Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/51652
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1The RH Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, The Hebrew University of Jerusalem, 2Earth and Life Institute, Université catholique de Louvain, 3Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain

Summary

Измерение осмотического коэффициента водопроницаемости (P F) клеток может помочь понять механизмы регулирования аквапоринов (AQPs). Р определение F в сферических протопластов клеток растений, представленных здесь, включает в себя изоляцию протопластов и численный анализ их начальной скорости изменения объема в результате осмотического вызов во время постоянной ванны перфузии.

Abstract

Изучение механизмов регулирования Aqp имеет решающее значение для понимания водных отношений в оба сотовой и целых уровней растений. Представленные здесь является простым и очень эффективным способом для определения осмотического коэффициента проницаемости воды (Р F) в протопластов растений, в принципе применимо и к другим сферических клеток, таких как лягушки ооцитов. На первом этапе анализа является выделение протопластов из растительной ткани интереса ферментативным расщеплением в камеру с соответствующим изотонического раствора. Второй этап состоит из осмотической вызов теста: протопласты иммобилизованные на дне камеры представляются постоянной перфузии, начиная с изотоническим раствором, а затем гипотонического раствора. Ячейка опухоль видеозаписи. На третьем этапе, изображения обрабатываются сообщение с получением изменения объема, и временной ход изменения объема коррелирует с течением времени изменения osmolaпасности камеры перфузии среды, используя кривую процедуру подгонки написанный на Matlab ('PfFit'), чтобы получить Рр.

Introduction

Поглощение воды и поток через клеточные мембраны является фундаментальным требованием для существования растений на клеточном и целых уровней растений. На клеточном уровне, аквапорины (AQPs) играют ключевую роль в регуляции осмотического коэффициента проницаемости воды (Р е) клеточной мембраны 1-3.

На сегодняшний день, несколько методов были использованы при измерении эндогенного Рр протопластовой из разных органов растений (т.е. корни, мезофилл, эндодерме, и т.д.., Отзывы на Шомон и др. 4). Один из подходов для измерения Рр является разоблачить протопластов в осмотического вызов и контролировать начальную скорость изменения объема (т.е.., Наклон начале линейной фазы изменения объема). Два различных метода были описаны ранее на основе этого подхода, как на основе мгновенного обмена решений. Первый состоит из immobilizчисле протопласта с всасывающим микропипетки и переключение поток раствора 5 и вторую передачи протопласта из одного раствора в другой с помощью микропипетки 6. Эти всасывающие микропипетка и микропипетка методы передача, которые позволяют захвата изображений в самом начале быстрого обмена раствора (захватить раннее линейную фазу изменения объема), вероятно, будут связаны физический стресс к протопластов и требуют специального оборудования и экспертных микроманипуляция.

Метод, описанный здесь минимизирует помехи для клеток, не влечет за микроманипуляция и позволяет вывод P F, когда ванна перфузии не мгновенно.

После ферментативного расщепления, протопласты, погруженные в изотоническом растворе, иммобилизуют на покровное стекло нижней части пластика (иначе Lucite или плексигласа) камеры путем взаимодействия заряда. Затем, в ходе постоянным ванны перфузии,изотонический раствор смывается с помощью гипотонического раствора, генерирующего гипоосмотическими вызов протопластов. Отек протопласта является видеозаписи, а затем, путем объединения информации о времени ход ванны перфузии и времени ход клеточного отека, P F определяется обработки изображений и аппроксимации кривой процедур.

Преимущества этого метода является то, что этот эксперимент не очень эффективным, т.е. можно контролировать несколько клеток одновременно в одном анализе, и что он не требует специального оборудования или особых навыков микроманипуляция. Несколько приложений для этого метода возможны. Например, определение родной P F разнообразных клетках из различных тканей и растений, таких как мезофилла и обкладки сосудисто-клеток из Arabidopsis листа 7, кукурузный мезофилла листа или корневых клетках коры 8-10 или суспензионных культурах клеток 11,12. В дополнительна, можно определить P F сферических клеток животных, таких как клетки ооцитов 11. Другой пример включает экспертизу AQP деятельности по временной экспрессии их генов в протопластов (или любых других генов, которые могут повлиять на них, например: гены киназ) и определение их вклада в P F; Например, экспрессия томатного AQP SlTIP2, 2 Arabidopsis в мезофильных протопластов путем трансформации ПЭГ и определения SlTIP2, 2, связанных с P F 13. Наконец, исследование влияния на P F различных молекул / веществ (наркотики, гормонов и т.д.) добавлен в растворах также могут быть рассмотрены, например в AQP блокатора HgCl 2 7.

