Summary
מדידה מקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של תאים יכול לעזור להבין את מנגנוני הרגולציה של aquaporins (AQPs). נחישות f P בprotoplasts תא צמח הכדורי המוצג כאן כוללת בידוד protoplasts וניתוח מספרי של השיעור הראשון שלהם שינוי נפח כתוצאה מאתגר האוסמוטי במהלך זלוף אמבטיה הקבוע.
Abstract
חקר מנגנוני רגולציה AQP הוא קריטי להבנה של יחסי מים בסלולריים ורמות הצמח כולו שניהם. מוצג כאן היא שיטה פשוטה ויעילה מאוד לקביעת מקדם חדירות מים האוסמוטי (ו P) בprotoplasts צמח, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים כגון ביציות צפרדע. הצעד הראשון של assay הוא הבידוד של protoplasts מרקמות הצמח של ריבית על ידי עיכול אנזימטי לתא עם תמיסה איזוטונית מתאימה. הצעד השני מורכב מassay אתגר האוסמוטי: protoplasts המשותק בחלקו התחתון של החדר מוגשים להתחלת זלוף מתמיד עם תמיסה איזוטונית ואחריו פתרון hypotonic. נפיחות התא היא וידאו מוקלט. בשלב השלישי, התמונות מעובדות מחובר להניב שינויי נפח, וכמובן של שינויי נפח הזמן מתואם עם מהלך השינוי בosmola הזמןטוהרתו של מדיום התא זלוף, באמצעות הליך ראוי עקומה נכתב Matlab ('PfFit'), כדי להניב f P.
Introduction
ספיגת מים וזרימה על פני ממברנות תאים היא דרישה בסיסית לקיום מפעל בסלולרי ורמות הצמח כולו שניהם. ברמה התאית, aquaporins (AQPs) לשחק תפקיד מפתח בוויסות של המקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של קרום תא 1-3.
נכון להיום, כמה שיטות כבר מועסקות במדידת f P אנדוגני של protoplast מאיברי צמח שונים (כלומר שורשים, mesophyll, endodermis, וכו '., נסקרו על ידי Chaumont et al. 4). אחת הגישות למדידת f P הוא לחשוף את protoplasts לאתגר האוסמוטי ולעקוב אחר שיעוריו הראשוניים של שינוי הנפח שלה (כלומר., השיפוע של השלב ליניארי המוקדם של שינוי הנפח). שתי שיטות שונות שתוארו לעיל מבוססת על גישה זו, שניהם מבוססות על חילופי מיידיים של פתרונות. הראשון מורכב מimmobilizing protoplast עם micropipette יניקה ומיתוג זרימת פתרון 5 ושנייה אחת של העברת protoplast מפתרון אחד למשנהו באמצעות micropipette 6. שיטות אלה יניקת micropipette וmicropipette העברה, המאפשרות רכישת תמונה בתחילת מאוד של חילופי פתרון מהירים (כדי ללכוד את השלב ליניארי המוקדם של שינוי נפח), ככל הנראה כרוכות לחץ פיזי לprotoplasts ודורשות ציוד מיוחד ומיקרומניפולציה מומחה.
השיטה המתוארת כאן ממזערת ההפרעה לתאים, אינו כרוכה במיקרומניפולציה ומאפשר גזירה של f P כאשר זלוף האמבטיה אינו מיידי.
לאחר עיכול אנזימטי, protoplasts, שקוע בתמיסה איזוטונית, הם משותקים בחלקו התחתון coverslip הזכוכית של פרספקס (aka Lucite או פרספקס) תא על ידי אינטראקציה תשלום. לאחר מכן, במהלך זלוף אמבטיה קבוע,התמיסה איזוטונית הוא הסמיק משם על ידי פתרון hypotonic יצירת אתגר hypoosmotic לprotoplasts. הנפיחות של protoplast היא וידאו מוקלט ולאחר מכן, על ידי שילוב של המידע על מהלך הזמן של זלוף האמבטיה וכמובן של נפיחות תא הזמן, f P נקבעה על ידי עיבוד תמונה ונהלים מתאימים עקום.
היתרונות של שיטה זו הם שהניסוי הוא יעיל מאוד, כלומר אפשר לעקוב אחר כמה תאים בו זמנית בassay יחיד, ושהיא אינה דורשת ציוד מיוחד או כישורי מיקרומניפולציה מסוימים. מספר יישומים עבור שיטה זו הם אפשריים. לדוגמא, קביעת f P יליד מגוון של תאים מרקמות שונות וצמחים, כגון mesophyll וצרור תאי נדן מעלה ארבידופסיס 7, mesophyll עלה תירס או תאי שורש קליפת 8-10 או תאים בתרבית השעיה 11,12. בadditiב, ניתן לקבוע f P של תאי בעלי חיים כדוריים כגון תאי ביצית 11. דוגמא נוספת כרוכה בדיקה של פעילות AQP ידי ביטוי החולף של הגן שלהם בprotoplasts (או כל גנים אחרים אשר עשוי להשפיע עליהם, לדוגמה, הגנים של קינאז) ונחישות של תרומתם לf P; קשור 2-P f 13, למשל, ביטוי של עגבניות AQP SlTIP2; 2 בprotoplasts mesophyll ארבידופסיס על ידי שינוי PEG ונחישות SlTIP2. לבסוף, בחינה של ההשפעה על f P של מולקולות / חומרים שונים (תרופות, הורמונים, וכו ') הוסיפה לפתרונות יכול גם להיבחן, למשל של חוסם AQP HgCl 2 7.
הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד של protoplasts של התאים והנחישות של f P mesophyll ארבידופסיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת פתרונות
- הכן איזוטוני (600 mOsm) וhypotonic (500 mOsm) פתרונות המכילים 10 מ"מ KCl, 1 מ"מ CaCl 2, ו -8 M 2 (N-morpholine) חומצת -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 ולהתאים osmolarity עם הכמויות המתאימות של D-סורביטול: 540 מ"מ לאיזוטוני ו440 מ"מ לפתרון hypotonic. ודא osmolarity של הפתרון (במרחק של 3% מערך היעד) באמצעות osmometer.
- הכן מלאי יבש של "תערובת האנזימטית 'המכילה האנזימים הבאים: cellulase 0.55 גרם, pectolyase 0.1 גרם, 0.33 גרם polyvinylpyrrolidone 30 K, 0.33 BSA g (ראה לוח 1 להלן), לערבב את האבקה היבשה על ידי מערבולת, להפוך 5.7 aliquots מ"ג ו לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
.2 בידוד של Protoplasts mesophyll ארבידופסיס
- הכן צלחת פטרי (10 סנטימטר) עם כ 6 טיפות (כ. 30 μl כל אחת) של תמיסה איזוטונית.
- מקלפים את האפידרמיס abaxial עלה ארבידופסיס (נמוך יותר), גut העלה קלוף לריבועים של כ 4 x 4 מ"מ 2, ואז למקם את הריבועים בתמיסה איזוטונית טיפות עם צד abaxial החשוף למטה, נוגעים בפתרון.
- לפזר 5.7 מ"ג של תערובת האנזים ב165 μl תמיסה איזוטונית (.3.3% w / w) בצינור 1.5 מ"ל, מערבב בעדינות על ידי pipetting לדקה בערך עד שהיא נמסה, ומניח כמה טיפות דומות של הפתרון האנזימטית באותו פטרי מנה.
- העבר את חתיכות עלים על הפתרון האנזימטית טיפות, לסגור את צלחת איטום המכסה עם סיבוב של parafilm אחד והדגירה של 20 דקות, צף הצלחת באמבט מים מוגדר 28 ° C.
- להוסיף עוד כמה טיפות של התמיסה איזוטונית למנה (2 טיפות לכל טיפת פתרון אנזים). העבר כל פיסת עלה לירידת תמיסה איזוטונית חדשה, ולאחר מכן, ברצף, לירידה שנייה (כדי לשטוף את הפתרון האנזימטית משם). הרם את החתיכה על ידי הקצה שלה באמצעות מלקחיים, לנער אותו בירידה השנייה (כמו שקית תה) כדי לשחרר את protoplasts.לאסוף את הטיפות עם protoplasts (באמצעות קצה פיפטה 100 μl מקוטע כבוי) לתוך צינור 1.5 מ"ל.
.3 Hypotonic האתגר Assay: נפיחות סלולארי ארבידופסיס mesophyll
- הכן את מערכת זלוף (איור 1 א) על ידי מילוי עמודה אחת עם התמיסה איזוטונית ועמודה נוספת עם פתרון hypotonic. פתח את השסתום, לתת קצת זרימת פתרון (ראשון hypotonic אז איזוטוני,) כדי למלא את צינורות כל הדרך למטה לסעפת היניקה (איור 1). וודא כי אין בועות אוויר שנלכדו, ולאחר מכן לסגור את הברז.
- לאטום coverslip, באמצעות גריז סיליקון (טבלת 1), כדי להפוך את תחתית לתא בשקף פרספקס (איור 1 ב, וראה גם השרטוטים של החדר באיור 1 ג). כדי להפוך את תחתית התא (פני השטח של coverslip פונים כלפי מעלה נחשפו בתוך טבעת הגריז) "דביק" לprotoplasts, מעיילועם סולפט תשלום נושאות חיוביות protamine (1% במים; טבלת 1) או פולי-L-ליזין (0.1% במים; טבלת 1). מורחים "דבק" זה מעל coverslip באמצעות קצה פיפטה, לחכות 1 - 2 דקות, לשטוף 3 - 4 פעמים עם התמיסה איזוטונית ולנער ממנו את הפתרון שנותר.
- למלא את התא עם התמיסה איזוטונית. לאחר מכן, להוסיף טיפה של protoplasts המכיל פתרון לתא, באמצעות קצה פיפטה קצץ את ולחכות 3 - 4 דקות לprotoplasts להתיישב. כסה את החדר עם כיסוי שקוף (1D דמויות, 1E) נגיעה במשטח הפתרון (להימנע מהשמנת בועות אוויר מתחת).
- מניחים את השקף (בעדינות!) על שולחן מיקרוסקופ הפוך, לחבר אותו למערכת זלוף והמשאבה (שמירה מפני בועות אוויר בצינור!) והפעל את זרימת התמיסה איזוטונית לזלוף קבוע ב1 מ"ל / דקה (שיעורים מהר יותר ניתן להשתמש בו, עד 4 מ"ל / דקה).
- להקלטהשינויי נפח, משמש מיקרוסקופ הפוכה, עם מטרת 20X ועם מצלמת וידאו CCD מחוברת למחשב PC. השתמש בתוסף 'CMU 1,394 Driver המצלמה' של תוכנת ImageJ (ראה הטבלה של חומרים ספציפיים לכתובות ההורדה של שני חלקים אלה של תוכנה) כדי להקליט וידאו סרט 60 שניות של protoplasts הנייח הנבחר (ככל הנראה, אלה נדבקו לתחתית) בשיעור של תמונה / 1 שניות (1 הרץ). התחל הקלטה עם לשטוף 15 שניות של התמיסה איזוטונית (זה מהווה נקודת ההתחלה), לעבור לפתרון hypotonic ל45 שניות (כדי להשלים 60 שניות בסך הכל מההתחלה של זלוף). שמור את הסרט בפורמט TIF. הערה: בחר שדה תצוגה עם תאים רבים ככל האפשר, עמידה בקריטריונים הבאים: צורה כדורית ועם קווי המתאר תא ממוקדים היטב במתחם (איור 2 א) הגדול ביותר שלהם.
.4 ניתוח שינוי הנפח הנייד באמצעות ImageJ
הערה: כדי לנתחסדרה של תמונות של תא נפיחות, להשתמש ב'Explorer התמונה "והתוספים 'Protoplast Analyzer' בתוכנת ImageJ (שנכתבה על ידי חאווייר Draye) 14. החל protoplasts בחר בנקודת הזמן הראשונה שלהם, התוסף 'Protoplast Analyzer' יזהה באופן אוטומטי את קצות protoplasts (קווי המתאר) ולחשב את המסלול של האזורים שלהם הזמן במהלך הניסוי (plugins זמין עם תכנית ניתוח PfFit, להלן) .
- התחל ImageJ. כדי לפתוח את הסרט, לחץ על "קובץ" בלוח ImageJ, אז, ברציפות בתפריטים הנפתח כפי שהם נפרשים: 'יבוא' ולאחר מכן 'Explorer תמונה'. סמן את הסרט שנבחר, לחץ לחיצה ימנית ולאחר מכן עליו, לחץ על השמאל ולאחר מכן על 'Protoplast Analyzer'. חפש בסרט (באמצעות מחוון בתחתית תמונת protoplast) לזהות protoplasts שנותר במידה רבה ללא תנועה במהלך הניסוי - אלה ינותחו. חזור על ima הראשוןge, באמצעות העכבר, לצייר עיגולים (שנקטפו מכלי ציור ImageJ) סביב protoplasts נבחר (איור 2), לאחר מכן לחץ על 'אישור' בטבלה של 'פרמטרים איתור' שהופיעו.
- כדי להפעיל את אלגוריתם זיהוי protoplast, לחץ על 'מקומי' בפנל העליון תמונת protoplast, לאחר מכן 'תהליך' בתפריט הנפתח. לבחון את העיגולים הירוקים סביב protoplasts נבחר (איור 2 ג) לאורך כל הסרט. שמור את 'התוצאה' בקובץ Excel. צא ImageJ. הערה: במקרה נקודה אדומה מופיעה (כדי לציין רע בכושר גובה - בדרך כלל עקב ניגוד תמונה ירוד), הפעל מחדש עם פרמטרים שונים.
- כדי להפריד את הקווים השייכים לכל תא (אשר - אם שני תאים או יותר נותחו בו זמנית - יהיה כרוכים זה בזה, משום שהניתוח נעשה על ידי מסגרת מסגרת), באקסל, למיין את הנתונים שנשמרו על ידי העמודה מספר תאים ('אובייקט' ).
- לDetermine גורם המרת פיקסל למיקרומטר לקבלת הערך האמיתי של f P, לצלם תמונה של שליט מיקרומטר באמצעות אותה מטרת 20X מיקרוסקופ. גרור קו (שנקטף מכלי ציור ImageJ) לאורך תמונת השליט ולקרוא את המקבילה מספר הפיקסלים כדי אורך הסרגל בחלק התחתון של הפנל הראשי ImageJ. להמיר את ערכי אזור פיקסל השרירותיים בקובץ Excel למיקרומטר 2. שמור את מהלך זמן אזורים (לכל תא בנפרד) כקובץ טקסט (שתי עמודות של מספרים בלבד). הערה: זה יהיה קלט לתכנית 'PfFit' המתאים בנפח.
.5 דוגמנות ערי osmolarity השינוי בתא הניסוי באמצעות ImageJ וFit ו Matlab תכנית P
- הוסף 2 cyanol מ"ג קסילן (טבלת 1, להלן), כדי של התמיסה איזוטונית (כדי לייצר את 'מחוון דיי') 100 מ"ל.
- הכן את מערכת זלוף (כמו ב3.1) עם צבע המחוון וh הצבוע שאינופתרון ypotonic.
- לאטום להחליק את המכסה באמצעות גריז סיליקון לחלק התחתון של חדר פרספקס, אז בעדינות למלא את התא עם צבע המחוון, לכסות אותו עם תלוש לכסות (כמו עם protoplasts לפני) ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ.
- חבר את התא למערכת זלוף והמשאבה, והפעל את זרימת המחוון דיי לזלוף קבוע במ"ל / דקת l.
- להקליט סרט 60 שניות בשיעור של 1 הרץ. התחל ההקלטה עם 15 שניות של המחוון דיי, לעבור לפתרון hypotonic ל45 שניות. להפסיק לצלם. סומק עם המחוון דיי (לפחות למשך 30 שניות), ולאחר מכן להתחיל בסרט חדש. חזור על 5 - 6 פעמים ולשמור את כל הסרטים
- השתמש בתוכנת ImageJ לנתח את תמונות וידאו של העברת המחוון Dye להשיג כמובן זמן ממוצע של העברת השינוי.
