Summary
Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.
Abstract
Durch eine feine Balance zwischen Ruhe und Proliferation, Selbsterneuerung und die Produktion von Nachkommen differenziert, hämatopoetische Stammzellen (HSC) halten die Umsatz aller reifen Blutzelllinien. Die Koordination der komplexen Signale, die zu spezifischen HSC Schicksal beruht auf der Wechselwirkung zwischen HSCs und die komplizierte Knochenmark-Mikroumgebung, die noch wenig bekannt ist [1-2].
Wir beschreiben, wie durch die Kombination eines neu entwickelten Probenhalter zur stabilen Positionierung Tier mit mehrstufiger konfokalen und Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebungstechniken, ist es möglich, hochauflösende 3D-Stapel enthält HSPCs und ihrer Umgebung Nischen zu erhalten und sie im Laufe der Zeit zu überwachen durch Mehrpunkt-Zeitraffer-Bildgebung. High-Definition-Bildgebung ermöglicht Erfassung ex vivo markierten hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark wohnen. Darüber hinaus Multi-Point-Zeitraffer-3D-Bildgebung, omit schneller Erfassungseinstellungen btained, liefert genaue Informationen über HSPC Bewegung und die wechselseitigen Interaktionen zwischen HSPCs und Stromazellen.
Tracking HSPCs in Bezug auf GFP positive Osteoblasten als beispielhafte Anwendung des Verfahrens gezeigt. Diese Technik kann verwendet werden, um jede entsprechend markierten hämatopoetischen oder Stromazellen von Interesse innerhalb der Maus Schädelknochenmarkraum zu verfolgen.
Introduction
Trotz Stammzellnischen mit 3 Jahrzehnten erkannt und auch, wie die Riechkolben, Muskelfaser, Haarfollikel Ausbuchtung oder ZNS Subventrikularzone 4-7 in vielen Geweben gekennzeichnet, die Interaktionen zwischen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) und Knochenmark-Mikroumgebung ( BM) sind immer noch schlecht wegen der Schwierigkeit der Beobachtung einzelner Zellen direkt durch den Knochen als auch die extrem flüssige Natur des Gewebes selbst verstanden. Es hat sich gezeigt, durch eine Reihe von Funktionsstudien auf der Basis Abtragen oder Überexpression bestimmter Gene entweder in HSCs oder den Stromazellen des Mikroumgebung selbst, dass ein komplexes Netzwerk verschiedener Zelltypen und Regelungssignale zum Regeln der empfindliche Gleichgewicht zwischen Ruhe verantwortlich , Proliferation, Expansion und Differenzierung von HSCs 1-2. Das Übersprechen zwischen HSC und ihre Nischen in der Tiefe nur durch direkte Beobachtung zu verstehen. Dies ist achievable dank der Entwicklung von fortschrittlichen Abbildungsprotokolle, die Kombination der Technik nicht nur in der Mikroskopie, sondern auch der Probenhalter-Lösungen und der Erfassungssoftware.
Einzelzellauflösung die Bildgebung von transplantierten hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) im BM Fach der Maus Calvaria Knochen zeigte, dass engrafting HSPCs lokalisiert in der Nähe von SDF-1 und VCAM-1-positiven Gefäße 8-9 und unreifer Zellen 20 Mikrometer von GFP-positiven Osteoblasten (Col2.3-GFP transgenen Mauslinie, in der der Osteoblasten-beschränkt Kollagen 1α Promotor treibt GFP-Expression), während ihre Nachkommen sind mehr distalen 10 - innerhalb von 15 gefunden. Ähnliche Beobachtungen wurden von seziert und gebrochenen Oberschenkelknochen 11 und von ausgedünnten Knochen tibeal 12 erhalten. Abbildung von Schädelknochenmark bleibt die am wenigsten invasive Ansatz zur direkten Visualisierung der HSPCs innerhalb th erreichenEIR nativen Mikroumgebung.