Следующий протокол описывает выделение протопластов Arabidopsis мезофильных клетках и определение их P F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Получение Решения

  1. Подготовьте изотонический (600 мОсм) и гипотонический (500 мОсм) растворы, содержащие 10 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2, и 8 М 2-(N-морфолин) -ethanesulphonic кислоты (MES), рН 5,7 и регулировать осмотическое давление с соответствующими количествами D-сорбит: 540 мм изотонический и 440 мм для гипотонического раствора. Убедитесь, осмолярность раствора (в пределах 3% от заданного значения), используя осмометр.
  2. Подготовка сухой запас 'ферментативной смеси ", содержащей следующие ферменты: 0,55 г целлюлазы, 0,1 г pectolyase, 0,33 г поливинилпирролидона К-30, 0,33 г БСА (смотрите таблицу 1 ниже), смешать сухой порошок с помощью вихря, чтобы 5,7 мг аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.

2 Выделение Arabidopsis мезофильных протопластов

  1. Приготовьте чашку Петри (10 см) с примерно 6 капель (примерно. 30 мкл каждая) изотонический раствор.
  2. Пил абаксиальной (ниже) Arabidopsis эпидермиса листа, сут очищенный лист на квадраты примерно 4 х 4 мм 2, а затем поместить квадраты на изотоническом растворе падает с открытой абаксиальной стороной вниз, касаясь решения.
  3. Растворите 5,7 мг ферментной смеси в 165 мкл изотонический раствор (3,3% м / м) в 1,5 мл пробирку, осторожно перемешать с помощью пипетки в течение минуты или так до полного растворения, и поместите несколько подобных капель ферментативной решения в том же Петри блюдо.
  4. Передача этих кусочков листа на ферментативного раствора капель, закрыть тарелку уплотнительную крышку с одного раунда парафином и инкубируют в течение 20 мин, плавающие блюдо в водяной бане до 28 ° С.
  5. Добавить еще несколько капель изотонического раствора к блюду (2 капли на каждый фермента капли раствора). Передача каждый кусок листа к новому капли изотонического раствора, а затем, последовательно, на второй капли (мыть ферментативной решение км). Поднимите кусок за края с помощью щипцов, встряхните его во втором капли (например, чай в пакетиках), чтобы освободить протопластов.Соберите капли с протопластов (с использованием усекается пипетки 100 мкл) в 1,5 мл пробирку.

3 Гипотоническая Вызов Анализ: Сотовый Отек Arabidopsis Мезофилл

  1. Подготовьте перфузии системы (Рисунок 1А), заполнив одну колонку с изотонический раствор и другую колонку с гипотонического раствора. Откройте клапан, пусть некоторое потока раствора (первая гипотоническая, то изотонический) для заполнения трубки весь путь до впускного коллектора (Рисунок 1В). Убедитесь, что нет не осталось воздуха, а затем закрыть клапан.
  2. Печать покровное, используя силиконовую смазку (таблица 1), чтобы сделать дно для камеры в пределах плексигласа слайде (Рисунок 1В; см также схемные решения камере в фиг.1С). Чтобы сделать прострел низом (восходящий обращенную открытую поверхность покровного стекла в смазки кольца) "липкий" для протопластах, пальто этос положительным зарядом подшипника протаминсульфата (1% в воде, в таблице 1) или поли-L-лизин (0,1% в воде, в таблице 1). Выкладываю этот 'клей' над покровного стекла с помощью пипетки, подождите 1 - 2 мин, промыть 3 - 4 раза с изотонический раствор и встряхните далеко оставшийся раствор.
  3. Заполните камеру еще с изотонический раствор. Затем добавьте каплю протопластов, содержащих решение камере, используя обрезаны пипетки и ждать 3 - 4 мин для протопласты урегулировать. Накройте камеру с прозрачной крышкой (Цифры 1D, 1E) касается поверхности раствора (во избежание захвата воздушных пузырьков под).
  4. Поместите слайд (мягко!) На перевернутом столе микроскопа, подключите его к системе перфузии и насосом (защищая от пузырьков воздуха в трубке!) И включите изотонический потока раствора для постоянной перфузии в 1 мл / мин (более быстрыми темпами может быть использован, до 4 мл / мин).
  5. Для записиГромкость меняется, инвертированный микроскоп используется, с целью 20X и с CCD видеокамеры, подключенной к ПК. Используйте 'КМУ 1394 Camera Driver' плагин программного обеспечения ImageJ (смотри таблицу конкретных материалов для загрузки адреса этих двух программных частей), чтобы записать 60 сек видео фильм выбранных неподвижных протопластов (предположительно, те, застрял на дно) в размере 1 кадр / сек (1 Гц). Начните запись с 15 сек стирки в изотонический раствор (это являются базовыми), переключитесь на гипотонического раствора в течение 45 с (для завершения всего 60 сек от начала перфузии). Сохраните фильм в формате TIF. ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите поле зрения с таким количеством клеток, как это возможно, соответствует следующим критериям: сферическую форму и с целенаправленной контура клеток по их величине периметра (рисунок 2А).

4 Анализ сотового Volume изменение через ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализаСерия изображений набухания клетки, используйте 'Image Explorer' и плагины "протопластов анализатора 'в программном обеспечении ImageJ (письменного Ксавье Draye) 14. Начиная с выбранными протопластов на их первом момент времени, плагин в 'протопластов Analyzer' автоматически обнаружит протопласты края (контуры) и рассчитать временной ход своих областях в ходе эксперимента (плагины доступны с программой анализа PfFit, ниже) .

  1. Начните ImageJ. Чтобы открыть фильм, нажмите "Файл" на панели ImageJ, то, последовательно на выпадающих меню, как они разворачиваются: "Импорт" затем "Проводник изображения '. Выделите выбранный фильм, а затем щелкните правой кнопкой мыши на нем, то щелкните левой кнопкой мыши на "протопластов Analyzer". Просмотрите фильма (с помощью ползунка в протопластов изображения дна), чтобы определить протопластов, которые остаются в значительной степени неподвижна во время эксперимента - они будут проанализированы. Вернуться в начало IMAGE, с помощью мыши, рисовать круги (определена из инструментов ImageJ рисования) вокруг выбранных протопластов (Рисунок 2B), затем нажмите «OK» в таблице «параметры обнаружения", которые появились.
  2. Для запуска алгоритма обнаружения протопластов, нажмите 'Часовой' на протопластов изображения верхней панели, то "процесс" в выпадающем меню. Изучите зеленые круги вокруг выбранных протопластов (Рисунок 2C) на протяжении всего фильма. Сохраните 'Результат' в файле Excel. Выйти ImageJ. ПРИМЕЧАНИЕ: В случае появляется красная точка (указать плохой контура Fit - обычно за счет плохого контраста изображения), повторно с различными параметрами.
  3. Для разделения линии, принадлежащие каждой ячейки (которая - если два или более клетки анализировали одновременно - будет переплетаются, потому что анализ делается кадр за кадром), в Excel, отсортировать сохраненные данные по колонке числа клеток ('объекта' ).
  4. Для Determine коэффициент преобразования пиксель в мкм для получения реальной стоимости P F, оснастки образ микрометра правителя через тот же 20X объектива микроскопа. Перетащите линию (определена из инструментов ImageJ рисования) вдоль линейки изображения и читать числа пикселей, эквивалентную длине линейки в нижней части главной панели ImageJ. Преобразование произвольные значения площади пикселя в файле Excel в мкм 2. Сохраните области временной ход (для каждой ячейки в отдельности) в виде текстового файла (две колонки только из цифр). ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет вход программе громкости облегающие 'PfFit'.

5 Моделирование Оценить осмолярности изменении в экспериментальной камере, используя ImageJ и ф Fit Matlab Программа P