- התחל ImageJ, לחץ על 'קובץ', ולאחר מכן, 'Open', ולגלוש לסרט. עבור כל סרט, לצייר רחב 10 פיקסל אנכימלבן בכל מקום על תמונת -1 בסרט. לחץ על 'תמונה' בלוח הראשי ImageJ, לאחר מכן לחץ על 'יבול' בתפריט הנפתח.
- כדי ליישר את 60 המסגרות (הסרט 60 שניות) בשורה אחת, לחץ שוב 'תמונה', לאחר מכן לחץ על רציפות בתפריטים הנפתח כפי שהם נפרשים: "סטאקס 'ו' הפוך Montage '(עמודות 60, שורות 1). לצייר מלבן אופקי גבוה פיקסל 1 בכל מקום לאורך כל השורה של תמונות ולחץ על 'ניתוח' בלוח הראשי ImageJ, לאחר מכן לחץ על 'פרופיל עלילה "בתפריט הנפתח. הערה: 'מגרש של Montage' יופיע חלון (לא מוצג), ורשימה של נתונים העברה ניתן לפתוח מהתפריט שלה. כל תמונה של הסרט מיוצגת ברשימה זו על ידי 10 ערכי העברה שמקורם בהמלבן 10 פיקסל הרחב וכתוצאה מכך "בסיס הזמן" (המספר סידורי תמונה) הוא 10 פעמים יותר.
- העתק את הרשימות של dat העברה(רשימה אחת לכל סרט) לקובץ Excel. ממוצע קורסי זמן העברה המתקבלים מכמה סרטים של חום המחוון דיי. צור בסיס בזמן אמת על ידי הכפלת מספר רציף תמונה על ידי 0.1. שמור את הקורס בממוצע זמן (שתי עמודות) לקובץ טקסט. הערה: לפני המיצוע, אם תרצה בכך, עלילה קורסי זמן הבודד, לדחות כל אי סדרים. ודא שהסרט כולל לפחות 5 שניות האחרונות של העברת מצב היציב של צבע המחוון.
- התחל Fit Matlab ההולם f P התכנית (הפנל 'מחוון Fit', איור 3) כדי לחשב את הפרמטרים השונים של קורס זמן osmolarity. הערה: על סמך הריכוזים ראשוניים וסופיים הידועים של הפתרון באמבטיה, במהלך הריכוז האוסמוטי המשתנה של הפתרון הזמן מחושבת מכמובן זמן ריכוז (מחושב, בתורו, מהעברת המחוון דיי), בהנחה שזה אחרי אותו דינמיקה כריכוז צבע. P f Fit הוא תכנית זמינה לשימוש ללא תשלום. ניתן להוריד 'PfFit_Installer_web.exe' מ: מדריך למשתמש Fit ו P 'עם הסברים והגדרות מפורטים נגיש דרך יופיטר כקובץ נוסף, אשר מסייע לקרא את המשתמש עם תכנית Fit ו P.
- בלוח המחוונים Fit ", לייבא את הנתונים של קורס הזמן הממוצע של העברת המחוון דיי (" קובץ מחוון נתונים ', איור 3 א) ולהכניס באופן ידני את הפרמטרים של הניסוי הנוכחיים וניחושים הראשוניים של' הרוחב 'הפרמטרים ו' t_half 'המתאר את מהלך ריכוז המחוון דיי (איור 3B הזמן. לחץ על' הפעלה 'כדי להציג את החלקות של הקורסים של ריכוז המחוון Dye הזמן (נתוני אמת ובכושר, איור 4 א), ושל האמבטיה הדגם (מחושבת) osmolarity (איור 4) הערה:. agכושר ood לנתונים הוא חיוני (המלצה: להתחיל עם הערכים שמוצגים באיור 3).
.6 קביעת f P באמצעות Fit f P תכנית התאמת Matlab
הערה: בנוסף להנחות הבסיסיות בכל קשור להתנהגות של protoplast כosmometer אמיתי ומושלם 11, הנחישות של f P נשענת על ההנחה כי f P עשויה להשתנות עם זמן, שזה דינמיקה של f P עומדת בבסיס הזמן במהלך שינוי נפח תא וכי שלושה פרמטרים יספיקו כדי לתאר את זה: fi P (הערך הראשוני של f P), סלופ Pf (שיעור השינוי ליניארי של f P) ועיכוב (בתקופה מההתחלה של האמבטיה שינוי osmolarity עד תחילת שינוי נפח התא). ניתן לבדוק מודלים שונים, כוללים שילובים שונים של פרמטרים אלה והערכים שלהם, ובכלל זה ערכי null 11. P
- לעבור לפנל 'נפח Fit' (איור 5). בחר ליבוא קובץ נתוני אזורים (קובץ הטקסט עם הקורס של 'האזורים' של protoplasts ניתח, איור 5 א זמן). בחר "מחוון האחרון התאמה 'כמקור הפרמטר (איור 5; לראות את' המדריך למשתמש Fit ו P 'לחלופות). הערה: פרמטרים אלו (איור 5D) משמשים לאחר מכן לחדש את שינוי osmoticum באמבטיה לכרכים הולם הליך.
