskellige initialisering værdier for disse tre parametre (og bør tilstræbes det laveste fit_ERR under disse forsøg Blå boks:. deltaer er de ændringer, der skete ved udgangen af den monteret volumen Skift periode: 'Gennemsnitlig Volm%' er den relative udstrækning af den beregnede ændring protoplast volumen og 'Gennemsnitlig areal%' er den relative ændring af protoplast- overfladeareal. Den oprindelige størrelse af cellen er givet ved "radius", der stammer fra middelværdien af protoplastmetoden basale kontur område.
Figur 7: Epi-fluorescensmikroskopi visning af mesophyll protoplaster (A) under transmitteret hvidt lys og (B) ved 488 nm excitation og 520 nm emission. Målestokken:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:. Volumenændring og ekstraheret osmotiske vandpermeabilitet P f (A) Tidsforløb (60 sek) af protoplast hævelse ved udsættelse for hypotonisk udfordring (gennemsnit ± SE) (B) Den beregnede osmotikum koncentration i badet under. hypotonisk udfordring. Bemærk, at mens hypotonisk væske flow blev tændt ved 15 sekunder, det nåede badet efter enforsinkelse, her på 5,9 sek. (C) P-f (gennemsnit ± SE). Stjernerne angiver signifikante forskelle fra kontrol (p ≤0.05). Data fra mindst tre uafhængige forsøg for hver behandling med i alt n protoplaster (kontrol: n = 52, AtPIP2, 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en enkel og meget effektiv procedure til at måle P-f af isolerede planteprotoplaster, der gælder i princippet også for andre sfæriske celler, fx., Frøoocyter 11. Denne metode er baseret på at måle P f reaktion på en osmotisk udfordring til cellen. I modsætning til andre metoder baseret på denne fremgangsmåde er imidlertid, at ændringen af opløsninger, dvs af osmolariteten er ikke øjeblikkelig, men gradvis i løbet af en konstant bad perfusion, startende med isotonisk opløsning, hvor volumen baseline celle etableret. Hertil kommer, at denne metode ikke indebærer en suge pipette og derfor minimerer forstyrrelser protoplasterne.
Den tilgang, der præsenteres her giver målinger fra en række protoplaster fra forskellige planter eller væv. Men på grund af de involverede beregninger, kun sfæriske celler kan analyseres. Også den enzymatiske isolation af the protoplaster og osmolariteten af opløsningerne skal justeres til de analyserede celler (for eksempel den enzymatiske isolation af tomat mesophyll protoplaster tager omkring en time, hvilket er betydeligt længere end i tilfælde af Arabidopsis protoplaster).
Isoleringen af Arabidopsis mesophyll protoplaster ifølge den præsenterede protokol er enkel, hurtig og effektiv, hvilket gav et stort antal protoplaster. Især dette, kombineret med deres lave basale P f niveauer og deres høje transformationseffektivitet (figur 8), gør dem til et attraktivt system til funktionel ekspression af AQPs at muliggøre kvantitative sammenligninger af Pf induceret af forskellige AQP isoformer. Når ekspression AQPs i disse protoplaster med et markørgen (såsom GFP), kan man let screene protoplasterne i den eksperimentelle kammer fluorescerende celler at analysere.
Det er værd at undersøge, om dette system er et levedygtigt alternative for at oocytter til analyse AQPs selv fra animalske kilder (at funktionelle animalske proteiner kan udtrykkes i planteceller, er allerede påvist 17).
Brug af P-f Fit program, to flere parametre, ved siden af P-f, der er opnået for beskrivelsen af protoplast svar på hypotoniske udfordringer: forsinkelse, tiden mellem starten af volumen forandring og starten af badet perfusion og Slope PF, graden af ændring i P f i osmotiske udfordring (detaljeret beskrevet i 11).
For hver eksperimentelle datasæt lydstyrken montering procedure skal udføres flere gange, der leverer forskellige udgangspunkter (initialisering) værdier for disse parametre, til sidst vælge den pasform med den laveste fejl. Denne fejl minimering proces kan blive portrætteret som søger den dybeste dal (en "global minimum") i et landskab af dale med forskellige dybder, blandt mandy bakker og forsøger ikke blive fanget i en temmelig overfladisk dal (en "lokal minimum").
To typer af P f opnås P f i begyndelsen af hypoosmotisk hævelse respons (P f indledende «) og P f beregnes ved afslutningen af 15 sek af hævelse, regnet fra udgangen af forsinkelsen (P f endelige «). Forskellen mellem de to er beskrevet fuldt ud af Moshelion et al. 11, med hensyn til de 6 modeller analyseres.
Der er to vigtige trin i protokollen: første, en god pasform til tidsforløbet for indikatorfarvestoffet koncentration, dels en god pasform til tidsforløbet af omfanget af hævelse celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den belgiske nationale fond for Videnskabelige Forskningsråd (FNRS), Interuniversity Type polakker Program-belgisk politik for videnskab og "Communauté française de Belgique-actions de Recherches Concertées" til FC fra Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) til MM (Grant # 1311-1312), og til NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