Mit jedem lebendes Exemplar Bildgebung gibt es eine inhärente Notwendigkeit, die Probe so ruhig wie möglich zu halten, um unnötige Artefakte durch Probenbewegung zu vermeiden. Atmung verursacht Schwingungsbewegungen der Maus den Kopf, die vermieden werden, wenn die Abbildung Schädelknochenmark müssen. Herkömmlichen stereotaktischen Inhaber, zum Beispiel für bildgebende und elektrophysiologische verwendet werden, sind nicht geeignet für die Bildgebung Schädeldach, weil sie behindern die Stirnknochen. Ausgehend von einer zur Not während der Live-Bildgebung und Elektrophysiologie Studien 13 minimieren Maushalterung wurde ein 2-Komponenten-Halter entwickelt, mit einem kleinen Stück an den Kopf der Maus fixiert, um ein bildgebendes Fenster zu einer größeren Arm verbunden ist gewährleistet sicheren Halt mit einem erstellen schwere Grundplatte, die fest in den Mikroskoptisch befestigt ist. Sicherung des Kopfteils auf den Schädel der Maus erlaubt die freie Atmung, während noch Immobilisierung der Kopf an Ort und Stelle und angemessen zu beseitigen movements aufgrund der Atmung. Ein "Schlüssel-Schloss-Schlüssel-Mechanismus verbindet das Kopfstück an dem Haltekörper erlaubt die Größe des Fensters, und minimiert eine erhöhte Positioniergenauigkeit, daher eine Vereinfachung der Operation und der Sitz der Grundplatte in die Stufe ermöglicht eine genaue Ausrichtung auf dem Mikroskop. Um bewegliche Zellen genau zu überwachen, wurde ein Multi-Point-Zeitraffer-Protokoll, das zum Verfolgen von Zellen im Laufe der Zeit mit 5-Minuten-Intervallen zwischen den Zeitpunkten zu ermöglichen. Hier tat beschriftet HSK sind in col2.3GFP osteoblasitc Reporter Mäusen injiziert 10,14 und ca. 20 Stunden später abgebildet. Die Maus Halter, entwickelt und die Bildeinstellungen erforderlich, um eine schnelle Mehrpunkt-Zeitraffer Abbildung der gleichen Bereiche über einen Zeitraum von mehreren Stunden durchgeführt werden detailliert beschrieben.
Protocol
Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren werden nach der lokalen Gesetzgebung durchgeführt. Unsere Arbeit wird von der britischen Home Office sowie die Imperial College ethischen Prüfungsausschuss genehmigt. Die zulässigen Verfahren werden in der Projekt Lizenz-Dokumentation beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlbefinden des Tieres zu jeder Zeit zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, um die Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes, wo die Arbeit ausgeführt wird halten.
1. Kennzeichnung und Injektion von HSPCs:
- Ernte-Zellen wie von Lo Celso 14-15 beschrieben.
- Vorbereitung der Zellen bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml in PBS. HINWEIS: Verwenden Sie ein Hämozytometers oder die Informationen von der Zellsortierer vorgesehen, um die Zellen zu zählen; die Anzahl der Zellen, die markiert und injiziert werden, variiert in Abhängigkeit vom Zelltyp (zum Beispiel Flecken 10.000 - 20.000 HSCs, 100.000 - 300.000 HPC); Wenn die Arbeit mit weniger als 10 5 Zellen, Resuspendieren in 100 ul PBS; es ist wichtig, um die Zellen in PBS ohne Serum haben, wie Serum hemmt die Färbung.
- DiD hinzufügen, um die Zellsuspension in einer Endkonzentration von 5 uM und vortexen Suspension unmittelbar um den Farbstoff zu gewährleisten nicht aus der Lösung ausfällt, und nicht, um die Zellen zu markieren.
- Inkubieren für 10 min bei 37 ° C waschen durch Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min, Dekantieren der Flüssigkeit und Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen für die IV-Injektion (~ 100 bis 150 ul)
- Resuspendieren der Zellen in 200 ul PBS und sammeln in eine Insulinspritze. HINWEIS: einer Insulinspritze über eine herkömmliche Spritze zu empfehlen, da sie keine Nadel Totraum und somit ermöglicht die Verwaltung des gesamten Zellsuspension auf der Maus.
- Injizieren Zellen in eine letal bestrahlten Maus über Schwanzveneninjektion. HINWEIS: Die Bestrahlung hat bekannt ist, erhebliche Auswirkungen auf die Knochenmark-Mikroumgebung (beide hämatopoetischen und Stromazellen Komponenten), die über ti entwickeltmich. Es ist daher sehr wichtig, eine konsistente Timing für Bestrahlung Zellinjektion (4 bis 24 Stunden aus der Bestrahlung für die besten Transplantation) und Abbildungs beizubehalten. Hier Bestrahlung 6 Stunden vor der Injektion durchgeführt und Imaging wird 20 Stunden nach der Injektion durchgeführt.