- בלוח הנפח Fit '(איור 5 ג), לאתחל (למלא את הניחושים הראשוניים ל) הפרמטרים P f: f P, סלופ Pf ועיכוב (המלצה: להתחיל עם 1, 1, ו30, בהתאמה), בחר את המודל "כיתה" (המלצה: להתחיל עם II וסימן "המחאות עבור כל שלושת הפרמטרים כדי להיות מצוידות). לחץ על 'הפעלה', ואז גלגל עין דמות ביניים (איור 5E) ולהתאים את פרמטר העיכוב ואת אורכו של התקליט, במידת הצורך.
- לבחון את גרף תוצאות (איור 6) כדי להעריך את האיכות מתאימה ולרשום את השגיאה בכושר. לשנות את הפרמטרים האתחול כמה לקפל כל אחד, ומחדש'Run '. הערה: אל תתייאש כאשר התכנית נתקעה - רק להפעיל מחדש את התכנית!
- חזור על תהליך זה מספר פעמים, החל בשילובים שונים של פרמטרים אתחול, במטרה לערך הנמוך ביותר של השגיאה בכושר.
- העתק את הרשימה של התוצאות בכושר ישירות מהמסך, או למצוא אותם בtהוא PfFit שנוצר קובץ '_FIT_Vol_Results.txt'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לקבוע את f P ולהשוות את הפעילות של AQPs שונה, protoplasts mesophyll מעלה ארבידופסיס משמש. protoplasts אלה נמצאו כבעלי רמות נמוכות בסיסי (רקע) f P 7 ויכול לשמש כמערכת תפקודית ביטוי כדי לאפשר מדידות f P לשחזור.
Protoplasts מעלה בוגר מצמח ארבידופסיס הישן 6 בשבוע שהיה מבודד ושלושה גן בונה עם גני AQP מארבידופסיס (AtPIP2; 1) ותירס (ZmPIP1; 2 וZmPIP2; 4) היו זמני (ובנפרד) הביע באמצעות שינוי PEG שיטה 15. בהנחה שהמקרה של שינוי הוא בו זמנית למספר גדול של פלסמידים מוחלים על התא ללא קשר לאופי שלהם ועל סמך התוצאות שהראו שיעור הצלחה של 100% עבור מסונכרן הביטוי החולף של שני פלסמידים בתא אחד שדווח בעבר למערכות צמח אחרים15,16, הם ישתפו הפכו עם וקטור המקודד את החלבון פלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP) כדי לתייג את protoplasts הפך (איור 7).
למבחני f P, protoplasts נקבע בתא הניסוי (איור 1) וGFP שכותרתו protoplasts היה במעקב על ידי וידאו בזמן שהם היו סמוקים בתחילה עם התמיסה איזוטונית (600 mOsm), ולאחר מכן עם פתרון hypotonic (500 mOsm), שימוש במערכת זלוף (איור 1 א).
הקורסים של שינויי נפח תא (8A איור) הזמן התקבלו לכל תא בשני שלבים: ראשון, "Explorer התמונה" והתוספים 'Protoplast Analyzer' שמשו לייצור במהלך שינויים באזור קווי המתאר תא הזמן (איור 2), ולאחר מכן, Fit f P התכנית המתאים Matlab (איור 5) היה thes משמש ליבואאזורי דואר ולהמיר אותם לאמצעי אחסון נייד. ערכי f P (איור 8C) נגזרו עבור כל תא באמצעות תכנית Fit ו P (איור 5), המבוסס על הקורס של כרכי תא הזמן ו, בנוסף, במיובא כמובן הזמן הממוצע של שינויי העברה של המחוון צבע (איור 3), הוסב לקורס של שינוי ריכוז המחוון Dye הזמן (איור 4 א) ולאחר מכן - לקורס של שינוי osmolarity האמבטיה (4B דמויות, 6A ו8B) הזמן. ראוי לציין, כי delC, ההבדל בריכוזים האוסמוטי בתא (CIN) ובאמבטיה (בית המשפט), כלומר., הכוח המניע לזרם המים, נבע כמעט רק לשינוי של בית המשפט (איור 6 א ). בניסוי זה, f P עלתה במהלך assay (איור 6).
F P f P של תא השליטה הפכה עם GFP לבד (איור 8C).
