Summary
Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) av celler kan bidra til å forstå reguleringsmekanismene av aquaporins (AQPs). P f bestemmelse in sfæriske plantecelleprotoplaster som er presentert her omfatter protoplaster isolasjon og numerisk analyse av sin opprinnelige hastighet på volumendring som et resultat av en osmotisk utfordring under konstant bad perfusjon.
Abstract
Studerer AQP reguleringsmekanismer er avgjørende for forståelsen av vannforhold både på mobilnettet og hele plante nivåer. Presenteres her er en enkel og svært effektiv metode for bestemmelse av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) i planteprotoplaster, gjelder i prinsippet også for andre sfæriske celler som froskeoocytter. Det første trinnet av analysen er den isolering av protoplaster fra plantevevet av interesse ved enzymatisk fordøyelse inn i et kammer med et passende isotonisk oppløsning. Det andre trinnet består av en osmotisk utfordring assay: protoplaster immobilisert på bunnen av kammeret sendes til en konstant perfusjon starter med en isotonisk oppløsning og etterfulgt av en hypoton løsning. Cellen hevelse er video spilt. I det tredje trinnet, blir bildene behandlet frakoblet, hvorved volumendringer, og tidsforløpet for volumendringer er korrelert med tidsforløpet av endringen i osmolahet av kammeret perfusjon medium, ved hjelp av en kurvetilpasningsprosedyre skrevet i Matlab (den "PfFit '), for å gi P f.
Introduction
Vannopptak og strømmen over cellemembraner er en grunnleggende forutsetning for anleggs eksistens på både den cellulære og hele anlegget nivåer. På cellenivå, aquaporins (AQPs) spiller en sentral rolle i reguleringen av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) i cellemembranen 1-3.
Hittil har flere metoder vært ansatt i å måle den endogene P f av protoplast fra forskjellige plante organer (dvs. røtter, mesophyll, endodermis, etc., Anmeldt av Chaumont et al. 4). En av fremgangsmåtene for å måle P f er å eksponere de protoplaster til en osmotisk utfordring og å overvåke den første frekvensen av den volumendring (dvs.., Helningen av den tidlige lineære fase av volumendring). To forskjellige metoder ble tidligere beskrevet basert på denne fremgangsmåten, begge basert på en umiddelbar utveksling av løsninger. Den første består av immobilizing av protoplast med en suge mikropipette og svitsjing væsketilførselen 5 og den andre for overføring av protoplast fra en oppløsning til en annen ved hjelp av en mikropipette 6. Disse mikropipette sug og Mikropipette overføring metoder, som tillater image oppkjøpet helt i starten av den raske løsningen utveksling (for å fange opp tidlig lineær fase av volumendring), sannsynligvis innebære en fysisk stress til protoplaster og krever spesialisert utstyr og ekspert micromanipulation.
Metoden som beskrives her minimaliserer forstyrrelsen til cellene, innebærer ingen mikro-manipulering og tillater avledning av P f når badekaret perfusjon er ikke umiddelbar.
Etter den enzymatiske fordøyelse, proto, neddykket i en isotonisk oppløsning, blir immobilisert på dekkglass bunnen av en pleksiglass (aka Lucite eller perspex) kammeret ved charge interaksjon. Deretter, i løpet av en konstant bad perfusjonden isotonisk oppløsning spyles bort av en hypoton løsning for å generere et hypoosmotic utfordring til protoplaster. Den svelling av protoplasten er video registrert og deretter, ved å kombinere informasjonen om tidsforløpet for badekaret perfusjon og tidsforløpet av cellen svelling, er P f bestemt ved bildeprosessering, og kurvetilpasningsprosedyrer.
Fordelene ved denne metode er at forsøket er meget effektiv, dvs. det er mulig å overvåke et par celler samtidig i en enkelt analyse, og at den ikke krever spesielt utstyr eller spesielle mikromanipulasjons ferdigheter. Flere anvendelser av denne fremgangsmåte er mulig. For eksempel bestemmelse av native P f av et utvalg av celler fra forskjellige vev og planter, slik som mesophyll og bunt kappe celler fra Arabidopsis, blad 7, mais blad mesophyll eller rot-cortex-celler 8-10 eller suspensjon dyrkede celler 11,12. I additividere, er det mulig å bestemme P f av sfæriske dyreceller slik som oocytten celler 11. Et annet eksempel innebærer undersøkelse av AQP aktivitet ved forbigående uttrykk for sin genet i proto (eller noen andre gener som kan påvirke dem, for eksempel, gener kinaser) og fastsettelse av deres bidrag til P f; for eksempel uttrykk for tomat AQP SlTIP2; 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster av PEG transformasjon og besluttsomhet den SlTIP2; to-relaterte P f 13. Endelig undersøkelse av effekten på P f av forskjellige molekyler / stoffer (legemidler, hormoner, etc.) tilsatt til løsningene kan også bli undersøkt, for eksempel på den AQP blokkering HgCl 2 7.
