Summary
هناك سوء فهم لطبيعة التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية والسلف (HSPCs) ومحاريب نخاع العظام. التعديلات الأجهزة المخصصة وبروتوكول اكتساب متعددة الخطوات تسمح باستخدام اثنين من الفوتون والفحص المجهري متحد البؤر لصورة فيفو السابقين HSPCs المسمى المخزن داخل المناطق نخاع العظام، وتتبع التفاعلات والحركة.
Abstract
من خلال التوازن الدقيق بين هدوء وانتشار، وتجديد الذات وإنتاج ذرية متباينة، والخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) الحفاظ على دوران الأنساب جميع خلايا الدم الناضجة. تنسيق الإشارات المعقدة التي تفضي إلى مصائر شهادة الثانوية العامة المحددة يعتمد على التفاعل بين HSCs ومعقدة المكروية نخاع العظام، التي لا تزال غير مفهومة [1-2].
ونحن تصف كيف من خلال الجمع بين حامل العينة وضعت حديثا لتحديد المواقع الحيوانات مستقرة مع متعددة الخطوات متحد البؤر والفوتون اثنين في تقنيات التصوير الجسم الحي، فمن الممكن الحصول على مداخن 3D عالية الدقة تحتوي على HSPCs والمنافذ المحيطة بها ورصد لهم على مر الزمن من خلال متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير. تصوير عالية الوضوح يتيح الكشف عن فيفو السابقين الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف المسمى (HSPCs) المقيمات داخل نخاع العظام. وعلاوة على ذلك، متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير 3D، سbtained مع إعدادات اقتناء أسرع، ويوفر معلومات دقيقة عن حركة HSPC والتفاعلات المتبادلة بين HSPCs وخلايا سدى.
ويظهر من تتبع HSPCs فيما يتعلق GFP الخلايا بانية العظم إيجابي كتطبيق المثالي لهذه الطريقة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتتبع أي المسمى بشكل مناسب للدم أو انسجة الخلايا المصالح داخل الماوس القبة مساحة النخاع العظمي.
Introduction
على الرغم من محاريب الخلايا الجذعية بعد أن تم الاعتراف منذ عقود 3 وتتميز في العديد من الأنسجة بشكل جيد مثل البصلة الشمية، ألياف العضلات، وبصيلات الشعر أو انتفاخ CNS منطقة subventricular 4-7، والتفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية (HSCs) ونخاع العظام المكروية ( BM) لا تزال غير مفهومة نظرا لصعوبة مراقبة مباشرة الخلايا واحد من خلال العظام وكذلك طبيعة السوائل للغاية من الأنسجة نفسها. فقد تبين، من خلال عدد من الدراسات وظيفية على أساس ablating أو overexpressing جينات معينة في أي HSCs أو الخلايا اللحمية من المكروية نفسها، أن شبكة معقدة من أنواع مختلفة من الخلايا وإشارات التنظيمية هي المسؤولة عن تنظيم التوازن الدقيق بين هدوء والانتشار والتوسع وتمايز HSCs 1-2. الحديث المتبادل بين HSCs والمنافذ التي يمكن فهمها بعمق إلا من خلال الملاحظة المباشرة. هذا هو منظمة العمل ضد الجوعبفضل ievable في تطوير بروتوكولات التصوير المتقدمة، والجمع بين التكنولوجيا المتاحة ليس فقط من حيث المجهري، ولكن أيضا من الحلول حامل العينة والبرمجيات الاستحواذ.
أظهر قرار وحيد الخلية الحية التصوير من الخلايا المزروعة الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) في حجرة BM العظام calvaria الفأر الذي HSPCs engrafting توطين في القرب من السفن SDF-1 وVCAM-1-ايجابية 8-9 وأن الخلايا غير الناضجة أكثر وتوجد داخل 15-20 ميكرون من خلايا بانيات العظم GFP إيجابية (Col2.3-GFP خط الماوس المعدلة وراثيا، الذي المقيدة بناء العظم الكولاجين 1α المروج يقود GFP التعبير)، في حين ذريتهم هي أكثر البعيدة 10. تم الحصول على ملاحظات مماثلة من تشريح وكسور عظام الفخذ و11 من عظام ضعيفة tibeal 12. لا يزال التصوير من نخاع العظام قبة القحف نهج أقل الغازية لتحقيق رؤية مباشرة من داخل HSPCs عشرمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو المكروية الأصلية.