אמצעי האחסון של המערכת-assay: איור 1. ההתקנה הניסיונית (): מערכת זלוף מכילה מאגרי פתרון (עמודות עירוי, "עמודות"), צינורות (ט), שסתומים (V) ומשאבת peristaltic (P) מחובר לשקופית פרספקס להגדיר על שולחן מיקרוסקופ. HS = פתרון hypotonic, הוא תמיסה איזוטונית, Cm מצלמה. (B) תצוגה מוגדלת של שקופית פרספקס עם תא הניסוי (Chr) והצינורות המחוברים באמצעות מחבר כניסה (ב) סעפת. הפתרון נשאב מהחדר באמצעות שקע (Out) למשאבה. ציור סכמטי של (C) שקופית פרספקס (נגד כיוון השעון: ראש נוף, נוף ארוך בצד ומבט קצר בצד): = כיסוי הזכוכית להחליק, תחתית התא המרכזית; b = דבק ברור (טבלת 1), המשמש כתחתית לחריצי פתרון הכניסה ויציאה המוביל אליה ומן החדר המרכזי; כאשר סקוטש מוחלף (רק מדי פעם), חור הוא לחתוך בזה מתחת לתא; C = בלוק פרספקס המודבק לשקופית; D = חור מחבר לשקע. מספרים הם מ"מ (אבל הציור הוא לא בקנה מידה). (ד ') תצוגה מוגדלת של החלק המרכזי של השקופיות עם הכיסוי השקוף (גם פרספקס) באופן חלקי המכסה את החדר המרכזי (חיצים). (E) ציור סכמטי (למעלה ונוף בצד) של הכיסוי השקוף. הגודל של הידית השקופה כיסוי (פלסטיק ירוק בD) הוא שרירותי. פרטים אחרים הם כמו בג
2 / "width =" 51652fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2: ניתוח של נפיחות תמונות protoplasts באמצעות התוסף 'Protoplast Analyzer'. (א), את התמונה הראשונה של הסרט עם protoplasts, ב, כמו ב, אבל עיגולים צהובים מצביעות על הבחירה שנעשתה לאחר שבחן את הסרט, לפני שקווי המתאר הם זוהו באופן אוטומטי, ג, מראשון ועד התמונה האחרונה את העיגולים הירוקים חוזקה בצע את קווי המתאר של protoplasts "המחונך" עובר ניתוח. (ב) 'חלקות Time'-כמובן (עם יחידות של מספר התמונה בabscissa) של האזורים מחושבים בתוך קווי המתאר protoplast (' פינת ', בפיקסלים מרובעים ), עבור כל protoplast מעקב (וממוספר). (לוח קלט הפרמטרים של התוסף 'Protoplast המנתח' ג). ארבעה 'פרמטרים זיהוי "יכולים להיות מותאמים כדי לכוונן את אלגוריתם זיהוי protoplast. "מספר הפיקסלים גבול פרמטר מגדיר את העובי המינימאלי של קווי המתאר protoplast (ערך ברירת מחדל: 5) ". הפרמטר "המשקל יחסי 'משפיע על הבדל סף רמה האפור שבין אזור protoplast הפנימי והגבול החיצוני (ברירת מחדל: 2). "יחס ההיקף המרבי 'מגדיר סף ללמעט protoplasts בכל פעם שצורתם חורגת ממעגל. פרמטר זה הוא היחס בין היקף protoplast להיקף של מעגל מושלם שיש באותו האזור כprotoplast (ברירת מחדל: 1.05). "עליית השטח המרבית '(עליית% לצעד זמן) פרמטר אינה כוללת protoplasts עם עליות אזור הגובה מעל ערך הפרמטר (ערך ברירת מחדל: 5%). לבסוף, התוסף גם מטפל בתנועות protoplast קטנות אך יפסיק מעקב protoplasts שנעים במהירות או שייעלם מהשטח התמונה. הסרט ניתן להפעיל מחדש כמה פעמים לפי צורך, וprotoplast אחד יכול להיות נתח בנפרד.קבצים / ftp_upload / 51652 51652fig2highres.jpg "target =" .com / / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הפנל 'מחוון Fit' של תכנית Fit ו P. חלק זה מתרגם את מהלך זמן העברת מחוון לקורס זמן osmolarity האמבטיה. () חפש את קובץ הנתונים שנשמר המכיל כמובן שינויי העברה של צבע מחוון הזמן. (B) או להשתמש ברשימה שנשמרה בעבר של משתנים ופרמטרים, או t_start_wash 'true_C_init' ו 'true_C_end' (osmolarities של פתרון האמבטיה הראשוני ופתרון -assay f P perfused דרך האמבטיה), ': להוסיף באופן ידני 5 ערכים משתני של הניסוי הנוכחי"(משך דגימת תחילת המחקר ברמת המחוון Dye הראשונית), 'threshold_%' (% מערך בסיסי, שבו התכנית מזהה באופן אוטומטי את היציאה מהעברת בסיס; 1 - 5% הם בדרך כלל היעילים ביותר), 'N_steady_st_pts "(מספר הדגימות - עם 10 דגימות המייצגות את כל תמונת המחוון Dye נלקחה - להיות בממוצע ברמה של המצב היציב סוף דיי המחוון, חיוני להמרה של ריכוז המחוון דיי לריכוז osmoticum) וניחושים ראשוניים לשני מארבעת הפרמטרים של קורס זמן sigmoidal העברת המחוון דיי, ומחצית t 'רוחב' (הקשורים בגסות לתקופת המעבר של חלק סיגמואיד, ונקודת האמצע שלה, בהתאמה; מחצית t יכולה להיות שלילית!). שני פרמטרים בכושר הטובים ביותר, וזאת בנוסף וחצי 'רוחב' t מתקבלים ללא הצורך בניחוש ראשוניes: פיגור ('flush_lag'), הזמן שבין פתיחת השסתום להגעתו של הפתרון באמבטיה, ו'C_init ', ללא משמעות פיזית, אך הכרחי לתיאור של מהלך זמן osmolarity (ראה P נוסף מדריך למשתמש f Fit.
איור 4:. ריכוז המחוון דיי באמבטיה וosmolarity של המדיום () במהלך ריכוז המחוון Dye הזמן, מחושב באופן ישיר מהנתונים (נקודות) ומהפרמטרים הטובים ביותר להתאמה (קו) כפי שהוא נשטף משם על ידי פתרון צבוע שאינו. כמובן הזמן המחושב של שינוי osmolarity של פתרון האמבטיה (ב '), בהנחה שהוא עוקב אחר אותו דינמיקה כשינוי של ריכוז המחוון דיי.
איור 5:. פנל 'נפח Fit' של תכנית Fit ו P (A) חפש את קובץ הנתונים כמובן זמן שטח של protoplast ניתח (ב) בחר 'המחוון האחרון Fitting' אפשרות לייבא פרמטרים ניסוי מ. . אחרון להפעיל באמצעות 'מחוון Fit' (עיין במדריך למשתמש נוסף P f Fit לחלופות) (ג) 'סוג הדגם' "כיתה" /: Class I מכיל את המודל הפשוט ביותר 1, Class II - מודלים 2 - 5, בכיתה III - מודלים 6 - 8 הדגמים שונים שלגביהם פרמטרים שקבועים ואשר הותאמו (כלומר, משתנה באופן חופשי.) במהלך ההליך ההולם (סמן את התיבה כדי לאפשר לו להשתנות), ואם לא ' SlopePf 'ו / או' עיכוב 'הוא null. המצבls 1 - 6 הם דנו באריכות על ידי et Moshelion אל 11.. 'צירופים' מפרט את אפשרויות הפרמטר מוכתבות על ידי הבחירה של 'סוג הדגם' "כיתה" /. בין דגמים עם תוצאה בכושר דומה - לבחור הפשוט ביותר! לאתחל 'ו P', 'מדרון Pf' ('Slope_Pf') והפרמטרים 'עיכוב', כפי שמוצגים (פרטים נוספים על 'עיכוב' בה 'להלן). (ד) המשתנים ופרמטרים המתארים את מהלך osmoticum האמבטיה שינוי הזמן הם קלט באופן ידני, או כפי שמתואר בB. (E) עלילת ביניים, מופעל על ידי להכות 'הפעלה', של מהלך שינוי נפח זמן (מחושב מאזורי מתאר תא) כדי לסייע בבחירה של הערך הראשוני לפרמטר 'העיכוב'. הערכה, על ידי eyeballing, האורך הכולל של קו הבסיס מst הנקודה עד תחילתו של שינוי נפח תא 1 ('עיכוב כולל: הסכום של 't-להתחיל לשטוף' + 'פיגור' / 'סומק פיגור' + 'העיכוב' "הפיזיולוגי"). הכנס ערך זה כפרמטר קלט עבור 'העיכוב' בפנל 'VolumeFit' ו 'הפעלה' שוב (ראה גם המדריך למשתמש נוסף P f Fit).
איור 6: התוצאות ראויה () "מאחורי הקלעים": הקורסים מחושבים אולטימטיבי הזמן של ריכוזי osmoticum בשני התאים:. האמבטיה (בית המשפט, קו ירוק) והתא (Cin, הקו כחול; Cin הוא מחושב על בסיס שינוי protoplast הנפח והנחה שקרום הפלזמה הוא חדיר רק למים - "osmometer המושלם והאמיתי" 11), וכמובן של ההבדל ביניהם הזמן (delC, קו אדום), המהווה את הכוח המניע לזרימת מים, 'איו-tLag' מסמן את סופה של "סומק הפיגור 'ותחילת אתגר hypotonic (כאן רק בכ 21 שניות). תיבה אדומה: השגיאה של הערך בכושר (FIT-ERR, ראה הגדרה בב 'להלן) (B) התוצאה הסופית של התאמה כמובן זמן הנפח;. קופסא ירוקה: "משתנים קלט 'הם הערכים שהוזנו באמצעות לוח f P Fit /' VolumeFit '(המוגדר באגדת איור 5 א). קופסא שחורה: "exptl-כרך 'ו' מצויד-כרך 'הם נתונים הניסיוניים והנפח מחושב באמצעות הפרמטרים מיטבית, בהתאמה,' איו-tLag 'הוא אותו הדבר כמו ב, הסימנים' איו השיהוי" תחילתו של שינוי נפח. 'פינת עד 3% "מציינת את הנפח שבשטח הפנים גדל ב -3%, הגבול המשוער ליכולת קרום תא כדי למתוח ללא פקיעת. "Pf (מוקטן) 'הוא כמובן של ההולם-ba הזמןSED מחושב f P, פורש את הערכים מצויינים מתחת לתיבה האדומה כמו 'טווח של f P'. תיבה אדום: "פרמטרים מצוידים 'הם הערכים של הפרמטרים בכושר הטובים ביותר:" Pf i' (f P הראשונית), "עיכוב" (בתקופה שבין תחילתו של אתגר hypotonic ותחילת שינוי הנפח (ש, על פי המודל 5 השתמש בדוגמא זו, גם ההתחלה בשינוי בשווי f P), ו 'f מדרון-P "(קצב הקבוע של שינוי בשווי f P' fit_ERR 'שמוצג ב. - יעד המזעור של ההליך הראוי Matlab - הוא הסטייה "שורש ממוצע מרובע" (כלומר, שורש הריבועי של ממוצע סטייה בריבוע) של נקודה ירוקה מהקו השחור), מוצגת כ% מבסיס הנפח זה. הוא על ידי ערך זה שההצלחה היחסית של הולם חוזרים ונשנים עם ערכי אתחול פרמטר שונים נשפטת.הערה אזהרה: כערכי פרמטרים הטובים ביותר בכושר יכולים להיות התוצאה של מינימום מקומי שנמצא בהליך מזעור שגיאה - כדי לוודא שמינימום גלובלי כבר נמצא, כמה ריצות נדרשות עם ערכי אתחול שונים עבור שלושת הפרמטרים הללו (ו fit_ERR הנמוך ביותר יש לחפש במהלך ניסיונות אלו תיבה כחולה:. דלתא הן השינויים שחלו בסוף תקופת שינוי הנפח המצויד: '% ממוצע VOLm' היא המידה היחסית של שינוי protoplast הנפח מחושב ו'פינת% ממוצע " הוא השינוי היחסי של שטח הפנים protoplast. הגודל ההתחלתי של התא ניתן על ידי 'רדיוס', הנגזר מהערך הממוצע של אזור קווי המתאר הבסיסי protoplast.