Den følgende protokoll beskriver isolering av protoplaster fra Arabidopsis mesophyll celler og bestemmelse av deres P f.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av løsninger
- Forbered isotonisk (600 mOsm) og hypoton (500 mOsm) oppløsninger inneholdende 10 mM KCl, 1 mM CaCl 2, og 8 M 2 (N-morfolin) -ethanesulphonic syre (MES), pH 5,7 og justere osmolariteten med passende mengder D-sorbitol: 540 mm for isotonisk og 440 mm for den hypoton løsning. Verifiserings osmolariteten av løsningen (innenfor 3% av target-verdi) ved hjelp av et osmometer.
- Forbered et tørt lager av «enzymatisk blanding", som inneholder de følgende enzymer: 0,55 g cellulaseløse, 0,1 g pectolyase, 0,33 g polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (se tabell 1 nedenfor), blande det tørre pulver ved vortex, få 5,7 mg alikvoter og oppbevar ved -20 ° C.
2. Isolering av Arabidopsis mesophyll Protoplaster
- Forbered en petriskål (10 cm) med ca 6 dråper (ca. 30 mL hver) av isotonisk løsning.
- Peel abaxial (lavere) Arabidopsis blad epidermis, cUT skrelles blad i firkanter på ca 4 x 4 mm 2, deretter plassere rutene på isotonisk løsning faller med den eksponerte abaxial siden ned, berøre løsningen.
- Oppløs 5,7 mg av enzym-blanding i 165 mL isotonisk oppløsning (3,3% w / w) i et 1,5 ml rør, bland forsiktig ved å pipettere i et minutt eller så inntil oppløsning, og plassere flere like dråper av den enzymatiske løsning i det samme Petri parabolen.
- Overfør bladstykker på enzymatisk løsning synker, lukker formen forsegling av lokket med en runde med parafilm og inkuberes i 20 min, flytende fatet i et vannbad innstilt på 28 ° C.
- Legg flere flere dråper av isotonisk løsning på fatet (2 dråper pr hvert enzymløsning dråpe). Overfør hvert blad brikke til en ny isotonisk oppløsning dråpe, og deretter, i rekkefølge, til en andre dråpe (for å vaske bort den enzymatiske oppløsning). Løft brikke i kanten ved hjelp av tang, riste den i andre slipp (som en te-pose) for å frigjøre proto.Samle dråpene med protoplaster (ved hjelp av en avkuttet av 100 ul pipette) i et 1,5 ml rør.
3. Hypoton Challenge analysen: Arabidopsis mesophyll Cell Hevelse
- Klargjør perfusjon system (figur 1A), ved å fylle en kolonne med en isotonisk oppløsning og en annen kolonne med hypoton oppløsning. Åpne ventilen, la noen løsning strømmen (først hypotonisk, deretter isotonisk) for å fylle røret hele veien ned til innløpsmanifolden (figur 1B). Sørg for at det ikke er noen luftbobler, og deretter lukke ventilen.
- Forsegl et dekkglass, ved hjelp av silikonfett (tabell 1), for å gjøre en bunn for kammeret i plexiglass skyveren (figur 1B, se også skjematisk i kammeret i figur 1C). For å gjøre kammerbunnen (den oppadvendt eksponerte overflate av dekkglass i fett ring) "klebrig" for protoplaster, belegge denmed positiv-charge bærende protaminsulfat (1% i vann; tabell 1) eller poly-L-lysin (0,1% i vann, tabell 1). Spre dette "lim" over dekkglass ved hjelp av en pipette tips, vente i 1 - 2 minutter, skyll 3 - 4 ganger med isotonisk oppløsning og riste bort de resterende løsning.
- Fyll kammeret opp med isotonisk oppløsning. Deretter legger en dråpe av protoplaster inneholdende løsningen til kammeret, ved hjelp av en avkuttet av pipettespissen og vente 3 - 4 min for protoplaster å slå seg. Dekk til kammer med et gjennomsiktig deksel (Tall 1D, 1E) berøre løsningen overflaten (unngå overlapping luftbobler under).
- Plasser lysbilde (forsiktig!) På en invertert mikroskop bordet, koble den til perfusjon system og pumpen (vokter mot luftbobler i slangen!) Og slå på isotonisk løsning flyt for konstant perfusjon på 1 ml / min (raskere priser kan anvendes, opp til 4 ml / min).