  1. Добавить 2 мг ксилолцианола (Таблица 1, ниже) к 100 мл изотонического раствора (для получения 'индикаторный краситель').
  2. Подготовьте перфузии системы (как в 3.1) с индикаторный краситель и, не окрашенных чypotonic решение.
  3. Печать покровное используя силиконовую смазку на дне камеры пластика, затем аккуратно заполнить камеру с индикаторный краситель, накройте его покровным (как с протопластов до) и поместите его на столик микроскопа.
  4. Подключите камеру к системе перфузии и насосом, и включите потока индикаторный краситель для постоянной перфузии в л мл / мин.
  5. Запись 60 сек фильм в размере 1 Гц. Начните запись с 15 сек от индикаторный краситель, переключиться на гипотонического раствора в течение 45 сек. Стоп съемок. Промывать индикаторный краситель (по крайней мере, в течение 30 сек), затем начать новый фильм. Повторите около 5 - 6 раз и сохранить все фильмы
  6. С помощью программного обеспечения ImageJ анализировать видеоизображение от пропускания индикаторный краситель, чтобы получить усредненный временной ход изменяющейся прозрачностью.
    1. Начните ImageJ, нажмите "Файл", затем, «Открыть», и перейдите к фильму. Для каждого фильма, рисовать в 10 пиксель по вертикалипрямоугольник в любом месте на 1-м изображением фильма. Нажмите 'Image' на главной панели ImageJ, затем нажмите кнопку 'Crop' в выпадающем меню.
    2. Для выравнивания 60 кадров (на 60 сек фильма) в один ряд, нажмите еще раз 'Image', а затем нажмите последовательно в выпадающих меню, как они разворачиваются: 'Штабеля »и« Сделать Montage »(колонки 60, строки 1). Нарисуйте 1 пиксель высокий горизонтальный прямоугольник в любом месте вдоль всей строки изображений и нажмите 'Анализ' на главной панели ImageJ, затем нажмите кнопку 'участок профиля' в выпадающем меню. ПРИМЕЧАНИЕ: 'Земельный Montage' окно появится (не показано), а также список данных пропускания может быть открыт из его меню. Каждое изображение фильма представлена ​​в этом списке на 10 значений пропускания, происходящих в его 10 пикселя широкого прямоугольника и, следовательно, "временной базы" (образ порядковый номер) в 10 раз больше.
    3. Скопируйте списки из пропускания DAT(один список за кино) в файл Excel. Среднее значение на курсы времени пропускания, полученные из нескольких фильмов на приливы индикаторный краситель. Создайте в режиме реального времени базы путем умножения изображения порядковый номер по 0,1. Сохранить усредненный временной ход (две колонки) в текстовый файл. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед усреднения, при желании, построить отдельные программы обучения, чтобы отвергать любые неровности. Убедитесь, что фильм содержит по меньшей мере 5 окончательное сек стационарных пропускания индикаторный краситель.
  7. Запустите Matlab фитинг программа P F Fit (панели индикаторная Fit ', рисунок 3) для вычисления различных параметров времени осмолярность конечно. ПРИМЕЧАНИЕ: на основе известных начальных и конечных концентрациях раствора в ванне, время курс меняющейся осмотического концентрации раствора рассчитывается по времени концентрация конечно (рассчитывается, в свою очередь, от пропускания индикаторный краситель), предполагая его следует тем же динамику, что иконцентрация красителя. P е Fit это программа доступна для использования бесплатно. 'PfFit_Installer_web.exe' можно скачать с: P ф руководстве Fit пользователя "с подробными объяснениями и определений доступен через Юпитера в качестве дополнительного файла, который помогает ознакомить пользователя с P ф Fit программы.
  8. В панели "Indicator Fit ', импортировать данные из среднего времени ходе индикаторный краситель пропускания (' Индикатор файла данных ', 3А) и вставить вручную текущие параметры эксперимента и начальные предположения параметров" ширина "и" t_half 'описания временной ход концентрации индикаторный краситель (фиг.3Б. Нажмите' Run 'для просмотра графики временных курсах концентрации индикаторный краситель (реальные данные и нужным, рис 4а), и моделируемой (расчетный) ванны осмолярность (4В) ПРИМЕЧАНИЕ:. AGООД подходят к данным является существенным (рекомендация: начать с значений, показанных на рисунке 3).

6 Определение Рр, используя Matlab Место Program P F Fit

ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к основным предположениям в отношении поведения протопласта как истинной и совершенной осмометра 11, определение P F опирается на предположении, что P F может меняться со временем, что это динамика P F лежит в основе время Конечно изменения объема ячейки и что три параметра достаточно, чтобы описать его: P Fi (начальное значение P F), Slope ПФ (скорость линейного изменения P F) и Delay (период от начала ванне изменение осмолярности до начала смены сотовой ячейки объема). Различные модели могут быть проверены, в том числе различных комбинаций этих параметров и их значений, включая значения нулевых 11. P 11, рассчитанного, в свою очередь, от импортной серии клеток-контурных областей (см Также Справочная 'P F Руководство Fit пользователя).

  1. Переключитесь на "Volume Fit" панели (рисунок 5). Выберите для импорта файл данных районах (текстовый файл с временной ходе «зон», анализируемых протопластов, рис 5А). Выберите 'Последний показатель Место' в качестве источника параметра (Рисунок 5Б; увидеть 'Р F Руководство Fit пользователя альтернатив). ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры (Рисунок 5D) затем используется для регенерации изменение осмотического агента в ванне для объемов, установленных процедуру.
  2. В 'Объем Fit "панели (Рисунок 5C), инициализации (заполнить начальных догадок для) в P параметров F: P F, Slope пФ и задержки (рекомендация: начать с 1, 1 и 30, соответственно), выбрал модель 'класса' (рекомендация: начать с II и марки для установки 'проверяет' для всех трех параметров). Нажмите 'Run', то глазное яблоко промежуточный показатель (Рисунок 5E) и отрегулировать параметр задержки и длину записи, если это необходимо.
  3. Изучите график результатов (рисунок 6) оценить подходят качество и запишите подходят ошибку. Изменение инициализации параметров некоторые складывают друг и повторно'Run '. ПРИМЕЧАНИЕ: Не расстраивайтесь, когда программа застревает - просто перезапустить программу!
  4. Повторите эту процедуру несколько раз, начиная с различными комбинациями параметров инициализации, стремясь к самой низкой стоимости подходят ошибки.
  5. Скопируйте список пригодных результатов непосредственно с экрана, или найти их в тон PfFit генерируемые файл '_FIT_Vol_Results.txt'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы определить Рр и сравнить деятельность разных AQPs, мезофильные протопласты от Arabidopsis листа используются. Эти протопласты были обнаружены низкие базальные (фон) уровни P F 7 и может служить в качестве системы функционально-выражения для того, чтобы воспроизводимых измерений P F.