- Platzieren Sie die Maus in eine warme Kammer (37 ° C), bis die Schwanzvenen erscheint vasodilated.
- Bewegen Sie die Maus in die Restrainer und vorsichtig die Nadel in die Schwanzvenen.
- Injizieren der Zellen in die Vene - kein Widerstand Injektion sollte auftreten.
- Lassen Sie die Maus O / N, damit die Zellen, die den Knochenmarkräumen zu migrieren.
2. Vorbereiten der Maus für Imaging
- Autoklavieren einer feinen Pinzette und ein Paar von einer feinen Schere sowie ein Kopfstück vor der Verwendung und Speicherung in einer sterilen Umgebung.
- Make up Betäubungsmittel so frisch wie möglich, (0,38 ml Ketamin + 0,25 ml Medetomidin + 4,47 ml Wasser). HINWEIS: otihr genehmigt Anästhetika, einschließlich Isofluran und anderen injizierbaren, wirksam sein wird auch. Die beschriebene Cocktail ist zu intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht mit Top-ups von 30 verabreicht werden, - 50 ul verabreicht alle 45 min bis 1 Stunde.
- Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser bei Bedarf starten Sie dann das Mikroskop und die Software, die Kalibrierung der Bühne, wenn Sie dazu aufgefordert. Schalten Sie den Laser und es ihnen ermöglichen, sich aufzuwärmen und zu stabilisieren, während der Vorbereitung der Maus für die Bildgebung.
- Betäuben die Maus mit der vorbereiteten Mischung von Anästhetika (Schritt 2.2) für die gewählte Narkose durch intraperitoneale Injektion. Überwachen das Auftreten von tiefen Narkose über Pedal-Reflex jetzt und in regelmäßigen Abständen während des Protokolls. HINWEIS: Die Maus muss sorgfältig während des gesamten Verfahrens überwacht werden und wenn Anästhesie zu sein scheint Aufhellung (typischerweise nach 45 - 60 min) zu verwalten dann ein Top-up-Dosis (wie in 2.2 beschrieben). Erwarten, dass einige Unterschiede zwischen den Mäusen unterschiedlichen Alters und Geschlechts. Es ist wichtig, die Anästhesie-Protokoll mit Ihrem örtlichen Tierarzt besprechen, angemessene Vorkehrungen getroffen werden, um sicherzustellen, das Wohl des Maus zu gewährleisten.
- Tupfer die Oberseite der Kopfhaut mit 70% Ethanol auf einem Gewebe, sicherzustellen, keine Ethanol in den Augen der Maus erhalten.
- Mit einer sterilen Pinzette und Schere, entfernen Sie vorsichtig den zentralen Teil der Kopfhaut, um das Schädeldach abzubildenden Fläche freizulegen: einen kleinen Schnitt an der Rückseite des Kopfes zwischen den Ohren durch Anheben der Haut mit der Zange. Halten Sie die Haut auf, schieben Sie die Schere unter die Haut sanft und entlang der Außenseite des gewünschten Abbildungsbereich geschnitten.
- Wischen Sie die freiliegenden Knochen mit sterilem Wattestäbchen mit sterilem PBS befeuchtet, um sie feucht zu halten.
- Befestigen Sie die Metallkopfstück auf den Schädel der Maus bereit für die Bildgebung.
- Mischen eine ausreichende Menge an Dentalzement in einem Wägeschiffchen bis pastös wird und schnell anwenden, um die Bodenfläche des Kopfstückes, der dem n befestigen wirdKull.
- Vor den Zement-Sets, legen Sie das Kopfstück auf den Schädel der Maus, um sicherzustellen, keine Zahnzement auf dem Imaging-Bereich zu bekommen, dann warten, bis es eingestellt.
- Tragen Sie eine kleine Menge des Intrasite Hydrogel, das der Schädel feucht hält.
- Befestigen Sie das Kopfstück an den Halter und befestigen Sie sie mit der Schraube, so dass die Nuten passen in die Halterung Kerben.
- Entfernen Sie das Hydrogel aus dem Schädel mit sterilen Wattestäbchen und sauber und mit sterilem PBS vor der Übertragung auf die Lupe.
- Legen Sie den Halter in die Mikroskoptisch, positionieren Sie die Heizmatte unter der Maus, legen Sie die rektale Temperaturfühler und sichern Sie alles, was an Ort und Stelle auf der Bühne mit Klebeband.
- Setzen Sie einen kleinen Tropfen Augensalbe auf die Augen der Maus, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen, während der Narkose. Hinweis: die Maus nicht unbeaufsichtigt zu jeder Zeit während des Abbildungsprozesses bleiben, während sie unter Anästhesie.
In-vivo-Imaging: Hochauflösende Stacks und Zeitraffer-Akquisition
- Konzentrieren Sie sich auf den Schädel über die Okulare.
- Füllen Sie den Imaging-Fenster mit gereinigtem, steriles Wasser und mit einem Wassertauch Objektiv, senken Sie es so, dass es die Wassertropfen berührt.
- Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite des Schädels mit den Mikroskop-Okulare mit einem externen Lampe als Lichtquelle.
- Positionieren Sie den Imaging-Bereich auf der zentralen Naht und in Richtung der Rückseite des Kopfes, um die Kranznaht als Ausgangsposition zu finden.
- Stellen Sie das Mikroskop bis zu effektiven Anregung und Detektion der in der Anregungs-und Emissions Tabelle angegebenen entsprechenden Fluorophore ermöglichen. HINWEIS: während eine Leica SP5 konfokalen aufrecht mit einem herkömmlichen Galvanometer Scan-Kopf läuft die LAS AF-Software-Plattform wird hier verwendet, kann das Verfahren leicht in anderen Mikroskop / Software-Plattformen repliziert werden. Das hier verwendete Objektiv ist das Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA but gleichwertige Objektive anderer Hersteller sind mit den geeigneten Vergrößerung und hoher NA
- Legen Sie die Software in einen Modus, um beide XY Bilder sowie eine 3D-Z-Stapel und setzen Abbildungsgeschwindigkeit bis 400 Hz und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel aufnehmen. HINWEIS: Der Aufbau und Hardware hier ergeben ein Sichtfeld von 620 um, und dies kann auch auf anderen Plattformen unterscheiden.
- Stellen Sie die Software, so dass mehrere Kanäle / Tracks können erfasst werden, sowie die Gewährleistung, dass die Sammlung Verfahren wird eingestellt, um Einstellungen zwischen den Stapeln, wenn möglich, oder zwischen den Bildern zumindest zu ändern. Einrichten 3 unabhängige Aufnahmeeinstellungen, Abschalten der Laserbeleuchtung am Ende der Akquisition eines jeden Stapels. HINWEIS: drei Kanäle werden für dieses Verfahren erforderlich, um Übersprechen zwischen den Kanälen zu reduzieren.
- Nehmen Sie die Einstellungen für den ersten sequentiellen Scan für die Zwei-Photonen-SHG Knochensignal (840 nm Anregung, 400 bis 440 nm Emission); öffnen Sie die Klappe für den MP-Laser und sicherzustellen, MP-Verstärkung und Offset ordnungsgemäß eingerichtet sind, ist die Laserleistung von 12,5 bis 25% und der Laser eingeschaltet ist. Wählen Sie einen geeigneten PMT als die einzige Detektor und die Farbe Weiß. Hinweis: NDD-Detektoren mit entsprechenden Filtern sollte für die Knochenerkennung verwendet, wenn verfügbar, eine hellere, tiefer Signal zu erreichen.
- Wiederholen Sie für die GFP-Kanal für eine kombinierte Autofluoreszenz verwendet Kanal-Setup-Verfahren (543 nm Anregung, 560 - 600 nm Emission) und tat (633 nm Anregung, 650 bis 720 nm Emission) unter den zweiten Einstellungen zu scannen, die Verwendung von zwei entsprechenden PMTs. Ändern Sie den Kanal Farbe zu grün für die Autofluoreszenz und rot für die DID. Hinweis: Die Verwendung grün wie die Auto-Fluoreszenz-Kanal ermöglicht eine einfachere Erkennung von DiD-positiven Zellen, wenn die beiden Kanäle werden überlagert - autofluoreszierenden Zellen erscheinen als gelb / orange, da auf sie in beiden Kanälen während DiD Zellen erscheinen nur als rot, da sie in der nur angezeigt, DiD-Kanal. Die Autofluoreszenzkanalnur für diesen Vergleich verwendet und ist in keiner Letztlich verwendet, jedoch, wenn der Benutzer, kann dieser zu einer anderen Farbe geändert werden wünscht für Anzeigezwecke zu Verwechslungen mit dem GFP-Kanal zu vermeiden.
- Schließlich Setup der dritte und letzte Scan für GFP (488 nm Anregung, 500 bis 530 nm Emission); sicherzustellen, dass der Verschluss offen ist, wenn erforderlich, und dann die Laserleistung der 488 nm Laserlinie auf rund 15% oder ein angemessenes Niveau für die Laser verwendet wird, wählen Sie eine entsprechende PMT als einzige aktive Detektor und ändern ihre Falsch auf grün.
- Aktivieren Sie einen "Live"-Bildaufnahmemodus, um eine Vorschau-Scan des gewählten Kanals beginnen und stellen Detektor Gain und Offset für die optimale Belichtung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Scan in der sequentiellen Fenster.
- Speichern Sie die Einstellungen dieser Multi-Channel-Scans für die einfache Wiederverwendung. ANMERKUNG: Dies ermöglicht dem Benutzer die Einstellungen in nachfolgenden Sitzungen laden.
- Aktivieren Sie Multi-Positions-Übernahme, als "Mark bezeichnet einnd Suchen 'in der demonstriert Software und die Koordinatenpunkte zurückzusetzen.
- Scannen Sie den Knochen Imaging-Bereich, ausgehend von der Kreuzung zwischen der zentralen und Kranznaht, scannen die Tiefe der Knochenmark-Bereich mittels sowohl Autofluoreszenz (pseudo grün gefärbt) und tat (pseudo-rot gefärbt) mit einem Composite-Ansicht. HINWEIS: autofluoreszierenden Zellen in beiden Kanälen vorhanden sein und erscheinen in dem zusammengesetzten Bild orange / gelb in der Erwägung, DiD markierten Zellen werden als rot-Zellen nur in dem zusammengesetzten Bild angezeigt wird.
- Wenn eine Zelle erkannt wird, markieren Sie diese als neue Koordinatenposition (x, y und z) in der "Mark und Finden"-Tool, indem Sie auf das Fenster "Add New Positions-Icon auf der linken Seite der" Mark und Finden " .
- Wenn die aktuelle Sichtfeld untersucht worden ist, bewegen Sie die Bühne der Abstand von einem Sichtfeld entweder links / rechts / unten / oben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Feld aus gesehen, nach und nach die rund um die gesamte Imaging-Fensterbereich auf der linken Seite von thE zentralen Naht, Richtung Nase der Maus. Sobald die zentrale Naht Bifurkation in Sicht ist, auf der rechten Seite der Naht bewegen und wiederholen Sie den Vorgang Scannen der linken Seite in der umgekehrten Richtung (dh in Richtung der Kranznaht). Markieren Sie die Koordinaten aller neuen Zellen von Interesse mit der "Mark und Finden"-Tool.
- Wenn der Scanvorgang des Abbildungsfenster abgeschlossen ist, verwenden Sie die 'Mark und Suchen' Werkzeug, um die Punkte zu überprüfen (wählen Sie den gewünschten Punkt und überprüfen Sie jeden Punkt einzeln). Stellen Sie den oberen und unteren Rand eines Z-Stapel um jede Zelle für jede Position, (viele Software-Plattformen können Sie unabhängige Z-Stapel für jede Position, die Erfassung reduziert leeren Raum durchführen). Für jeden Punkt, den Schwerpunkt nach oben und unten und oben und unten gesetzt Z-Positionen für 3D-Z-Stapel-Erfassung und Aktualisierung der einzelnen Punkt in der "Mark und Suchen '. Set Z-Stapel-Intervall bis 5 um und Mittelung für jeden sequentiellen Scan Kanals auf eine geeignete Qualität: or Rahmen Durchschnitt. HINWEIS: Die Erhöhung der Anzahl der Scans zu mitteln erhöht die Länge des Erfassungszeit.
- Erwerben Sie eine qualitativ hochwertige Referenz Stack für jeden Punkt von Interesse, indem Sie den gesamten Scanverfahren (oft als 'Start' und nicht als "Aufnahme" bezeichnet). HINWEIS: Dieser Scan kann als Referenz für zukünftige Hochgeschwindigkeitsaufnahmen handeln.
- Einmal mit den hochwertigen Scan abgeschlossen ist, ein Zeitraffer-Einstellung für die Erfassung zu aktivieren.
- In den Zeitraffer-Einstellungen, das Zeitintervall bis 5 min und Gesamtlaufzeit auf die gewünschte Länge (zB 5 h). "Übernehmen" diese Einstellungen auf die Gesamt Scan. HINWEIS: Um diese Scan-Zeit, eine 5 Minuten-Intervall Zeitraffer ermöglichen zu reduzieren, kann man brauchen, um die Anzahl der Scans zur Mittelwertbildung zu reduzieren, die Auflösung auf 512 x 512 Pixel zu begrenzen, konvertieren Sie das Scannen, um die bidirektionale (mit Phasenkorrektur erforderlich beide Scanrichtungen ausrichten), und / oder die Scan-Geschwindigkeit bis 600 Hz oder mehr (mehr als 600Hz verursachen Zoomen des Bildaufnahmebereich für die Software-Plattform gezeigt). Es ist auch wichtig zu beachten, dass, während eine fortlaufende Aufnahmemodus wurde verwendet, um eine hohe Bildqualität Stapel zunächst zu erwerben, wird die gleichzeitige Erfassung verwendet werden, um Geschwindigkeit während der Zeitraffer-Bildgebung zu erhöhen - dies kann in einigen leichten Übersprechen zwischen den Kanälen, die zusätzliche Plätze entstehen Wert auf die Ersterfassung der genau getrennt Referenz Stacks.
- Beginnen Imaging (wie zuvor durch Klicken auf die Schaltfläche "Start" in der nachgewiesen Software). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Ebene der Anästhesie durch Verabreichung weitere, kleinere Dosen, wenn nötig, man aufpassen, nicht überdosieren, um die Maus zu halten, regelmäßig oben das Wasser, um das Ziel sicherzustellen, trocknet nicht aus und Vital und Heizung-Pad Temperatur überwachen gesamten.
- Wenn Sie fertig sind, heben Sie das Objektiv von der Halterung und entfernen Sie dann den Halter aus dem Mikroskoptisch, wodurch die Kabel von der rektalen Sonde und hEssen Matte nicht beschädigt werden.
- Das Kopfstück abschrauben von der Bühne Halter und die Maus sorgfältig zu entfernen. Keulen die Maus mit Genickbruch und entfernen Sie die Metallkopfstück durch Einrasten es aus dem Schädel. Daten auf Festplatte speichern und übertragen, um Server für eine spätere Analyse. HINWEIS: Das Kopfstück ist ideal durch Eintauchen in Aceton für ein paar Stunden und schließlich das Reiben der Zementreste aus gereinigt.
Representative Results
Das maßgeschneiderte, hochpräzise Maus Halter mit einem Schädeldach bildgebenden Fenster können längere Darstellung von FACS gereinigt, beschriftet HSPCs in letal bestrahlte Empfängermäuse (Abbildung 1A) injiziert. Typischerweise wird nach Injektion von zwischen 15 bis 20.000 markierten Zellen sind 8 bis 15 Zellen normalerweise im Knochenmark Abbildungsbereich des Schädels am folgenden Tag erkennbar. Hier wird gezeigt, wie man einzelne Zelle auflösende 3D-Stapel von HSPC haltigen Knochenmark Bereichen von etwa 90 zu erwerben - 120 um Dicke, (Abbildung 1B), gefolgt von 4D Zeitraffer-Filme der identifizierten HSPCs (Abbildung 1C und Film).
Suboptimale Ergebnisse werden erhalten, wenn das Dentalzement nicht optimal hergestellt, beispielsweise das Wasser konnten aus nicht abgedichteten Bereichen entweichen, und auch wenn es sich von der Oberseite des Halters füllt werden, einem Zeitraum, in dem die Linse nicht getaucht in Wasser führt zu schwarzen f Rames. Einige Drift in den Bildern ist unvermeidlich aufgrund der thermischen Ausdehnung der Materialien der Maushalterung, jedoch kann es durch suboptimale Zement Haftung akzentuiert werden, was zu progressive Ablösung der Maus und durch Störungen der Bildgebung einzurichten, was zu plötzlichen Sprüngen der Fokus während Zeitraffer-Bildgebung. Drift während Multi-Point-Zeitraffer-Bildgebung kann auch durch Ungenauigkeiten in der Bühnenbewegungen beim Besuch zuvor abgebildeten Positionen verursacht werden. Drift und stottern Artefakte in Zeitraffer-Filme können durch Verwendung von Bildregistrierungsalgorithmen korrigiert werden.
Tabelle 1. Anregung und Emissions Einstellungen.
| Farbe-Kanal | Erregung | Emission |
| GFP | 13px; "> 488 nm500-530 nm | |
| Autofluoreszenz | 543 nm | 560-610 nm |
| DiD | 633 nm | 640-700 nm |
| SHG | 840 nm (MP) | 400-450 nm |
Abbildung 1. In-vivo-4D-Bildgebung von HSPCs in Mausschädeldach. (A) Überblick über das Experiment (B - C).. Beispiele für Ergebnisse erzielt (B) 2D-Schichten aus einem 3D-Stapel (Gesamttiefe beträgt 114 Mikrometer), enthält Signal von Kollagen Knochen (weiß), DiD-markierten Zellen (rot) , autofluoreszierenden cells (gelb) und Osteoblasten (grün). Maßstabsbalken:. 100 um (C) 2D-Scheiben von einem 4D Zeitraffer-Film zeigt eine DID markierten HSC (rot) Migration in der Nähe der Osteoblasten (grün). Die gestrichelte Linie verdeutlicht die Verschiebung der Zelle. Maßstabsbalken: 50 um (B) und 100 um (C). . HINWEIS: Der von der Zeitraffer-Akquisition in (C) erhalten Film wird während der Video-Artikel gezeigt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Was wurde erreicht?
Das Protokoll verwendet Zeitraffer mehrdimensionale Bildgebung, um die Migration der FACS gereinigt, ex vivo markiert transplantiert HSPCs in Mausschädelknochenmark zu überwachen. Identifizierung von einzelnen transplantierten Zellen wurde erreicht und diese über längere Zeit (hr) mit hoher Genauigkeit überwacht. Atem induzierten Bewegungsartefakten wurden minimiert und die Zellen wurden wiederholt über einen längeren Zeitverlauf reimaged.
Was sind zukünftige Richtungen?
Entwicklung der Technik könnte in Richtung Recovery-Experimente Fortschritte für die Bildgebung an mehreren Tagen zu ermöglichen, im Laufe von einer Woche oder mehr und Einsatz von Gas Anästhetika, wie Isofluran zu verkürzen und zu vereinfachen den Wiederherstellungsprozess für die Maus (Anmerkung: Recovery-Experimente erfordern streng sterile Operationsbedingungen und die Verwaltung der entsprechenden Analgetika). Entwicklerelopment einer größeren Farbpalette in vivo-Farbstoffe sowie effiziente genetische Kennzeichnung von hämatopoetischen Zellen erleichtert auch Mehrmarkierungsexperimente liefern einen besseren Einblick in die Zell-Zell-Interaktionen im Knochenmark und damit für komplexere Experimente in der Zukunft. Darüber hinaus wird die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Knochenmarkstrukturen und Stroma-Komponenten bieten ein vollständiges Bild der Ereignisse in HSPC Nischen. Bildstabilität der Zeitraffer-Filme könnten durch die Stabilisierung des Mikroskops weitere und Minimierung von Temperaturgradienten in der Probe und Akquisition führen unter Verwendung von Bildregistrierungsalgorithmen verbessert werden preacquisition.
Einschränkungen:
Das beschriebene Verfahren weist einige Einschränkungen auf. Überleben von Mäusen nach Verabreichung von Injektionsnarkose unvorhersehbar und es ist, es zu Komplikationen sehr einfach in Abhängigkeit von der individuellen Reaktion auf dieBetäubung. Im Allgemeinen ist das mehr ein Imaging-Sitzung das schwieriger für die Maus, um aus der Narkose zu erholen und es ist daher wichtig, sorgfältig zu planen, wenn die Maus zurückgewonnen werden, die Dauer der Zeitreihen-Aufnahmen bestens Begrenzung. Die Verwendung von injizierbaren Anästhetika begrenzt die Zeit jeden Imaging-Sitzung kann dauern. Während es möglich ist, die Anästhesie durch readministering eine geringere Dosis des Anästhetikums zu verlängern, ist es schwierig durchzuführen und dies genau eine Überdosierung der Maus ist eine der häufigsten Ursachen der vorzeitigen Beendigung der in vivo Bildgebung. Gasnarkose ist weniger toxisch und können für eine längere anfängliche Imaging-Sitzung, aber schnelle Erholung der Maus nach> 2 Stunden lang Verabreichung von Isofluran ist selten erfolgreich. Eine weitere Einschränkung der Technik ist die begrenzte Auflösung der Bilder, die während des Mehrpunkt-Zeitraffer Bildgebung gewonnen werden können, aufgrund der Notwendigkeit, schnell Bilder zu erwerben. Dies, gepaart mit der Brenn Drift oder Feld springt (discussed oben), kann machen Tracking von Zellen schwierig.
Vergleich mit alternativen Methoden:
HSPCs werden üblicherweise mit dem lipophilen Farbstoff markiert tat, aber DiR und DiI Farbstoffe äquivalente Alternativen und andere Zellfarbstoffe können, solange ausreichend hell verwendet werden, wie in [16] überprüft. Obwohl ex vivo-Markierung von Zellen mit gemeldet hat sich gezeigt, dass nicht auf die langfristige Funktion der HSCs, hat es die Einschränkung das hat (oder anderen chemischen Farbstoff) wird bei der Zellteilung verdünnt. Da HSCs in den ersten Tagen nach der Transplantation zu vermehren, das Signal-Rausch-Verhältnis für diese Zellen schnell verschlechtert. Endogenen Markierung von Zellen durch genetische Manipulation und Expression von fluoreszierenden Proteinen ist eine Alternative Verfahren, solange die fluoreszierenden Proteine in ausreichend hohen Mengen exprimiert, um das Signal über den Schädelknochen nachweisbar erzeugen. Es gibt eine Anzahl von alternativen techniques Verfügung Bildgebung HSPCs innerhalb der Markraum mit einer eigenen Vorteile und Einschränkungen durchzuführen, wobei jeder. Einführen des LWL-basierten Bildgebungsvorrichtungen erlaubt für die Bildgebung des Knochenmarks Rekonstitution in langen Knochen [8], während konfokale Bildgebung nach der chirurgischen Freilegung der Tibia und Verdünnung der Knochen Schmelz mit einem chirurgischen Bohrer [12] erzeugt detaillierte Bilder HSPCs Wohnsitz in Die Randbereiche der langen Knochen. Diese Verfahren sind jedoch weit mehr invasive als die hier beschriebenen und daher nicht zulassen, um Abbildungs-Sitzungen mit der gleichen Knochenmarkbereich innerhalb desselben Maus wiederholen. Darüber hinaus ist es möglich, dass diese Techniken können die beobachteten sichts der unvermeidlichen Reaktion auf erhebliche Schäden im umgebenden Gewebezellen beeinflussen. HSPCs wurden für kurze Zeit durch Deckgläser überschnitten, gebrochenen Oberschenkelknochen [11] gelegt abgebildet worden ist, ist nicht Clea jedoch die Auswirkungen dieser rauen Herstellung des Gewebes auf HSPCsr und die Technik wurde verwendet, um eindeutig einzelnen Zeitpunkt Beobachtungen zu erhalten. Feste Knochen wurden in Serienschnitte geschnitten worden und gefärbt, und die erhaltenen Bilder in ein 3D-Modell rekonstruiert und bietet hervorragende 3D-Auflösung, vor allem, wenn Gefäß Abgüsse verwendet werden [17], und vor kurzem Laser-Scanning-Zytometrie (LASC) verwendet wurde, quantitative zu erhalten Maßnahmen zu HSPCs in situ, durch Immunfärbung [18] hervorgehoben, sind aber nicht in der Lage, jede zeitliche Informationen über die Zellen Verhalten bieten. Die in dieser neuen Technik beschriebenen Techniken eine Kombination von guter Auflösung in 3D, ausreichende zeitliche Abtastung für die Überwachung der Zellen in 4D und sie sind relativ nicht-invasive, und bietet daher einen idealen Ansatz zur langfristigen Überwachung von HSPCs erreichen die Interaktion mit dem Knochenmark Mikroumgebung.
Acknowledgments
Imaging wurde an einer aufrechten Leica SP5 konfokalen Mikroskop in der Film Anlage vom Imperial College London, von Dr. Martin Spitaler verwaltet befindet durchgeführt.
Der Probenhalter und Kopfschmuck wurde in Zusammenarbeit mit dem Chemical Engineering Department of Imperial College London, mit Tipps von Samuel Jones und Dr. Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz und CBS Mitarbeiter am Imperial College waren maßgeblich für ihre Unterstützung und Beratung auf der Maus Haltung. Mark Scott wird von HFSP und Film, Olufolake Akinduro von CRUK und Cristina Lo Celso durch CRUK, KKLF, BBSRC und HFSP finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
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