- For opptakvolumendringer, er et invertert mikroskop som brukes, med et 20X objektiv og med en CCD-videokamera som er koblet til en PC. Bruk 'CMU 1394 Camera Driver' plugin av ImageJ programvare (se tabell av konkrete materialer for nedlastings adressene til disse to programvare stykker) for å spille inn en 60 sek video film av utvalgte immobile protoplaster (formodentlig, de som sitter fast til bunnen) med en hastighet på 1 image / sek (1 Hz). Start opptaket med en 15 sek vask av isotonisk oppløsning (dette utgjør grunnlinjen), bytte til hypoton løsning for 45 sek (for å fullføre et totalt 60 sek fra begynnelsen av perfusjonen). Lagre filmen i TIF format. MERK: Velg et felt syn med så mange celler som mulig, oppfylle følgende kriterier: sfæriske i form og med en godt fokusert celle kontur på sitt største omkretsen (figur 2A).
4. Analyse av Cell Volume Endre Bruke ImageJ
MERK: For å analysereserie med bilder av en hevelse celle, bruker du 'Bilde Explorer "og" Protoplast Analyzer' plugins i ImageJ programvare (skrevet av Xavier DRAYE) 14. Starter med de valgte protoplaster på deres første gang punkt, vil 'Protoplast Analyzer' plugin automatisk oppdage proto kantene (konturer) og beregne tiden løpet av sine områder under forsøket (plugins er tilgjengelig med PfFit analyseprogram, nedenfor) .
- Begynn ImageJ. Slik åpner filmen, klikker du "Fil" på ImageJ panel, da fortløpende på rullegardinmenyene som de utvikler seg: 'Import' og deretter 'Bilde Explorer'. Marker den valgte filmen, høyreklikk på den, deretter venstreklikke på "Protoplast Analyzer". Bla gjennom filmen (med en glidebryter på protoplast bilde nederst) for å identifisere protoplaster som forblir i stor grad immobile under forsøket - disse vil bli analysert. Tilbake på den første image, ved hjelp av musen, tegne sirkler (plukket fra ImageJ tegneverktøy) rundt de valgte protoplaster (figur 2B), klikk deretter på "OK" i tabellen over 'Detection parametre' som dukket opp.
- For å starte protoplast algoritme, klikk "lokal" på protoplast bilde toppanelet, deretter "Process" i rullegardinmenyen. Undersøke de grønne sirkler rundt de valgte protoplaster (figur 2C) i hele filmen. Lagre 'Resultat' i en Excel-fil. Avslutt ImageJ. MERK: I tilfelle en rød prikk vises (for å indikere en dårlig kontur passform - vanligvis på grunn av en dårlig bildekontrast), kjør med ulike parametere.
- For å separere de linjer som tilhører hver celle (som - dersom to eller flere celler ble analysert samtidig - blir sammenvevd, fordi analysen er gjort ramme for ramme), i Excel, sortere de lagrede data av celletallet kolonne ("objekt" ).
- Å Determine pixel-til-mikrometer omregningsfaktor for å få den virkelige verdien av P f, knipse et bilde av en mikrometer hersker via samme 20X mikroskop mål. Dra en linje (plukket fra ImageJ tegneverktøy) langs linjalen bilde og lese pikselnummer tilsvarer linjalen lengde ved bunnen av ImageJ hovedpanelet. Konverter vilkår pixel arealverdier i Excel-filen til mikrometer 2. Redd områdene utdanning (for hver celle separat) som en tekstfil (to kolonner av tall). MERK: Dette vil være et innspill til volumet sittende 'PfFit' program.
5. Modellering Valuta Osmolaritet Endring i Experimental Chamber Bruke ImageJ og Matlab Program P f Fit
- Tilsett 2 mg xylen cyanol (tabell 1, nedenfor) til 100 ml av en isotonisk oppløsning (for å produsere den 'Indikator Dye').
- Klargjør perfusjon system (som i 3.1) med Indicator Dye og ikke farget hypotonic løsning.
- Forsegle en dekkglass ved hjelp av silikonfett til bunnen av pleksiglass kammeret, deretter fylle forsiktig kammeret med Indicator Dye, dekke den med et dekkglass (som med proto før) og plassere den på mikroskopet scenen.
- Koble kammeret til perfusjon systemet og pumpen, og slå på Indikator Dye strømmen for en kontinuerlig perfusjon på l ml / min.
- Spill inn en 60 sek film til en kurs på 1 Hz. Start opptaket med 15 sek av Indicator Dye, bytte til hypoton løsning for 45 sek. Stoppe filmingen. Flukt med Indicator Dye (minst 30 sek), og deretter starte en ny film. Gjenta ca 5-6 ganger og lagre alle filmene
- Bruk ImageJ programvare for å analysere videobilder av Indicator Dye transmisjon for å oppnå en gjennomsnittlig tid løpet av skiftende transmisjon.
- Begynn ImageJ, klikk "Fil", da, 'Open', og bla for filmen. For hver film, tegne en 10 pixel bred vertikalrektangel hvor som helst på en st bildet av filmen. Klikk 'Bilde' på ImageJ hovedpanelet, og klikk deretter Beskjær "i rullegardinmenyen.
- Slik justerer du 60 bilder (av 60 sek film) i en rad, klikker du igjen 'Bilde', klikk deretter fortløpende i rullegardinmenyene som de utvikler seg: "Stacks" og "Make Montage '(kolonner 60, rader 1). Tegn en 1 piksel høy horisontal rektangel hvor som helst langs hele raden av bildene og klikk "Analyser" i ImageJ hovedpanelet, og klikk deretter tomten profil "i rullegardinmenyen. MERK: A 'Plot av Montage' vinduet vises (ikke vist), og en liste over transmisjon data kan åpnes fra menyen. Hvert bilde i filmen er representert på denne listen med 10 transmisjon verdier med opprinnelse i sin 10 pixel bredt rektangel og dermed "time base" (bildet sekvensielt nummer) er 10 ganger lenger.
- Kopier listene av transmisjon daten (en liste per film) til en Excel-fil. Gjennomsnittlig transmisjon tid kurs innhentet fra flere filmer av indikatoren Dye flush. Generere en sanntid base ved å multiplisere bildet sekvensielle nummeret med 0,1. Redd gjennomsnitt utdanning (to kolonner) til en tekstfil. MERK: Før gjennomsnitt, hvis ønskelig, plotte individuelle tid kurs, for å avvise eventuelle uregelmessigheter. Pass på at filmen inneholder minst fem siste sek av steady-state transmisjon av Indicator Dye.
- Start Matlab tilpasningsprogrammet P f Fit (den "Indikator Fit" panel, figur 3) for å beregne de forskjellige parametre av osmolariteten tidsforløp. MERK: basert på de kjente initielle og endelige konsentrasjoner av oppløsningen i badet, er tidsforløpet av det endrede saltkonsentrasjonen av løsningen beregnet fra konsentrasjon tidsforløp (beregnet i sin tur fra indikatoren Dye transmittans), forutsatt at den følger de samme dynamikken somfargestoff konsentrasjon. P f Fit er et program tilgjengelig for bruk gratis. The 'PfFit_Installer_web.exe "kan lastes ned fra: P f Fit Brukerhåndbok" med detaljerte forklaringer og definisjoner er tilgjengelig via Jove som supplerende fil, noe som bidrar til å bli kjent brukeren med P f Fit program.
- I "Indicator Fit 'panel, importere dataene i mellomtiden løpet av Indicator Dye transmisjon (' Indikator datafil ', figur 3A) og sett inn manuelt gjeldende parametere for eksperimentet og initiale gjetninger av parametrene' bredde 'og' t_half 'beskriver tiden løpet av indikatoren Dye konsentrasjon (Figur 3B. Klikk "Kjør" for å vise plott av tid kurs på indikatoren Dye konsentrasjon (reelle data og passform, Figur 4A), og av den modellert (kalkulert) bad osmolaritet (Figur 4B). MERK: agood tilpasning til dataene er viktig (en anbefaling: starte med de verdier som er vist i figur 3).
6. Bestemme P f hjelp av Matlab Fitting Program P f Fit
NB: I tillegg til de grunnleggende forutsetninger med hensyn til virkemåten til en protoplast som en sann og perfekt osmometer 11, bestemmelse av P f hviler på den antagelse at P f kan endre seg med tiden, at denne dynamikken i P f ligger til grunn for tiden løpet av endringen cellevolumet, og at tre parametre være tilstrekkelig å beskrive den: P fi (den opprinnelige verdien av P f), Slope Pf (frekvensen av den lineære endring av P f) og forsinkelse (tiden fra starten av badekaret osmolaritet endring til starten av cellevolumendring). Forskjellige modeller kan bli testet, inkludert forskjellige kombinasjoner av disse parametrene og deres verdier, inkludert nullverdier 11. P
- Bytt til "Volume Fit 'panel (figur 5). Velg for import områdene datafil (tekstfilen med tiden løpet av de "områder" av de analyserte protoplaster, figur 5a). Velg 'siste indikatoren Fitting' som parameter kilde (figur 5B, se 'P f Fit av brukerveiledning for alternativer). MERK: Disse parametrene (figur 5D) blir så brukt til å regenerere osmoticum endring i badet i de mengder som passer fremgangsmåten.
- I "Volume Fit 'panel (figur 5C), initial (fylle ut de første gjetninger for) P F-parameterene: P f, Slope PF og Delay (en anbefaling: start med 1, 1, og 30, henholdsvis), valgte modellen 'klasse' (en anbefaling: start med II og mark 'sjekker' for alle tre parametere som skal monteres). Klikk "Kjør", deretter øyeeple interim figuren (figur 5E) og justere Delay parameter og lengden på posten, hvis det er nødvendig.
- Undersøke resultatene grafen (figur 6) for å evaluere fit kvalitet og registrere fit feil. Endre initialisere parametrene noen fold hver, og re-'Run '. MERK: Ikke mist motet når programmet blir sittende fast - bare starte programmet på nytt!
- Gjenta denne prosedyren flere ganger, og starter med ulike kombinasjoner av initialisering parametre, sikter til den laveste verdien av passform feil.
- Kopier listen over de passer resultater direkte fra skjermen, eller finne dem i than PfFit generert '_FIT_Vol_Results.txt' fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å bestemme P f og sammenligne aktiviteten til ulike AQPs, er mesophyll protoplaster fra Arabidopsis blad brukes. Disse protoplastene ble funnet å ha lav basal (bakgrunn) P f nivåer 7 og kan tjene som en funksjonell-ekspresjonssystem for å muliggjøre reproduserbare P f-målinger.
Protoplaster fra en moden blad fra en 6 ukers gammel Arabidopsis anlegget ble isolert og tre genet konstruerer med AQP gener fra Arabidopsis (AtPIP2; 1) og mais (ZmPIP1; 2 og ZmPIP2, 4) var forbigående (og separat) uttrykkes ved hjelp av PEG transformasjon metode 15. Forutsatt at ved transformasjon er samtidig for et stort antall av plasmider anvendt for cellen uten hensyn til deres art og basert på de resultater som viste en 100% suksessrate for synkronisert transient ekspresjon av to plasmider, i en celle som tidligere rapportert for andre plantesystemer15,16, de ble ko-transformert med en vektor som koder for det forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) for å merke de transformerte protoplaster (figur 7).
For P f-analyser, ble protoplaster angitt i forsøkskammeret (figur 1B) og GFP-merket protoplaster ble overvåket ved video mens de ble spylt først med en isotonisk oppløsning (600 mOsm), deretter med hypoton oppløsning (500 mOsm) ved hjelp av perfusjon system (figur 1A).
Tids kurs av cellen volumendringer (Figur 8A) ble oppnådd for hver celle i to trinn: først, 'Bilde Explorer "og" Protoplast Analyzer' plugins ble brukt til å generere den tiden løpet av endringer i cellen kontur området (Figur 2), da, Matlab passende program P f Fit (figur 5) ble brukt til å importere these områder og konvertere dem til cellevolum. De P f-verdier (figur 8C) ble utledet for hver celle ved hjelp av P f Fit programmet (figur 5), basert på tidsforløpet av cellevolum, og, i tillegg, på den importerte gjennomsnitt tidsforløpet av transmittans endringer av Indikator Dye (figur 3), konvertert til den tiden løpet av Indicator Dye konsentrasjon endring (Figur 4A) og deretter - å tidsforløpet av badekaret osmolaritet endring (figurene 4B, 6A og 8B). Det er verdt å merke seg, at DELc, forskjellen i osmotiske konsentrasjonen i cellen (Cin) og i badekaret (Cout), ie., Pådriver for vannføring, skyldtes nesten bare til endring av Cout (figur 6A ). I dette forsøket øker P f i løpet av analysen (figur 6B).
P f f i kontrollcellen transformert med GFP alene (figur 8C).
Figur 1: volum-assay-systemet. (A) Det eksperimentelle oppsett: Perfusjonen Systemet inneholder løsnings reservoarer (infusjons kolonner, 'kolonner'), produksjonsrør (T), ventiler (V) og en peristaltisk pumpe (P) er koblet til skyve plexiglass innstilt på mikroskopbordet. HS = hypoton løsning, er isotonisk oppløsning, Cm kamera. (B) et forstørret riss av plexiglass lysbilde med den eksperimentelle kammer (CHR), og produksjonsrøret er festet via et innløp (I) manifold-kontakt. Løsningen suges fra kammeret via et utløp (Ut) til pumpen. (C) En skjematisk tegning av plexiglass sklie (mot klokken: topp utsikt, lang-side-visning og kort-side-visning): a = glassdekselstrimmel, den sentrale kammer bunnen; b = klar tape (tabell 1), som tjener som en bunn for innløp og utløp løsnings riller som fører til og fra det sentrale kammer; når Scotch tape erstattes (bare av og til), er et hull skåret i den under kammeret; c = en plexiglass blokk limt til lysbilde; D = en stikkontakt festehullet. Tall er mm (men tegningen er ikke i målestokk). (D) et forstørret riss av midtpartiet av glide med det gjennomsiktige deksel (også plexiglass) delvis dekker det sentrale kammer (piler). (E) Skjematisk tegning (topp og utsikt side) av gjennomsiktig deksel. Størrelsen på det gjennomsiktige dekselet håndtaket (grønn plast i D) er vilkårlig. Andre detaljer er som i C.