مع أي التصوير العينة الحية هناك حاجة ملازمة للحفاظ على عينة كما لا يزال ممكن لتجنب أي لا لزوم لها القطع الأثرية بسبب حركة العينة. التنفس يسبب حركات متذبذبة من الرأس الماوس، والتي تحتاج إلى تجنبها عند التصوير نخاع العظام قبة القحف. أصحاب المجسم التقليدية، وتستخدم على سبيل المثال لتصوير الدماغ والكهربية، ليست مناسبة للتصوير القبة لأنها تعرقل العظام الأمامية. بدءا من حامل الماوس تستخدم لتقليل الشدة أثناء التصوير والكهربية الدراسات الحية 13، وقد وضعت حامل 2 عنصر، مع قطعة صغيرة ثابتة في الرأس من الماوس لخلق نافذة التصوير متصلة الذراع أكبر ضمان عقد ثابت مع لوحة قاعدة الثقيلة التي يؤمن بقوة في مرحلة المجهر. تأمين قطعة الرأس إلى الجمجمة من الفأرة يتيح حرية التنفس في حين لا يزال شل حركة الرأس في مكان والقضاء على نحو كاف مovements بسبب التنفس. آلية "القفل والمفتاح" الذي يربط الرأس قطعة للجسم حامل تسمح حجم النافذة ليكون الحد الأدنى فضلا عن زيادة دقة تحديد المواقع، وبالتالي تبسيط عملية جراحية، ونوبة من لوحة قاعدة في مرحلة يسمح للمحاذاة دقيقة على المجهر. لمراقبة بدقة خلايا متحركة، تم تصميم متعدد نقطة بروتوكول الفاصل الزمني للسماح تتبع الخلايا مع مرور الوقت 5 دقائق الفاصلة بين النقاط الزمنية. يتم حقن HSCs هنا، هل وصفت في col2.3GFP osteoblasitc الفئران مراسل 10،14 وبعد تصوير حوالي 20 ساعة. صاحب الماوس التي تم تصميمها ويتم وصف إعدادات التصوير المطلوبة لأداء سريع متعدد نقطة الوقت الفاصل بين التصوير من نفس المناطق على مدى ساعة متعددة بالتفصيل.
Protocol
وتتم جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وفقا للتشريعات المحلية. الموافقة عملنا من قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة وكذلك كلية امبريال لوحة المراجعة الأخلاقية. ووصف الإجراءات المسموح بها في وثائق ترخيص مشروع واتبع الإرشادات التي تضمن رفاهية الحيوان في جميع الأوقات. ضمان الالتزام التشريع على التجارب على الحيوانات من البلاد حيث يتم تنفيذ العمل.
1. وصفها حقن HSPCs:
- خلايا الحصاد كما وصفها لو سيلسو 14-15.
- إعداد الخلايا بتركيز 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: استخدام عدادة الكريات أو المعلومات التي تقدمها فارز الخلية إلى عدد الخلايا. عدد الخلايا ليكون المسمى وحقن يختلف تبعا لنوع الخلية (وصمة عار على سبيل المثال 10،000 - 20،000 HSCs، 100،000 - 300،000 HPCS). إذا كان يعمل بأقل من 10 5 خلايا، resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني؛ فمن المهم أن يكون الخلايا في برنامج تلفزيوني من دون أي مصل الدم، كما يمنع مصل تلطيخ.
- إضافة إلى فعل تعليق الخلية بتركيز نهائي من 5 ميكرومتر ودوامة تعليق على الفور لضمان الصبغة لا تترسب من حل وتفشل في تسمية الخلايا.
- احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم يغسل عن طريق الدوران في 500 x ج لمدة 5 دقائق، الصب السائل وإعادة التعليق بيليه في حجم مناسب للحقن الرابع (~ 100-150 ميكرولتر)
- resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع إلى حقنة الأنسولين. ملاحظة: يوصى حقنة الأنسولين أكثر من حقنة التقليدية لأنه لا يوجد لديه مساحة إبرة القتلى ويسمح بإدارة تعليق خلية بأكمله إلى الماوس ول.
- حقن الخلايا في الماوس المشع القاتلة عبر حقن الوريد الذيل. ملاحظة: لم يعرف الإشعاع، تأثير كبير على نخاع العظم المكروية (سواء انسجة المكونة للدم ومكونات)، والذي يتطور مع مرور منظمة الشفافية الدوليةلي. لذا من المهم جدا للحفاظ على توقيت ثابت لتشعيع، حقن الخلايا (من 4 إلى 24 ساعة من التعرض للإشعاع لأفضل engraftment) والتصوير. هنا يتم إجراء أشعة 6 ساعة قبل الحقن ويتم تنفيذ التصوير 20 ساعة بعد الحقن.
- ضع الماوس في غرفة دافئة (37 درجة مئوية) حتى يظهر الوريد الذيل vasodilated.
- تحريك الماوس إلى رادع وحرك بعناية الإبرة في الوريد الذيل.
- حقن الخلايا في الوريد - يجب أن يكون واجه أي مقاومة للحقن.
- ترك الماوس O / N من أجل السماح الخلايا على الهجرة إلى مسافات نخاع العظام.
2. إعداد الماوس للتصوير
- الأوتوكلاف زوج واحد من ملقط غرامة وزوج واحد من مقص غرامة فضلا عن خوذة قبل استخدامها وتخزينها في بيئة معقمة.
- تشكل مخدر طازجة ممكن، (0.38 مل الكيتامين + 0.25 + 4.47 مل Medetomidine مل من الماء). ملاحظة: بعد التمديدسوف التخدير لها المعتمدة، بما في ذلك الأيزوفلورين والحقن الأخرى، تكون فعالة جدا. كوكتيل صفه هو أن تدار داخل الصفاق عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم، مع كبار المنبثقة من 30 - 50 ميكرولتر تدار كل 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
- التبديل على الليزر ثنائي الفوتون إذا لزم الأمر ثم بدء المجهر والبرمجيات، ومعايرة المرحلة عند المطالبة. تشغيل الليزر والسماح لهم الاحماء والاستقرار في حين تستعد الماوس للتصوير.
- تخدير الماوس باستخدام خليط مخدر استعداد (الخطوة 2.2) للمخدر المختار عبر الحقن داخل الصفاق. مراقبة بدء التخدير العميق عن طريق دواسة المنعكس الآن وعلى فترات منتظمة طوال البروتوكول. ملاحظة: يجب مراقبة الماوس بعناية في جميع أنحاء الداخلي وإذا ظهر التخدير إلى أن البرق (عادة بعد 45 - 60 دقيقة) ثم تدير جرعة أعلى الهاتفي (كما هو مفصل في 2.2). نتوقع بعض الاختلاف بين الفئران من مختلف الأعمار والجنس. فمن المجمدةتؤخذ تانت لمناقشة بروتوكول التخدير مع ضابط البيطرية المحلية لضمان الاحتياطات الكافية لضمان الرفاه الفأر.
- مسحة الجزء العلوي من فروة الرأس مع الايثانول 70٪ على الأنسجة، مما يضمن عدم حصول أي الإيثانول في أعين من الفأرة.
- باستخدام ملقط معقم ومقص، وإزالة بعناية الجزء المركزي من فروة الرأس لفضح منطقة القبة ليمكن تصوير: إجراء شق صغير في الجزء الخلفي من الرأس بين الأذنين من خلال رفع الجلد مع ملقط. في حين عقد تصل الجلد، مرر مقص تحت الجلد وقطع بلطف على طول خارج منطقة التصوير المطلوب.
- مسح العظام يتعرض مع برعم القطن معقم مبلل مع PBS العقيمة لإبقائها رطبة.
- نعلق قطعة معدنية لرئيس جمجمة الماوس جاهزة للتصوير.
- خلط كمية كافية من الاسمنت الأسنان في وزن القارب حتى يصبح عجينة وبسرعة تنطبق على السطح السفلي للخوذة التي سوف نعلق على ق كول.
- قبل غروب الاسمنت ووضع خوذة على الجمجمة من الفأرة، والتأكد من عدم الحصول على أي الاسمنت الأسنان على منطقة التصوير، ثم انتظر حتى تعيين.
- ضع كمية صغيرة من Intrasite هيدروجيل التي تحافظ على الجمجمة رطبة.
- إرفاق خوذة لصاحب وآمنة في مكانها باستخدام المسمار، وضمان أن الأخاديد تناسب داخل الشقوق حامل.
- إزالة هيدروجيل من الجمجمة مع براعم القطن معقمة ونظيفة مع برنامج تلفزيوني العقيمة قبل ان ينتقل الى المجهر.
- إدراج حامل في مرحلة المجهر، وضع حصيرة التدفئة تحت الماوس، إدراج التحقيق مقياس الحرارة المستقيم وتأمين كل شيء في مكانه على المسرح مع شريط لاصق.
- وضع قطرة صغيرة من مرهم للعين على العيون من الفأرة لضمان أنها لا تجف بينما تحت التخدير. ملاحظة: يجب عدم ترك الماوس غير المراقب في أي وقت أثناء عملية التصوير، بينما تحت التخدير.
. الحمار = "jove_title"> 3 في فيفو التصوير: مداخن عالية الدقة وشراء الوقت الفاصل
- التركيز على الجمجمة عن طريق القطع العين.
- تملأ نافذة التصوير مع النقى الماء المعقم واستخدام عدسة غمس المياه وخفضه بحيث تلامس قطرات الماء.
- التركيز على الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام المجهر العدسات، وذلك باستخدام مصباح الخارجي باعتباره مصدر للضوء.
- وضع منطقة التصوير على خياطة المركزية والتحرك نحو الجزء الخلفي من الرأس إلى العثور على الدرز الإكليلي باعتباره نقطة الانطلاق.
- تعيين المجهر للسماح الإثارة والكشف الفعالة للfluorophores ذات الصلة المحددة في الجدول الإثارة وانبعاث. ملاحظة: في حين يتم استخدام مبائر تستقيم ايكا SP5 مع رئيس التقليدي الجلفانومتر المسح تشغيل منصة برمجيات LAS-AF هنا، فإن الإجراء يمكن تكرارها بسهولة في غيرها من منصات المجهر / البرمجيات. العدسة المستخدمة هنا هي لايكا HCX IRAPO L 25X W / 0.95 NA بهي العدسات تعادل UT من الشركات المصنعة الأخرى المتاحة مع التكبير مناسبة وعالية NA
- وضع البرنامج في وضع لالتقاط الصور سواء XY فضلا عن Z-3D المكدس وتعيين سرعة التصوير إلى 400 هرتز، والقرار 512 X 512 بكسل. ملاحظة: الإعداد والأجهزة ينتج هنا في مجال الرؤية من 620 ميكرون وهذا قد تختلف على منصات أخرى.
- تعيين البرنامج بحيث قنوات متعددة / المسارات هي قادرة على أن القبض عليه، فضلا عن ضمان أن يتم تعيين طريقة جمع لتغيير الإعدادات بين اكوام إن أمكن أو بين الإطارات على أقل تقدير. اقامة 3 إعدادات التقاط مستقلة، إطفاء إضاءة الليزر في نهاية اقتناء كل المكدس. ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة ثلاث قنوات لهذا الإجراء للحد من الحديث المتبادل بين القنوات.
- الإعداد الإعدادات لأول مسح متتابعة لاثنين الفوتون SHG إشارة العظام (840 نانومتر الإثارة. 400-440 الانبعاثات نانومتر). فتح مصراع ليزر النائب وضمان MP مكاسب وتعويض هم بشكل صحيح الإعداد، قوة الليزر هو 12،5 حتي 25٪ ويتم فيها تشغيل الليزر على. تحديد PMT حسب الاقتضاء كاشف الوحيد وتغيير اللون إلى الأبيض. ملاحظة: كشف NDD مع الفلاتر المناسبة ينبغي أن تستخدم للكشف العظام عندما تكون متاحة لتحقيق أكثر إشراقا، إشارة أعمق.
- كرر الإجراء الإعداد القناة المستخدمة للقناة GFP لتألق ذاتي مجتمعة (543 نانومتر الإثارة، 560 - الانبعاثات ل 600Nm) وفعل (633 نانومتر الإثارة. 650-720 الانبعاثات نانومتر) تحت إعدادات المسح الضوئي الثانية، وذلك باستخدام اثنين من هذه الفرق المناسبة. تغيير اللون إلى الأخضر قناة للتألق ذاتي والأحمر للفعل. ملاحظة: باستخدام الأخضر كقناة لصناعة السيارات في مضان تسمح الكشف أسهل من فعل خلايا إيجابية عندما يغطى القناتين - خلايا autofluorescent تظهر الأصفر و/ البرتقال نظرا لكونها في كل من القنوات بينما لم تظهر الخلايا الحمراء فقط كما أنها تظهر فقط في هل القناة. قناة لصناعة السيارات في مضانيستخدم فقط لإجراء هذه المقارنة، وعدم استخدامه في أي تحليل النهائي، ولكن إذا كان المستخدم يرغب في، وهذا يمكن أن يتغير إلى لون مختلف لأغراض العرض لتجنب الخلط بينها وبين قناة GFP.
- أخيرا، الإعداد الفحص الثالث والأخير للGFP (488 نانومتر الإثارة. 500-530 الانبعاثات نانومتر). تأكد من مصراع مفتوح إذا لزم الأمر ثم قم بتعيين قوة الليزر من خط ليزر 488 نانومتر إلى حوالي 15٪ أو على مستوى مناسب ليزر تستخدم، حدد PMT حسب الاقتضاء كاشف الوحيد النشط وتغيير pseudocolor إلى اللون الأخضر.
- تنشيط 'يعيش' وضع التصوير لبدء معاينة المسح الضوئي للقناة المختارة وضبط كاشف الربح وتعويض التعرض الأمثل. كرر ذلك لكل المسح في إطار تسلسلي.
- حفظ الإعدادات من هذه بمسح متعدد القنوات لسهولة إعادة الاستخدام. ملاحظة: هذا يسمح للمستخدم لإعادة تحميل الإعدادات في الدورات اللاحقة.
- تفعيل التقاط متعدد الموقف، ويشار إلى 'مارك لالبحث الثاني "في برنامج تظاهر، وإعادة تنسيق نقطة.
- مسح منطقة التصوير العظام، بدءا من تقاطع بين الدرز الإكليلي المركزية و، تفحص عمق منطقة نخاع العظام باستخدام كل من تألق ذاتي (الزائفة اللون الأخضر) وفعل (شبه بلون أحمر) بهدف مركب. ملاحظة: خلايا autofluorescent سوف تكون موجودة في كل القنوات وتظهر برتقالي / أصفر في الصورة المركبة في حين لم الخلايا المسمى سوف تظهر كما خلايا الدم الحمراء فقط في صورة مركبة.
- عندما تم الكشف عن خلية، بمناسبة هذا بمثابة تنسيق الموقف الجديد (X، Y و z) في 'مارك والبحث عن "أداة بالنقر على نافذة" إضافة رمز جديد الموقع على الجانب الأيسر من "مارك والبحث عن" .
- عندما تم فحص الحقل الحالي من الرأي، نقل مرحلة المسافة من حقل واحد من عرض إما يسار / يمين / أسفل / أعلى. كرر هذه العملية لكل مجال الرؤية، والعمل تدريجيا في جميع أنحاء منطقة بأكملها التصوير نافذة على يسار عشرالبريد خياطة المركزية، والانتقال نحو الأنف من الفأرة. مرة واحدة والتشعب خياطة المركزي في الأفق، والانتقال إلى الجانب الأيمن من خياطة وكرر الإجراء بمسح الجانب الأيسر في الاتجاه المعاكس (أي نحو الدرز الإكليلي). بمناسبة إحداثيات أي خلايا جديدة ذات الاهتمام باستخدام 'مارك والبحث عن "الأداة.
- مرة واحدة المسح من النافذة اكتمال التصوير، استخدام 'مارك والبحث عن "أداة لمراجعة نقاط (تحديد النقطة المطلوبة ومراجعة كل نقطة على حدة). تعيين أعلى وأسفل لZ-كومة حول كل خلية لكل منصب، (العديد من المنصات البرنامج سوف يسمح لك لأداء المستقلة ض مداخن لكل منصب، مما يقلل التقاط مساحة فارغة). لكل نقطة، والتركيز صعودا وهبوطا ووضع العلوية والسفلية مواقف Z 3D لالتقاط ض المكدس وتحديث نقطة الفردية في 'مارك والبحث. تعيين الفاصل Z-ستاك إلى 5μm والمتوسط لكل قناة المسح الضوئي متتابعة إلى الجودة المناسبة: خط سص الإطار المتوسط. ملاحظة: زيادة عدد المسح أن يبلغ متوسط يزيد من طول الوقت الاستحواذ.
- الحصول على كومة إشارة عالية الجودة لكل نقطة من الفائدة عن طريق البدء في إجراء مسح كامل (غالبا ما يشار إليها باسم "ابدأ" بدلا من "التقاط"). ملاحظة: هذا المسح يمكن أن تكون بمثابة مرجع للمستقبل التصوير عالية السرعة.
- وبمجرد الانتهاء من المسح الضوئي عالية الجودة، وتفعيل إعداد الوقت الفاصل عن الالتقاط.
- في إعدادات مرور الزمن، تعيين الفاصل الزمني إلى 5 دقائق ووقت التشغيل الكلي إلى الطول المطلوب (على سبيل المثال، 5 ساعة). 'تطبيق' هذه الإعدادات إلى الفحص الشامل. ملاحظة: من أجل تقليل هذا الوقت مسح للسماح 5 دقائق الفاصل الزمني الفاصل، واحدة قد تحتاج إلى تخفيض عدد عمليات الفحص المستخدمة في المتوسط، والحد من القرار 512 X 512 بكسل، تحويل المسح إلى ثنائية الاتجاه (مع تصحيح المرحلة المطلوبة لمحاذاة كلا الاتجاهين المسح الضوئي)، و / أو زيادة سرعة المسح الضوئي إلى 600 هرتز أو أكثر (أكثر من 600سوف يسبب هرتز التكبير من منطقة التصوير لمنصة البرمجيات أظهرت). ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنه في حين تم استخدام وضع التصوير المتتابع للحصول على صورة كومة جودة عالية في البداية، ويستخدم الاستحواذ في وقت واحد لزيادة سرعة خلال الوقت الفاصل بين التصوير - وهذا قد يؤدي في بعض عبر الحديث طفيف بين القنوات التي تضع اضافية أهمية على التقاط الأولي للمداخن إشارة فصل بدقة.
- بدء تصوير (كما كان من قبل من خلال النقر على زر "ابدأ" في البرنامج تظاهر). ملاحظة: تأكد للحفاظ على مستوى مناسب من التخدير عن طريق إعطاء مزيد من جرعات أصغر عند الحاجة، والحرص على عدم جرعة زائدة الماوس، بانتظام أعلى حتى من المياه لضمان الهدف لا تجف ومراقبة العلامات الحيوية ودرجة الحرارة وسادة التدفئة طوال الوقت.
- عند الانتهاء، ورفع من صاحب عدسة ثم قم بإزالة حامل من مرحلة المجهر، وضمان الأسلاك من التحقيق المستقيم وحتناول حصيرة لا معطوبة.
- فك خوذة من صاحب مرحلة وإزالة بعناية الماوس. اعدام باستخدام الماوس خلع عنق الرحم وإزالة المعادن الرأس قطعة عن طريق العض تشغيله الجمجمة. حفظ البيانات على القرص ونقل إلى خادم لتحليلها لاحقا. ملاحظة: يتم تنظيف قطعة الرأس بشكل مثالي بواسطة غمس في الأسيتون لبضع ساعات وفرك أخيرا من بقايا الاسمنت.
Representative Results
العرف، عالية الدقة حامل الماوس بما في ذلك نافذة التصوير القبة يسمح التصوير لفترة طويلة من FACS تنقيته، HSPCs المسمى حقن الفئران المتلقي المشع القاتلة (الشكل 1A). عادة، بعد حقن من بين 15-20000 الخلايا المسمى، 8 إلى 15 خلايا وعادة ما تكون معترف بها داخل منطقة التصوير نخاع العظام من الجمجمة في اليوم التالي. هنا هو مبين كيفية الحصول على واحدة مداخن 3D قرار خلية من HSPC المناطق التي تحتوي على نخاع العظم من حوالي 90-120 ميكرون سمك، (الشكل 1B)، تليها 4D الوقت الفاصل بين الأفلام التي تم تحديدها من HSPCs (الشكل 1C والفيلم).
ويتم الحصول على النتائج المثلى إذا لم يتم إعدادها على النحو الأمثل الاسمنت الأسنان، على سبيل المثال الماء قد تسرب من المناطق غير مختومة، وعلى الرغم من أنه يمكن تصدرت ارتفاعا من الجزء العلوي من حامل، أي الفترة الزمنية التي لا تراجع عدسة في المياه يؤدي إلى و السوداء rames. بعض الانجراف في الصور أمر لا مفر منه بسبب التمدد الحراري للمواد من صاحب الماوس، ومع ذلك فإنه يمكن بفعل التصاق الاسمنت دون المستوى الأمثل، مما أدى إلى انفصال التدريجي للماوس، واضطرابات في التصوير اقامة، مما أدى إلى قفزات مفاجئة من التركيز خلال الوقت الفاصل بين التصوير. ويمكن أيضا الانجراف خلال متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير يكون سببها عدم دقة في الحركات مرحلة إعادة النظر في المواقف عند تصويرها سابقا. يمكن تصحيح انحراف وتلعثم التحف في أفلام الوقت الفاصل عن طريق استخدام الخوارزميات تسجيل الصورة.
الجدول 1. الإثارة وضبط الانبعاثات.
| قناة اللون | الإثارة | الانبعاثات |
| GFP | 13px؛ "> 488 نانومتر500-530 نانومتر | |
| تألق ذاتي | 543 نانومتر | 560-610 نانومتر |
| لم | 633 نانومتر | 640-700 نانومتر |
| SHG | 840 نانومتر (MP) | 400-450 نانومتر |
الرقم 1. في الجسم الحي 4D التصوير من HSPCs في الماوس القبة. خلايا أمثلة من النتائج التي تم الحصول عليها (B) شرائح 2D من كومة 3D (عمق إجمالية تبلغ 114 ميكرون)، التي تحتوي على إشارة من العظام الكولاجين (أبيض)، هل المسمى (الحمراء) - (A) الخطوط العريضة للتجربة (C B). ، سل autofluorescentليرة سورية (الأصفر) وخلايا عظمية (الخضراء). أشرطة النطاق: 100 ميكرون شرائح (C) 2D من 4D فيلم الوقت الفاصل يظهر لم HSC المسمى (الحمراء) المهاجرة في القرب من خلايا عظمية (الخضراء). خط منقط يسلط الضوء على النزوح من الخلية. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر (B) و 100 ميكرون (C). ملاحظة: الفيلم تم الحصول عليها من اكتساب الوقت الفاصل في (C) ستعرض خلال المقالة الفيديو الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ما تم انجازه؟
يستخدم بروتوكول التصوير متعدد الأبعاد الوقت الفاصل بين لمراقبة هجرة FACS تنقيتها، خارج الحي المسمى، HSPCs زرعها في الماوس قبة القحف نخاع العظام. وقد تحقق تحديد الخلايا المزروعة واحدة تم رصدها هذه على مدى فترات طويلة من الزمن (ساعة) مع دقة عالية. تم التقليل من التحف حركة التنفس الناجم وتم reimaged خلايا مرارا وتكرارا على مدى فترة زمنية بالطبع لفترة طويلة.
ما هي التوجهات المستقبلية؟
تطوير تقنية يمكن إحراز تقدم نحو التجارب الانتعاش للسماح للتصوير في أيام متعددة، على مدار أسبوع أو أكثر واستخدام التخدير الغاز مثل الأيزوفلورين لاختصار وتبسيط عملية الانتعاش للماوس (ملاحظة: التجارب الانتعاش تتطلب بدقة شروط الجراحة المعقمة وإدارة المسكنات المناسبة). ديفelopment من أكبر لوحة الألوان من الأصباغ في الجسم الحي وكذلك وضع العلامات الوراثية كفاءة الخلايا المكونة للدم أيضا سيسهل التجارب متعددة العلامات، وتوفير مزيد من التبصر في التفاعلات خلية خلية داخل نخاع العظام والسماح لتجارب أكثر تعقيدا في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، فإن وضع العلامات في وقت واحد من عدة هياكل نخاع العظام ومكونات سدى توفر صورة أكثر اكتمالا للأحداث التي تجري في محاريب HSPC. استقرار الصورة من الأفلام مرور الزمن يمكن تحسين preacquisition عن طريق تثبيت المجهر مزيد فضلا عن التقليل من التدرجات درجة الحرارة في العينة وpostacquisition باستخدام خوارزميات تسجيل الصورة.
القيود:
تقنية الموضحة تقدم بعض القيود. بقاء الفئران التالية إدارة التخدير عن طريق الحقن لا يمكن التنبؤ بها وأنه من السهل جدا لمضاعفات خبرة اعتمادا على استجابة الفرد للمخدر. عموما، وتعد جلسة التصوير، وصعوبة هو الماوس للتعافي من التخدير ولذلك فمن المهم أن تخطط بعناية ما إذا كان الماوس لاستردادها، مما يحد بشكل مثالي مدة انقضاء وقت التصوير. استخدام التخدير عن طريق الحقن يحد من الوقت كل دورة التصوير يمكن أن تستمر ل. في حين أنه من الممكن إطالة التخدير بواسطة readministering جرعة صغيرة من المخدر، فمن الصعب إجراء هذا بدقة وجرعة زائدة الماوس هو واحد من الأسباب الأكثر شيوعا من السابق لأوانه إنهاء التصوير في الجسم الحي. التخدير الغاز هو أقل سمية ويسمح لجلسة التصوير تعد الأولية، ولكن الانتعاش السريع من الفأرة بعد> 2 ساعة إدارة طويلة من الأيزوفلورين نادرا ما تكون ناجحة. تقييد آخر للتقنية هو القرار محدود من الصور التي يمكن الحصول عليها خلال متعددة نقطة التصوير مرور الزمن، بسبب ضرورة الحصول على الصور بسرعة. هذا، إلى جانب الانحراف البؤري أو الحقل يقفز (القرصussed أعلاه)، يمكن أن تجعل من الصعب تتبع الخلايا.
مقارنة مع الطرق البديلة:
وعادة ما وصفت HSPCs مع صبغ محبة للدهون فعلت، ولكن دير والجاذبة الأصباغ هي البدائل تعادل والأصباغ خلية أخرى يمكن استخدامها طالما مشرق بما فيه الكفاية، كما استعرضت في [16]. على الرغم من خارج الحي وسم الخلايا مع DID وقد تبين أن لا يؤثر على وظيفة على المدى الطويل HSCs، فمن لديه الحد الذي لم (أو أي صبغة كيميائية أخرى) والمخفف على انقسام الخلايا. منذ HSCs تتكاثر خلال الأيام الأولى بعد زرع، إشارة إلى نسبة الضوضاء لهذه الخلايا تتدهور بسرعة. وضع العلامات الذاتية للخلايا عن طريق التلاعب الجيني والتعبير عن البروتينات الفلورية هو طريقة بديلة قابلة للحياة، طالما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية عند مستويات مرتفعة بما فيه الكفاية لتوليد إشارة اكتشافها من خلال عظم الجمجمة. هناك عدد من ميتاليك بديلiques متوفرة لتنفيذ تصوير HSPCs داخل الفضاء نخاع العظم، ولكل منها فوائدها الخاصة والقيود. إدخال أجهزة التصوير القائم على الألياف البصرية يسمح للتصوير من نخاع العظم في إعادة تشكيل العظام الطويلة [8]، في حين أن التصوير متحد البؤر بعد التعرض الجراحية من الساق وترقق العظام مع المينا الحفر الجراحية [12] ينتج صورا تفصيلية من المقيمين في HSPCs المناطق الطرفية من العظام الطويلة. ولكن هذه الأساليب هي أكثر الغازية بكثير من وصفها هنا، وبالتالي لا تسمح لتكرار جلسات التصوير مع التركيز على المنطقة نفسها نخاع العظم داخل نفس الماوس. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن هذه التقنيات قد تؤثر على خلايا احظ نظرا للاستجابة حتمية لأضرار واسعة النطاق في الأنسجة المحيطة بها. تم تصوير HSPCs لفترات قصيرة من الزمن من خلال coverslips وضعت على رفعه، كسور عظام الفخذ [11]، ولكن تأثير هذا المستحضر قاسية من النسيج على HSPCs ليس جزءا لا يتجزأ منوقد استخدم r و تقنية فريدة للحصول على نقطة واحدة الملاحظات الوقت. تم مقطوع العظام الثابتة إلى أقسام التسلسلية، الملون، والصور التي تم الحصول عليها بناؤها إلى نموذج 3D، وتوفير قرار 3D ممتازة، وخصوصا عندما تستخدم يلقي الأوعية الدموية [17]، واستخدمت مؤخرا الليزر الضوئي الخلوي (LaSC) للحصول على الكمية تدابير حول HSPCs في الموقع، أبرز بواسطة المناعية [18] ولكن غير قادر على تقديم أي معلومات الزمانية حول سلوك الخلايا. التقنيات الموضحة في هذه التقنية الجديدة توفر مزيجا من قرار جيد في 3D، وأخذ العينات الزمنية كافية لرصد الخلايا في 4D وهي نسبيا غير الغازية، وبالتالي تقديم نهج المثالي لتحقيق رصد طويل الأجل من HSPCs التفاعل مع نخاع العظام المكروية.
Acknowledgments
وأجري التصوير من على رأسي لايكا SP5 المجهر متحد البؤر التي تقع داخل منشأة FILM من امبريال كوليدج في لندن، الذي يديره الدكتور مارتن Spitaler.
وقدم صاحب العينة وخوذة بالتعاون مع قسم الهندسة الكيميائية من كلية امبريال لندن، بمشورة من صمويل جونز والدكتور سيمون شولتز.
كان نيكولا Ruivo، فرانسيسكو دياز والموظفين CBS في كلية امبريال فعال لما قدموه من مساعدة والمشورة بشأن تربية الماوس. يتم تمويل كافة سكوت بواسطة HFSP وFILM، Olufolake Akinduro بواسطة CRUK وكريستينا لو سيلسو بواسطة CRUK، KKLF، BBSRC وHFSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance. J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).
- Wang, L. D., Wagers, A. J. Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).
- Schofield, R. The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).
- Bischoff, R. Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers. Development. 109 (4), 943-952 (1990).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators. Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Lewandowski, D., et al. In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Xie, Y., et al. Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging. Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).
- Köhler, A., et al. Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones. Blood. 114 (2), 290-298 (2009).
- Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells. J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).
- Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow. Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso,, C, From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Ellis, S. L., et al. The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Nombela-Arrieta, C., et al. Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment. Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).