Протопласты от зрелого листа от 6-недельного старый Arabidopsis завода были выделены и три генных конструкций с Aqp генов от Arabidopsis (AtPIP2; 1) и кукурузы (ZmPIP1; 2 и ZmPIP2; 4) были временно (и отдельно) выражается с помощью преобразования ПЭГ Метод 15. Если предположить, что событием является одновременное преобразование для большого количества плазмид, приложенных к клетке независимо от их природы и на основе результатов, которые показали, на 100% успеха для синхронизированы переменной экспрессии двух плазмид в одной ячейке сообщалось ранее для других систем растений15,16, они совместно трансформируют вектором, кодирующим расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) для маркировки преобразованные протопластов (рисунок 7).

Для Р F анализов, протопласты были установлены в экспериментальной камере (Фиг.1В) и GFP помечены протопластов контролировали с помощью видео в то время как они были первоначально продувают с изотоническим раствором (600 мОсм), а затем с гипотонического раствора (500 мОсм), с помощью перфузии системы (Рисунок 1A).

Временные курсы изменения объема клеток (рис 8а) были получены для каждой ячейки в два этапа: первый, в 'Image Explorer »и плагины' протопластов Analyzer были использованы для создания временной ход изменений в области контура клеток (рис 2), то, Matlab Место программа Р F размеру (фиг.5) был использован для импорта ыее области и конвертировать их в объемах клеток. Значения P F (Рисунок 8C) были получены для каждой ячейки, используя P F Fit программу (Рисунок 5), в зависимости от времени, конечно объемов клеток и, кроме того, на импортной усредненного времени ходе пропускания изменений индикатора Краситель (фиг.3), преобразуются во временную ходе изменения концентрации индикаторный краситель (4А), а затем - в течение времени изменения ванны осмолярности (Фигуры 4B, 6А и 8В). Стоит отметить,, что ДЕЛК, разница в осмотических концентраций в клетке (Cin) и в бане (COUT), т.е.., Движущей силой для притока воды, было связано почти исключительно с изменением Cout (фиг.6А ). В этом эксперименте, Р F увеличена в ходе анализа (фиг.6В).

P F F контрольной клетке, трансформированной только GFP (рисунок 8C).

Рисунок 1
Рисунок 1: Система объемного анализа. (А) Экспериментальная установка: Система перфузии содержит резервуары раствор (столбцы инфузионные, 'Cols'), трубы (Т), клапаны (V) и перистальтический насос (Р), соединенный с плексигласа ползуна, установленного на столе микроскопа. HS = гипотонического раствора, изотонический раствор, Cm камеры. (Б) увеличенный вид плексигласа слайд с экспериментальной камере (CHR) и трубки, присоединенные через разъем коллектора на входе (В). Решение всасывается из камеры через выходное отверстие (Out) к насосу. (C) схематический чертеж слайд оргстекло (против часовой стрелки: вид сверху, вид длинной стороны и вид короткой стороны): = стеклянная крышка скольжения, центральный нижнюю камеру; B = клейкой ленты (таблица 1), служащий в качестве нижней части для впускных и выпускных раствора канавок, ведущих к и из центральной камеры; когда скотч заменяется (лишь изредка), отверстие сокращено в нем под камеры; C = A плексигласа блок приклеенную к слайду; D = разъем розетка отверстие. Числа мм (но рисунок не в масштабе). (D), вид в увеличенном масштабе центральной части ползуна с прозрачной крышкой (также плексигласа) частично охватывает центральную камеру (стрелки). (Е) Схематическое изображение (сверху и вид сбоку) из прозрачной крышкой. Размер прозрачной ручкой крышки (зеленый пластиковый в D) является произвольным. Другие детали как в C.

2 / 51652fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 2: Анализ отек протопластов изображения с помощью плагина в 'протопластов анализатора'. (A), первое изображение фильма с протопластов, б, как в, но желтые круги указывают выбор, сделанный после анализа фильма, до того, как контуры определяются автоматически, с, от первого до последнего изображения зеленые кружки плотно следуют контуры "ведет себя хорошо" протопластов, проходящих анализ. (B) 'Time' блюд участков (с единиц числа изображений на оси абсцисс) рассчитанных районах, находящихся в протопластных контуров ("Площадь", в квадратных пикселей ), для каждого отслеживаются (и пронумерованы) протопласта. (C) параметры панели ввода плагина в 'протопластов анализатора'. Четыре 'параметры обнаружения' можно регулировать для точной настройки протопластов алгоритма обнаружения. 'Количество пограничных пикселей 'Параметр устанавливает минимальную толщину контура протопластов (значение по умолчанию: 5). Параметр «удельный вес» влияет на разницу серый порогового уровня между внутренней области протопластов и внешней границе (по умолчанию: 2). 'Максимальный коэффициент окружность' определяет порог для исключения протопластов, когда их форма отклоняется от окружности. Этот параметр представляет собой отношение длины окружности к протопластов окружности идеальной окружности, имеющей ту же площадь, что и протопласта (по умолчанию: 1.05). 'Максимальное увеличение площадь' (% увеличение за такт) параметра исключает протопластов с увеличением площади контура выше значения параметра (по умолчанию: 5%). Наконец, плагин также обрабатывает небольшие движения протопластов но остановит отслеживания протопластов, что быстро двигаться или которые исчезают из области изображения. Фильм можно повторно неограниченное количество раз, сколько необходимо, и один протопластов может быть переосмыслены отдельно.com / файлы / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: панель индикаторная Fit 'из Р ф Fit программы. Эта часть переводит индикатор пропускания временной ход в времени ванна осмолярность конечно. () Просмотр сохраненного файла данных, содержащего временной ход пропускания изменений индикаторный краситель. (B) Либо использовать ранее сохраненный список переменных и параметров, или вставить вручную 5 значения переменных текущего эксперимента: «true_C_init» и «true_C_end '(в osmolarities из исходного раствора ванны и P F -assay решения перфузированной через ванну),' t_start_wash'(Продолжительность базового отбора проб на начальном уровне индикаторный краситель),' threshold_% '(% от исходного значения, при котором программа автоматически определяет отклонение от базового пропускания; 1 - 5%, как правило, наиболее эффективным),' N_steady_st_pts '(число выборок - с 10 образцов, представляющих каждый индикаторный краситель изображение, снятое - быть усреднены в конце стационарного уровня индикаторный краситель, решающее значение для преобразования концентрации индикаторный краситель в концентрации осмотического агента) и начальных предположений для двух из четырех параметров Индикатор Dye пропускания сигмоидальная времени конечно, 'ширина' и т половины (Примерно зависит от длительности переходного части сигмовидной, и в его середине, соответственно; т половина может быть отрицательным!). Два лучше подходят параметры, в дополнение к "ширине" и т половине получаются без необходимости начального приближенияES: отставание ('flush_lag'), время между открытием клапана на приход раствора в ванне, и 'C_init', без физического смысла, но необходимо для описания времени осмолярность конечно (см Дополнительного P е Fit Руководство пользователя.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Концентрация индикаторный краситель в ванне и осмолярность среды () Временной ход концентрации индикаторный краситель, рассчитывается непосредственно из данных (точек) и с наиболее подходящую параметров (линия), как это промытых от лицами, не окрашенных раствором. (B) расчетное время ход изменения осмолярности раствора ванны, считая ее следует тем же динамику, что и изменения концентрации индикаторный краситель.

Рисунок 5 Рисунок 5:. 'Объем Fit' панель P ф Fit программы () Просмотр времени площадь файле данных Конечно анализируемого протопласта (B) Выберите 'Последний показатель Место' опцию, чтобы импортировать параметры эксперимента из. . последний запуск через 'Индикатор Fit "(обратитесь к руководству пользователя Справочная P F Fit для альтернатив) (С)" Тип модели' / 'класса': Класс I содержит простейшую модель 1, Класс II - модели 2 - 5, класс III - модели 6 - 8 Модели отличаются в отношении которых параметры фиксированы и которые корректируются (т.е. свободно переменная.) во время процедуры подгонки (отметьте поле, чтобы разрешить его меняться), и действительно ли ' SlopePf 'и / или' Задержка 'являются недействительными. РежимLs 1 - 6 подробно рассматриваются по Moshelion соавт 11.. 'Объединение' перечисляет выбор параметров, продиктованные выбора "Тип модели '/' класса '. Среди моделей с аналогичной отделкой результате - выбрать самый простой! Инициализация 'Рр', 'Slope Pf' ('Slope_Pf') и параметры "Пауза", как показано (Более подробно о "Пауза" в Е ниже). (D) Переменные и параметры, описывающие временной ход меняющейся ванны осмотикуме вводятся вручную, или как описано в Б. (E) промежуточный участок, вызывается удара «Выполнить», из времени ходе изменения объема (рассчитывается от контурных клеток областях), чтобы помочь в выборе начального значения для параметра 'задержки'. Оценка, на глаз, общую длину базовой линии с 1-го пункта до начала изменения объема ячейки ('включительно задержка: сумма 'т-начала стирки' + 'лаг' / 'скрытого лаг' + в "физиологическом" 'задержки'). Вставьте это значение в качестве входного параметра для «задержки» в панели 'VolumeFit' и 'Run' снова (см также в Руководстве пользователя Справочная P F Fit).

Рисунок 6
Рисунок 6: Результаты фитинг () "За кулисами": расчетные конечные программы обучения концентраций осмотикуме в двух отсеках:. Ванны (Cout, зеленая линия) и клеток (Cin, синяя линия; Cin является рассчитывается на основе изменения объема протопластов и предположения, что плазма мембрана проницаема только для воды - "идеальный и истинной осмометра" 11), и времени ход разница между ними (ДЕЛК, Красная линия), которая является движущей силой для потока воды, 'Ео-tLag' знаменует конец "флеш-лаг» и начала гипотонического вызов (здесь только при температуре около 21 сек). Красная коробка: погрешность подходят значение (отделочные ERR см определение в B ниже) (B) Конечный результат подгонки временной ход громкости;. Зеленый ящик: 'входных переменных' являются введенные значения с панели P F Fit / 'VolumeFit' (определяется на рисунке 5А легенде). Черный ящик: 'эксп-т »и« с отделкой Vol' являются экспериментальные данные и объем рассчитывается с использованием наиболее подходящую параметры, соответственно, 'Ео-tLag' такой же, как в А, знаки 'EO задержка " Начало изменения объема. «Район до 3%» отмечает громкость, с которой площадь поверхности увеличилась на 3%, предполагаемое ограничение на клеточной мембраны способности растягиваться без разрушения. 'Р (в пересчете)' это время курс фитинга-баСЭД рассчитаны Рр, охватывая значений, указанных ниже красной коробке как "Span Р F '. Red Box: 'УСТАНОВЛЕНЫ ПАРАМЕТРЫ "являются значения наилучших параметров подгонки:' Р я '(начальная P е)," задержка "(период между наступлением гипотоническому вызов и началом изменения объема (который, в зависимости от модели 5, используемого в этом примере, является также начало в изменении стоимости Р F), и 'склон-P F' (постоянная скорость изменения стоимости P F 'fit_ERR' показано на. - цель минимизация подгонке Matlab - это "корень среднеквадратичное" отклонение (то есть, корень квадратный из усредненного квадрата отклонения) из зеленой точкой от черной линии), представленный в% от объема исходных Это. является на это значение, что относительный успех повторного фитинга с различными значениями инициализации параметр судить.Предупреждение: Как значения наиболее подходят параметров может быть результатом локального минимума, найденного в процедуры минимизации ошибки - чтобы убедиться, что глобальный минимум был найден, несколько трасс требуются с различными значениями инициализации для этих трех параметров (и самый низкий fit_ERR следует искать в эти попытки Blue Box:. дельт являются изменения, которые произошли в конце подогнанной период изменения объема: 'Средняя VOLM%' является относительная степень расчетной изменения объема протопластов и «Средняя площадь% ' это относительное изменение площади поверхности протопластов. Первоначальный размер ячейки задается радиусом '', полученного из среднего значения протопластов базальной области контура.

Рисунок 7
Рисунок 7: Epi-флуоресцентной микроскопии вид мезофильных протопластов (А) в соответствии с передаваемой белого света и (б) по меньшей 488 нм возбуждение и 520 нм эмиссии. Шкала бар:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рисунок 8:. Изменение объема и экстрагируют осмотическое водопроницаемость, Р F (А) Время Конечно (60 сек) из протопласта набухания при воздействии гипотонического вызов (среднее ± SE) (б), рассчитанное концентрации осмотического агента в ванне в течение. гипотоническая проблемой. Следует отметить, что в то время как поток гипотонический раствор включен в 15 секунд, она достигла ванну только послеотставание, здесь 5,9 сек. (C) P F (среднее ± SE). Звездочки указывают значимые отличия от контроля (р ≤0.05). Данные, по меньшей мере, в трех независимых экспериментах для каждого лечения в общей сложности п протопластов (контроля N = 52, AtPIP2, 1: N = 13, ZmPIP1; 2: N = 28, ZmPIP2; 4 N = 34).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь является простым и очень эффективная процедура для измерения Рр изолированных протопластов растений, применимые в принципе и к другим сферических ячеек, например., Лягушка ооцитов 11. Этот метод основан на измерении Рр в ответ на осмотическое вызов ячейки. В отличие от других методов, основанных на этом подходе, однако, изменение решений, то есть, от осмолярности, не мгновенно, но постепенно, в течение постоянного ванны перфузии, начиная с изотоническим раствором, в котором объем базовой ячейки является создана. Кроме того, этот метод не предполагает всасывания пипетки и поэтому минимизирует помехи для протопластов.