2 / 51652fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Analyse av hevelse protoplaster bilder ved hjelp av 'Protoplast Analyzer' plugin. (A) en, det første bildet av filmen med protoplaster, B, som i en, men gule sirklene indikerer valget gjort etter gjennomgang av filmen, før konturene blir funnet automatisk, c, fra den første til den siste bildet grønne sirkler tett følge konturene av de "well-artet" protoplaster som gjennomgår analyse (B). 'Time'-retters plott (med enheter av bildenummeret på abscissen) av de beregnede områder innenfor protoplast konturer ("område", i firkant piksler ), for hver sporet (og nummerert) protoplast. (C) Den parametere innspill panel av "Protoplast analysator 'plugin. Fire 'deteksjon parametre' kan justeres for å finjustere protoplast algoritme. The 'antall grense piksler 'Parameter angir minimumstykkelse på protoplast kontur (standardverdi: 5). Den "flatevekten" parameter påvirker grånivået terskelforskjell mellom det indre protoplastområdet og den ytre kant (standard: 2). The 'maksimal omkrets ratio' definerer en terskel for å utelukke protoplaster når deres form avviker fra en sirkel. Denne parameter er forholdet av protoplast omkretsen til omkretsen av en perfekt sirkel som har det samme området som den protoplast (standard: 1,05). The 'maksimal arealøkning' (% økning per tidssteg) parameter utelukker protoplaster med kontur området øker over parameterverdien (standardverdi: 5%). Endelig håndterer plugin også små protoplast bevegelser, men vil slutte å spore protoplaster som beveger seg raskt eller som forsvinner fra bildeområdet. Filmen kan kjøres på nytt så mange ganger som nødvendig, og en enkelt protoplast kan analyseres på nytt separat.com / filer / Ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: The 'Indikator Fit' panel av P f Fit program. Denne delen overs indikatoren transmisjon tid kurs inn badekar osmolaritet tidsforløpet. (A) Bla for den lagrede datafilen som inneholder den tiden løpet av transmisjon endringer av indikatoren Dye. (B) enten bruke tidligere lagret liste over variabler og parametere, eller sette inn manuelt fem variable verdier av dagens eksperiment: 'true_C_init' og 'true_C_end "(den osmolarities av den innledende badoppløsningen og P f -assay løsning perfused via badekaret),' t_start_wash'(Varigheten av baseline prøvetaking på den innledende Indicator Dye nivå),' threshold_% '(% av grunnverdi, der programmet registrerer automatisk avgang fra baseline transmisjon, 1 - 5% er vanligvis den mest effektive),' N_steady_st_pts '(antall prøver - med 10 prøver fra hver indikator Dye bilde tatt - å midles ved slutten steady state nivået av indikatoren Dye, viktig for omdannelsen av indikatorfargekonsentrasjons til osmoticum konsentrasjon) og innledende gjetninger for to av de fire parametrene av Indicator Dye transmisjon sigmoidal tid selvfølgelig, "bredde" og t halv (Omtrent knyttet til varigheten av overgangspartiet av sigmoid, og dens midtpunkt, henholdsvis; t halvparten kan være negativt!). To beste fit parametere, i tillegg til "bredde" og t halv oppnås uten behov for startverdies: lag ('flush_lag'), tiden mellom ventilåpningen til ankomsten av oppløsningen i badet, og 'C_init', uten en fysisk betydning, men er nødvendig for beskrivelse av osmolariteten tidsforløp (se Supplemental P f Fit Brukerhåndbok.
Figur 4:. Indikator Dye-konsentrasjonen i badet og osmolariteten av mediet (A) Tidsforløpet av indikatoren Dye konsentrasjon, beregnet direkte fra data (prikker), og fra den optimale parametere (linje) som det er vasket bort av en ikke farget løsning. (B) Den beregnede tidsforløp av osmolariteten endring av bad-oppløsningen, forutsatt at det følger de samme dynamikken som endringen av Indikator Dye konsentrasjon.
Figur 5:. The 'Volume Fit' panel av P f Fit program (A) Bla gjennom for området tidsforløpet datafil i det analyserte protoplast (B) Velg 'siste indikatoren Fitting alternativet for å importere eksperiment parametere fra. . siste løp gjennom "Indicator Fit '(se Supplemental P f Fit Brukerveiledning for alternativer) (C)' Model Type '/' klasse ': Klasse I inneholder den enkleste modellen 1, klasse II - modellene 2-5, klasse III - modeller 6 - 8. Modellene varierer med hensyn til hvilke parametre blir fast og som blir justert (dvs. fritt variabel.) under montering prosedyre (huke av boksen for å tillate det å variere), og hvorvidt ' SlopePf "og / eller" Delay "er null. Modusenls 1-6 diskuteres på lengden av Moshelion et al 11.. 'Kombinasjoner' lister opp de ulike parameterne diktert av valget av "Model Type '/' klasse '. Blant modeller med en lignende passform resultat - velg det enkleste! Initialisere 'P f', 'Slope Pf' ('Slope_Pf') og 'Spillet' parametere som vist (flere detaljer om Stans 'i E nedenfor). (D) De variable og parametre som beskriver tidsforløpet av badet skiftende osmoticum innmates enten manuelt, eller som beskrevet i B. (E) En midlertidig tomt, startes ved å trykke "løpe", av en tids løpet av volumendring (beregnet fra cellen konturområder) for å hjelpe til med valget av den opprinnelige verdien for Stans 'parameter. Beregn, ved eyeballing, den totale lengden av grunnlinjen fra den 1. punktet til starten av cellevolumendring (den "inkluderende forsinkelse: summen av 't-start-vask' + 'lag' / 'flush-lag "+ den" fysiologiske "' forsinkelse '). Sett denne verdien som et innspill parameter for "forsinkelse" i "VolumeFit 'panel og" Kjør "igjen (se også Supplemental P f Fit brukerhåndbok).
Figur 6: Resultatene av beslaget (A) "Bak kulissene": de beregnede ultimate tiden kurs av de osmoticum konsentrasjoner i de to kamrene:. Badekaret (Cout, grønn linje) og cellen (Cin, blå linje, Cin er beregnet basert på endringen protoplast volum og en antagelse om at plasma membranen er permeabel bare til vann - den "perfekte og sanne osmometer" 11), og tiden løpet av forskjellen mellom dem (DELc, Rød linje), som er den drivende kraft for vanngjennomstrømning, 'Eo-tLag' markerer slutten av den "flush-lag" og start av hypoton utfordringen (her bare på omtrent 21 sek). Rød boks: den feilen i tilpasningen verdi (fit-ERR, se definisjon i B nedenfor) (B) Det endelige resultatet av montering av volumet tid selvfølgelig;. Grønn boks: 'input variabler' er verdiene angitt via P f Fit / 'VolumeFit' panel (definert i figur 5A legende). Sort boks: 'Exptl-Vol' og 'montert Vol-' er de eksperimentelle data og volumet beregnet ved hjelp av den optimale parametere, henholdsvis 'Eo-tLag' er den samme som i A, 'Eo-Delay' markerer starten av volumendring. 'Areal opp 3%' markerer volumet som arealet økte med 3%, den antatte grensen til cellemembranen evne til å strekke uten sprekker. 'Pf (skalert) "er den tiden løpet av montering-based beregnet P f, som spenner over verdiene angitt nedenfor den røde boksen som "Span av P f '. Rød boks: 'UTSTYRT parametre' er verdiene for best mulig passform parametere: 'Pf i' (den første P f), 'forsinkelse' (perioden mellom utbruddet av hypoton utfordring og starten av volumendringen (som, i henhold til modellen 5 anvendt i dette eksempel, er også starten på en endring i P f-verdi), og "slope-P f '(konstant hastighet på endring i P f verdien' fit_ERR 'vist i A. - minimering målet for Matlab montering prosedyre - er "rot-middel-square" avvik (dvs. en kvadratroten av en gjennomsnittlig kvadrert avvik) på en grønn prikk fra den svarte linjen), presentert som% av baseline volum It. er ved denne verdien at den relative suksessen gjentatt montering med ulike parameter initialisering verdier er dømt. AAdvarsel: Som den optimale parameterverdier kan være et resultat av et lokalt minimum funnet i feil minimering prosedyre - for å bekrefte at en global minimum er funnet, er flere løyper nødvendig med ulike initialisering verdier for disse tre parameterne (og den laveste fit_ERR må innhentes i løpet av disse forsøkene Blå boks:. deltaer er de endringene som skjedde i slutten av den utstyrt volumendring for: 'avg Volm%' er den relative omfanget av den beregnede protoplast volumendring og "avg området% ' er den relative endring av protoplastoverflate. den opprinnelige størrelsen av cellen er gitt ved 'radius', avledet fra den midlere verdi av protoplast basal kontur området.
Figur 7: Epi-fluorescens mikros utsikt mesophyll protoplaster (A) under overført hvitt lys, og (B) ved 488 nm eksitasjon og 520 nm emisjon. Målestokk:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8:. Volumendring og ekstrahert osmotisk vanngjennomtrengelighet, P f (A) Tid løpet (60 sek) for protoplast svelling ved eksponering for hypoton utfordring (gjennomsnitt ± SE) (B) Beregnet osmoticum konsentrasjon i badet i løpet av. hypoton utfordring. Legg merke til at mens hypoton løsning flyten ble slått på 15 sek, den nådde bad bare etter enlag, her på 5,9 sek. (C) P f (gjennomsnitt ± SE). Stjernene indikerer vesentlige forskjeller fra kontroll (p ≤0.05). Data fra minst tre uavhengige eksperimenter for hver behandling med et totalt n protoplaster (kontroll: N = 52, AtPIP2, 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2; 4: N = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en enkel og meget effektiv fremgangsmåte for å måle P f av isolerte planteprotoplaster, som gjelder i prinsippet også for andre sfæriske celler, f.eks., Froskeoocytter 11. Denne metoden er basert på måling av P f i respons til en osmotisk utfordring til cellen. I motsetning til andre metoder basert på denne tilnærmingen er imidlertid endringen av løsninger, dvs. av osmolariteten, er ikke øyeblikkelig, men gradvis, i løpet av en konstant bad perfusjon, starter med isotonisk løsning, hvor referansecellevolum etablert. I tillegg vil denne fremgangsmåte ikke innebære en suge pipette og derfor minimaliserer forstyrrelsen til protoplaster.
Tilnærmingen presenteres her muliggjør målinger fra en rekke av protoplaster, fra forskjellige planter eller vev. Likevel, på grunn av de beregninger som er involvert, bare sfæriske celler kan analyseres. Også den enzymatiske isolering av the protoplaster og osmolariteten av løsningene må justeres til de analysert celler (for eksempel tar den enzymatiske isolering av tomat mesophyll protoplaster omtrent en time, vesentlig lenger enn i tilfelle av Arabidopsis protoplaster).
Isoleringen av Arabidopsis mesophyll protoplaster i henhold til den fremlagte protokoll er enkel, hurtig og effektiv, noe som gir et høyt antall protoplaster. Spesielt, kombinert med deres lave basal P f-nivåer og deres høye transformasjonseffektivitet (figur 8), og dette gjør dem til et attraktivt system for den funksjonelle ekspresjon av AQPs, for å muliggjøre kvantitative sammenligninger av P f indusert av forskjellige AQP isoformer. Ved å uttrykke AQPs i disse protoplaster med et markørgen (slik som GFP), kan man lett screene de protoplaster i forsøkskammeret for fluorescerende celler til å analysere.
Det er verdt å sjekke om dette systemet er et levedyktig alternative i oocytter for bestemmelse AQPs selv fra animalske kilder (at funksjonelle animalske proteiner kan uttrykkes i planteceller er blitt allerede vist 17).
Bruke P f Fit program, to flere parametere, ved siden av P f, oppnås for beskrivelsen av protoplast svar til hypotoniske utfordringer: forsinkelse, tiden mellom utbruddet av volumendring og starten av bad perfusjon, og Slope Pf, hastigheten av endring i P f under den osmotiske utfordring (beskrevet i detalj i 11).
For hvert eksperiment-datasett volumet montering prosedyren må utføres flere ganger, leverer ulike startverdier (klargjøring) for disse parametrene, til slutt velger den passer med lavest feil. Denne feilen minimering prosessen kunne bli fremstilt som søker den dypeste dalen (en "global minimum") i et landskap av daler med forskjellige dybder, blant manny åser, og forsøker ikke bli fanget i en heller grunn dal (en "lokal minimum").
To typer P f oppnås, P f helt i begynnelsen av hypoosmotic hevelse respons ('P f første') og P f beregnet på slutten av 15 sek av hevelse, regnet fra slutten av forsinkelsen ('P f fi nal'). Forskjellen mellom de to er omtalt fullt ut av Moshelion et al. 11, med hensyn til de 6 modeller analysert.
Det er to viktige trinnene i protokollen: for det første en god tilpasning til tidsforløpet av indikatoren Dye konsentrasjon, andre, en god tilpasning til tidsforløpet av volumet av den svellende cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det belgiske nasjonale fondet for vitenskapelig c forskning (FNRS), Interuniversity attraksjon polakker Programme-belgiske forskningspolitikk og "Communauté française de Belgique-Actions de RECHERCHES Concertées" til FC, fra Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) til MM (Grant # 1311-1312), og til NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