מבט מיקרוסקופי Epi-הקרינה של protoplasts mesophyll: איור 7 () תחת אור לבן משודר ו( ב ') ב488 עירור ננומטר ו520 פליטת ננומטר. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8:. שינוי נפח וחדירות מים האוסמוטי שחולצו, f P כמובן () זמן (60 שניות) של protoplast נפיחות בחשיפה לאתגר hypotonic ריכוז osmoticum מחושב באמבטיה ב( ממוצע ± SE) (ב). אתגר hypotonic. שימו לב כי בעת זרימת פתרון hypotonic הופעלה ב15 שניות, שהגיע לאמבטיה רק לאחרפיגור, כאן של 5.9 שניות. f (C) P (ממוצע ± SE). כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מביקורת (p ≤0.05). נתונים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים עבור כל טיפול עם סך של protoplasts n (שליטה: n = 52, AtPIP2; 1: n = 13, ZmPIP1; 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתואר כאן הוא תהליך פשוט ויעיל מאוד למדידת f P של protoplasts מפעל המבודד, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים, למשל., ביציות צפרדע 11. שיטה זו מבוססת על מדידת f P בתגובה לאתגר האוסמוטי לתא. בניגוד לשיטות האחרות המבוססות על גישה זו, עם זאת, השינוי של פתרונות, כלומר, של osmolarity, אינו מיידי, אלא הדרגתי, במהלך זלוף אמבטיה קבוע, החל מהתמיסה איזוטונית, שבו תא בסיס הנפח הוקם. בנוסף, שיטה זו אינה כרוכה בפיפטה יניקה ולכן ממזערת את ההפרעה לprotoplasts.
הגישה המוצגת כאן מאפשרת מדידות ממגוון רחב של protoplasts, מצמחים או רקמות שונים. ובכל זאת, בגלל החישובים המעורבים, ניתן לנתח תאים כדוריים בלבד. כמו כן, הבידוד האנזימטית של הprotoplasts הדואר וosmolarity של הפתרונות צריכים להיות מותאמים לתאי assayed (למשל, הבידוד האנזימטית של protoplasts mesophyll עגבניות לוקח בערך שעה, במידה ניכרת יותר מאשר במקרה של protoplasts ארבידופסיס).
הבידוד של protoplasts mesophyll ארבידופסיס על פי הפרוטוקול המוצג הנו פשוט, מהיר ויעיל, מניב מספר גבוה של protoplasts. יש לציין, זו, בשילוב עם הרמות הנמוכה שלהם בסל f P ויעילות השינוי הגבוה שלהם (איור 8), הופכת אותם למערכת אטרקטיבית לביטוי התפקודי של AQPs, כדי לאפשר השוואות כמותיות של f P הנגרמת על ידי isoforms AQP שונה. כאשר מביע AQPs בprotoplasts אלה עם גן סמן (כגון GFP), אפשר בקלות לסנן protoplasts בתא הניסוי לfluorescing תאים לנתח.
כדאי לבדוק אם מערכת זו היא alternativ קיימאדואר לביציות למנסים לאמוד AQPs אפילו ממקורות של בעלי חיים (יכולים לבוא לידי ביטוי, כי חלבונים מן החי פונקציונליים בתאי צמח הוכח כבר 17).
באמצעות תכנית Fit f P, שני פרמטרים יותר, ליד f P, מתקבלים לתיאור של תגובות protoplast לאתגרי hypotonic: עיכוב, הזמן שבין תחילתו של שינוי בנפח ובתחילת זלוף אמבטיה, ומדרון Pf, שיעור השינוי בf P במהלך האתגר האוסמוטי (שתואר בפירוט ב11).
לכל נתוני ניסוי להגדיר את ההליך הראוי הנפח צריכה להתבצע מספר פעמים, אספקת ערכים שונים החל (אתחול) עבור פרמטרים אלו, סופו של דבר בחירה בכושר עם השגיאה הנמוכה ביותר. תהליך מזעור שגיאה זו יכול להצטייר כמחפש העמק העמוק ביותר ("מינימום גלובלי") בנוף של עמקים עם עומקים שונים, בין גברגבעות y, ומנסים לא להיתפס בעמק רדוד למדי ("מינימום מקומי").
שני סוגים של f P מתקבלים, f P בתחילת hypoosmotic מאוד נפיחות תגובה ("P f הראשונית") וP f מחושבת בסוף 15 שניות של נפיחות, לספור מהסוף העיכוב ("fi P f סופי"). ההבדל בין שני נדון באופן מלא על ידי אל Moshelion et. 11, בכל קשורים למודלים 6 ניתחו.
ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול: ראשון, בכושר טוב לקורס של ריכוז המחוון דיי, שני, בכושר טוב לקורס של נפח תא נפיחות הזמן הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית הבלגית לfi המדעי ג המחקר (FNRS), האטרקציה הבינאוניברסיטאי הפולנים תכנית הבלגית המדע ומדיניות "Communauté Française דה Belgique-Actions דה Recherches Concertées" לFC, מהקרן הלאומית למדע בירושלים ( ISF) לMM (גרנט # 1311-1312), ולNM (גרנט # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