Подход, представленный здесь, включает измерения из множества протопластов, из различных растений или тканей. Тем не менее, из расчетов, участвующих только сферические клетки могут быть проанализированы. Кроме того, ферментативная изоляция гое протопласты и осмолярность растворов должны быть приспособлены к анализировали клеток (например, ферментативную изоляция томата протопластов мезофилла занимает около часа, значительно больше, чем в случае Arabidopsis протопластов).

Выделение протопластов мезофилла Arabidopsis в соответствии с представленной протокола является простым, быстрым и эффективным, что дает большое количество протопластов. Примечательно, что это, в сочетании с их низкой базовых уровней P F и их высокой эффективности трансформации (Рисунок 8), делает их привлекательными система функционального выражения AQPs, чтобы позволить количественные сравнения P F вызванную различными изоформ Aqp. При экспрессии в этих AQPs протопластов с маркерным геном (например, GFP), можно легко экранировать протопластов в экспериментальной камере для флуоресцирующих клеток для анализа.

Стоит проверить это система является жизнеспособной AlternativE, чтобы ооцитов дл анализа AQPs даже из животных источников (что функциональные белки животного может быть выражено в клетках растений была уже продемонстрирована 17).

Использование P F Fit программу, еще два параметра, рядом с P F, получаются для описания ответов протопластных на гипотоническое проблем: задержки, время между началом изменения объема и началом ванны перфузии, и Slope Pf, скорость изменения Р F в течение осмотического вызов (подробно описано в 11).

Для каждой экспериментальной установленных процедуру подгонки громкости данных должна быть выполнена несколько раз, поставляя различные, начиная (инициализации) значения для этих параметров, в конечном итоге выбор посадки с низкой погрешностью. Этот процесс минимизации ошибки может быть представлена ​​как ищет самую глубокую долину ("глобального минимума") в ландшафт долины с разных глубинах, среди человеку холмы, и не пытается попасть в довольно мелкой долине ("локального минимума").

Два типа P F получаются, Р F в самом начале гипоосмотическими отек ответа ("Р F начальная ') и F P вычисляются в конце 15 сек набухания, считая от конца   задержка ('P е окончательной'). Разница между этими двумя обсуждается в полной мере на Moshelion соавт. 11, в отношении 6 моделей, проанализированных.

Есть два важных шагов в протоколе: первый, хорошо подходят для временного хода концентрации индикаторный краситель, второй, хорошо подходят к времени конечно объема набухания клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Национального фонда бельгийской для Научным гр исследований (FNRS), Межвузовский достопримечательности поляки Программа-бельгийской научной политики и "Русская община Бельгийского-действия де RECHERCHES Concertées" в ФК, от Израиля научного фонда Иерусалиме ( ISF) ММ (грант № 1311/12), и в Нью-Мексико (грант № 1312/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl Chem-Impex International 01247-1 http://www.chemimpex.com
Any source, anal. grade
CaCl2 Merck 11718006 http://www.merck.com
Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) Sigma 15152002 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
D-Sorbitol Sigma 18032003 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
Cellulase Worthington, Lakewood, NJ, USA LS002603 http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase Karlan,               Phonix, AZ, USA 8006 http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) Sigma 81420 http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418-5G http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate Sigma P4380 http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine Sigma P8920 http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol Sigma X4126 http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy Merck 107921 https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope  Nikon Eclipse TS100/TS100F http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump BIO-RAD EP-1 Econo Pump http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera Scion Corporation CFW-1308M http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ Carnegie Mellon http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Free software
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit BIO-RAD 731-9006 http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold DirectMed http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns) Welford IF-BR-001 http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing TYGON R-3603 http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear Viking Industrial, UK VKMONO25 http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8
any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
  2. Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
  3. Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
  4. Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
  5. Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
  6. Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
  7. Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
  8. Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
  9. Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
  10. Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
  11. Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
  12. Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
  13. Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
  14. Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
  15. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
  16. Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
  17. Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).

Tags

Биологии растений выпуск 92 Осмотическое коэффициент водопроницаемость аквапорины протопласты кривой не мгновенное изменение осмолярности изменение объема времени курс
Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, … More

Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, X., Chaumont, F., Moran, N., Moshelion, M. Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example. J. Vis. Exp. (92), e51652, doi:10.3791/51652 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter