La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.
Attraverso un delicato equilibrio tra quiescenza e la proliferazione, auto rinnovamento e produzione della progenie differenziate, le cellule staminali ematopoietiche (CSE) mantengono il fatturato di tutte le linee cellulari del sangue mature. Il coordinamento dei segnali complessi che portano a specifici sorti HSC si basa su l'interazione tra cellule staminali emopoietiche e l'intricato microambiente del midollo osseo, che è ancora poco conosciuta [1-2].
Noi descriviamo come combinando un portacampione di nuova concezione per il posizionamento stabile animale con multi-step e confocale a due fotoni in tecniche di imaging in vivo, è possibile ottenere pile 3D ad alta risoluzione contenenti HSPCs e le loro nicchie circostanti e di monitorarle nel tempo attraverso multi-point time-lapse imaging. Imaging ad alta definizione permette ex vivo di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche etichettati rilevamento (HSPCs) che risiedono all'interno del midollo osseo. Inoltre, multi-point time-lapse imaging 3D, obtained con le impostazioni di acquisizione più veloci, fornisce informazioni precise sul movimento HSPC e le interazioni reciproche tra HSPCs e cellule dello stroma.
Monitoraggio di HSPCs in relazione alla GFP cellule osteoblastiche positivo è dato come applicazione esemplare di questo metodo. Questa tecnica può essere utilizzata per monitorare qualsiasi ematopoietiche o cellule stromali adeguatamente etichettati di interesse all'interno del mouse cranica spazio midollo osseo.
Nonostante nicchie di cellule staminali siano riconosciute per decenni 3 e ben caratterizzati in molti tessuti come il bulbo olfattivo, la fibra muscolare, capelli follicolo rigonfiamento o CNS zona subventricolare 4-7, le interazioni tra le cellule staminali ematopoietiche (CSE) e midollo osseo (microambiente BM) sono ancora poco conosciuta a causa della difficoltà di osservare direttamente singole cellule attraverso l'osso e la natura estremamente fluida del tessuto stesso. E 'stato dimostrato, attraverso una serie di studi funzionali sulla base di ablazione o sovraespressione di geni specifici in entrambe le cellule staminali emopoietiche o le cellule stromali del microambiente in sé, che una rete intricata di diversi tipi di cellule e segnali di regolamentazione è responsabile della regolazione del delicato equilibrio tra quiescenza , la proliferazione, l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali emopoietiche 1-2. Il crosstalk tra CSE e le loro nicchie può essere compresa a fondo solo attraverso l'osservazione diretta. Questo è achievable grazie allo sviluppo di protocolli di imaging avanzate, combinando la tecnologia disponibile non solo in termini di microscopia, ma anche di soluzioni di supporto del campione e del software di acquisizione.
Risoluzione cella singola imaging dal vivo di staminali e progenitrici ematopoietiche (cellule trapiantate HSPCs) nel vano BM delle calvaria del mouse ossa ha mostrato che HSPCs engrafting localizzano in prossimità dei vasi SDF-1 e VCAM-1-positivi 8-9 e che le cellule più immature si trovano nel raggio di 15 – 20 micron da cellule osteoblastiche GFP-positive (linea di topi transgenici Col2.3-GFP, in cui il promotore collagene 1α osteoblasti-limitato spinge l'espressione della GFP), mentre la loro progenie sono più distale 10. Osservazioni simili sono stati ottenuti da sezionati e ossa fratturate femore 11 e dalle diluiti ossa tibeal 12. Imaging del cranica midollo osseo rimane l'approccio meno invasivo per ottenere la visualizzazione diretta di HSPCs all'interno thEIR microambiente nativo.
Con qualsiasi di imaging esemplare vivo è un bisogno innato di mantenere il campione più fermo possibile per evitare inutili artefatti dovuti al movimento del campione. La respirazione provoca movimenti oscillatori della testa del mouse, che devono essere evitati durante l'imaging cranica midollo osseo. Titolari stereotassica convenzionali, utilizzati ad esempio per l'imaging del cervello e elettrofisiologia, non sono adatti per l'imaging cranica perché ostruiscono le ossa frontali. Partendo da un supporto per mouse utilizzato per minimizzare il disagio durante gli studi di imaging ed elettrofisiologia vivi 13, un supporto 2 componente è stato sviluppato, con un piccolo pezzo fissato alla testa del mouse per creare una finestra di imaging collegato ad un braccio grande garantire tenuta stabile con un piastra di base pesante che assicura saldamente nella fase microscopio. Fissaggio del pezzo testa al cranio del mouse permette respirazione libera mentre ancora immobilizzare la testa a posto e l'eliminazione adeguatamente movements dovuti alla respirazione. Un meccanismo 'lock-and-chiave' collega la testa pezzo al corpo porta permette la dimensione della finestra deve essere minimizzata così come una maggiore accuratezza di posizionamento, pertanto semplificare l'intervento chirurgico, e la forma della piastra di base nella fase permette un allineamento accurato sul microscopio. Per monitorare accuratamente cellule mobili, un protocollo lasso di tempo multi-punto è stato progettato per consentire il monitoraggio delle cellule nel tempo di 5 min intervalli tra i punti di tempo. CSE Qui, ha etichettati vengono iniettati in col2.3GFP osteoblasitc giornalista topi 10,14 e ripreso a circa 20 ore più tardi. Il supporto per mouse che è stata creata e le impostazioni di imaging necessari per eseguire una rapida multi-point time-lapse imaging delle stesse aree in un periodo di ore multipli sono descritte in dettaglio.
Che cosa è stato realizzato?
Il protocollo utilizza l'imaging multi-dimensionale time-lapse per monitorare la migrazione di FACS purificato, ex vivo etichettati, HSPCs trapiantati nel topo cranica midollo osseo. Identificazione delle cellule trapiantate singole è stato raggiunto e queste sono state monitorate per periodi prolungati di tempo (ore) con elevata precisione. Respirazione artefatti da movimento indotte sono state ridotte al minimo e le cellule sono state ripetutamente reimaged nel corso di un tempo-corso prolungato.
Quali sono le indicazioni per il futuro?
Sviluppo della tecnica potrebbe progredire verso esperimenti di recupero per consentire l'imaging su più giorni, nel corso di una settimana o più e l'uso di anestetici gas come isoflurano per abbreviare e semplificare il processo di recupero per il mouse (Nota: esperimenti di recupero richiedono rigorosamente Condizioni di chirurgia sterili e somministrazione di analgesici appropriati). DevURALE di un grande colore-tavolozza dei coloranti in vivo, nonché l'etichettatura genetica efficiente delle cellule ematopoietiche faciliterà anche esperimenti multi-etichettatura, fornire un quadro più chiaro delle interazioni cellula-cellula all'interno del midollo osseo e consentire esperimenti più complessi in futuro. Inoltre, l'etichettatura simultanea di molteplici strutture del midollo osseo e dei componenti dello stroma fornirà un quadro più completo degli eventi che si svolgono in nicchie HSPC. Immagine stabilità dei film time-lapse potrebbe essere migliorata preacquisition stabilizzando il microscopio ulteriormente e ridurre al minimo i gradienti di temperatura nel campione e postacquisition utilizzando algoritmi di registrazione dell'immagine.
Limitazioni:
La tecnica descritta presenta alcuni limiti. La sopravvivenza di topi a seguito di somministrazione di anestetici iniettabili è imprevedibile ed è molto facile da complicazioni di esperienza a seconda della risposta individuale alanestetico. In generale, il più a lungo una sessione di imaging, più difficile è per il mouse per recuperare da anestesia ed è quindi importante pianificare con cura se il mouse deve essere recuperato, idealmente limitando la durata delle immagini lasso di tempo. L'uso di anestetici iniettabili limita il tempo di ogni sessione di imaging può durare. Mentre è possibile prolungare l'anestesia da readministering una piccola dose di anestetico, è difficile eseguire questa precisione e sovradosaggio il mouse è una delle più frequenti cause di cessazione anticipata di immagini in vivo. L'anestesia del gas è meno tossico e permette una sessione di imaging più iniziale, ma un rapido recupero del mouse dopo aver> 2 ore lungo la somministrazione di isoflurano è raramente successo. Un'altra limitazione della tecnica è limitata risoluzione delle immagini ottenibili durante multi-point time-lapse imaging, dovuta alla necessità di acquisire rapidamente immagini. Questo, accoppiato con deriva focale o campo di salti (discoussed sopra), può fare il monitoraggio delle cellule difficile.
Confronto con metodi alternativi:
HSPCs di solito sono etichettati con il colorante lipofilo ha fatto, ma dir e DII coloranti sono alternative equivalenti e altri coloranti cellulari possono essere utilizzati, purché sufficientemente luminoso, come rivisto in [16]. Anche se ex vivo etichettatura di cellule con DID ha mostrato di non pregiudicare la funzionalità a lungo termine di CSE, ha la limitazione che DID (o qualsiasi altro colorante chimico) viene diluita al momento divisione cellulare. Dal CSE proliferano durante i primi giorni successivi al trapianto, il rapporto segnale-rumore di queste cellule si deteriora rapidamente. Etichettatura endogena delle cellule mediante manipolazione genetica ed espressione di proteine fluorescenti è un metodo alternativo praticabile, purché le proteine fluorescenti sono espressi a livelli sufficientemente alti per generare il segnale rilevabile attraverso l'osso del cranio. Ci sono una serie di alternative tecniques disponibili per eseguire l'imaging del HSPCs all'interno dello spazio midollare, ciascuno con i propri vantaggi e limitazioni. Inserimento di dispositivi di imaging a base di fibre ottiche ha permesso per l'imaging del midollo osseo ricostituzione in ossa lunghe [8], mentre l'imaging confocale dopo esposizione chirurgica della tibia e l'assottigliamento dello smalto osso con un trapano chirurgico [12] hanno prodotto immagini dettagliate di HSPCs residenti in le aree periferiche delle ossa lunghe. Questi metodi tuttavia sono molto più invasivo di quello descritto qui e quindi non consentono di ripetere sessioni di imaging incentrate sulla stessa area midollo osseo all'interno del mouse stesso. Inoltre, è possibile che queste tecniche possono influenzare le cellule osservate in risposta inevitabile ingenti danni nel tessuto circostante. HSPCs hanno ripreso per brevi periodi di tempo attraverso lamelle poste sopra asportati, femori fratturati [11], ma l'impatto di questa dura preparazione del tessuto su HSPCs non è clear e la tecnica è stata utilizzata unicamente per ottenere osservazioni singole punto di tempo. Ossa fissi sono stati sezionati in sezioni seriali, macchiato, e le immagini ottenute ricostruito in un modello 3D, fornendo un'eccellente risoluzione in 3D, soprattutto quando si utilizzano calchi vascolari [17], e, recentemente, Laser Scanning Citometria (LASC) è stato utilizzato per ottenere quantitativa Misure circa HSPCs in situ, evidenziate da immunocolorazione [18], ma non sono in grado di fornire alcuna informazione temporale sul comportamento delle cellule. Le tecniche descritte in questa nuova tecnica forniscono una combinazione di buona risoluzione in 3D, sufficiente campionamento temporale per monitorare le cellule in 4D e sono relativamente non invasiva, offrendo quindi un approccio ideale per raggiungere il monitoraggio a lungo termine di HSPCs interagire con il midollo osseo microambiente.
The authors have nothing to disclose.
Imaging è stata condotta su un montante microscopio confocale Leica SP5 si trova all'interno della struttura FILM dell'Imperial College di Londra, gestito dal dottor Martin Spitaler.
Il titolare del campione e testata è stata fatta in collaborazione con il dipartimento di Ingegneria Chimica dell'Imperial College di Londra, con la consulenza di Samuel Jones e il dottor Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz e personale CBS presso l'Imperial College sono stati fondamentali per la loro assistenza e consulenza sul mouse allevamento. Mark Scott è finanziato dal HFSP e FILM, Olufolake Akinduro da CRUK e Cristina Lo Celso da CRUK, KKLF, BBSRC e HFSP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |