Summary
הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.
Abstract
באמצעות איזון עדין בין קפאון ושגשוג, התחדשות עצמית וייצור של צאצאי הבדיל, תאי גזע hematopoietic (HSCs) לשמור על מחזור של כל שושלות תאי דם הבוגרים. התיאום של האותות המורכבים המובילים לגורל HSC ספציפי נשען על האינטראקציה בין HSCs וmicroenvironment המורכב מח עצם, שעדיין הוא הבין היטב [1-2].
אנו מתארים כיצד על ידי שילוב של בעל דגימה חדש שפותח עבור מיצוב בעלי חיים יציב עם confocal רב שלבים ושני פוטונים בטכניקות ההדמיה vivo, ניתן להשיג ערימות ברזולוציה גבוהה 3D המכילות HSPCs ונישות המקיפות ולפקח עליהם לאורך זמן באמצעות הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות. הדמיה בחדות גבוהה מאפשרת לתאי איתור vivo לשעבר שכותרת hematopoietic גזע ואב (HSPCs) המתגוררים בתוך מח העצם. יתר על כן, הדמיה 3D הזמן לשגות ריבוי נקודות, obtained עם הגדרות רכישה מהירות יותר, מספק מידע מדויק על תנועת HSPC והאינטראקציות ההדדיות בין HSPCs ותאי סטרומה.
מעקב של HSPCs ביחס לתאי osteoblastic GFP החיובי מוצג כיישום למופת של שיטה זו. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת כדי לעקוב אחר כל תא hematopoietic או סטרומה שכותרתו כראוי של עניין בתוך חלל מוח עצם calvarium העכבר.
Introduction
למרות נישות של תאי גזע שהוכרו במשך עשרות שנות 3 וגם מאופיינות ברקמות רבות כגון הנורה חוש הריח, סיבי שריר, בליטת זקיק שיער או אזור subventricular CNS 4-7, יחסי הגומלין בין תאי גזע hematopoietic (HSCs) וmicroenvironment מח עצם ( BM) עדיין לא נחקר מספיק בשל הקושי של ישירות התבוננות תאים בודדים דרך העצם, כמו גם את הטבע מאוד נוזל של הרקמה עצמה. הוכח, באמצעות מספר המחקרים התפקודיים המבוסס על ablating או overexpressing גנים מסוימים באו HSCs או תאי סטרומה של microenvironment עצמו, שרשת סבוכה סוגי תאים שונים ואותות רגולציה של אחראית להסדרת האיזון העדין בין quiescence , התפשטות, התרחבות והתמיינות של HSCs 1-2. Crosstalk בין HSCs והנישות שלהם ניתן להבין לעומק רק באמצעות תצפית ישירה. זה ACHתודה ievable לפיתוח פרוטוקולי הדמיה מתקדמות, המשלבת את הטכנולוגיה זמינה לא רק במונחים של מיקרוסקופיה, אלא גם של פתרונות בעל דגימה ושל תוכנת רכישה.
הדמיה חיה רזולוציה תא בודדת של תאים מושתלים hematopoietic גזע ואב (HSPCs) בתא BM של עצמות calvaria העכבר הראתה כי HSPCs engrafting למקם בקרבתו של כלי SDF-1 וVCAM-1-חיוביים 8-9 ושתאים לא בוגרים יותר נמצאים בתוך 15 - 20 מיקרון מתאי osteoblastic GFP החיובי (קו Col2.3-GFP מהונדס עכבר, שבו יזם 1α קולגן מוגבל תא העצם מניע ביטוי של GFP) ואילו הצאצאים שלהם הם יותר דיסטלי 10. תצפיות דומות התקבלו מעצמות ירך גזורים ושבורות 11 ומעצמות tibeal דלילים 12. הדמיה של מח עצם calvarial נשארת הגישה פולשנית לפחות כדי להשיג הדמיה ישירה של HSPCs בתוך הmicroenvironment ילידי Eir.
עם כל הדמיה דוגמא חיה יש צורך מהותי כדי לשמור על המדגם בשקט ככל האפשר, כדי למנוע כל חפצים מיותרים בשל תנועת מדגם. נשימה גורמת לתנודות מטוטלת של ראש העכבר, אשר צריכה להימנע כאשר ההדמיה מח עצם calvarial. מחזיקי stereotactic קונבנציונליים, משמשים למשל להדמיה מוחית ואלקטרופיזיולוגיה, אינם מתאימים להדמית calvarium כי הם חוסמים את העצמות הקדמיות. החל מ בעל עכבר להשתמש כדי למזער את המצוקה במהלך בדיקות הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה חיות 13, בעל 2 רכיב פותח, עם חתיכה קטנה קבועה לראש של העכבר כדי ליצור חלון הדמיה מחובר לזרוע גדולה יותר להבטיח אחיזה יציבה עם צלחת בסיס כבדה המבטיחה בחוזקה לבמת מיקרוסקופ. אבטחת החתיכה לגולגולת של עכבר הראש מאפשרת נשימה חופשית ועדיין לשתק את הראש במקום וכראוי ביטול מ 'ovements עקב נשימה. מנגנון "נעילה ומפתח" המקשר את ראש החלקים לגוף המחזיק מאפשר הגודל של החלון כדי למזער כמו גם דיוק מוגבר של מיצוב, ולכן לפשט את הניתוח, ואת ההתאמה של צלחת הבסיס לבמה מאפשר יישור מדויק על המיקרוסקופ. כדי לפקח באופן מדויק תאי ניעתי, פרוטוקול הזמן לשגות ריבוי נקודות נועד לאפשר מעקב של תאים לאורך זמן עם 5 דקות במרווחים בין נקודות זמן. HSCs כאן, עשה שכותרתו הזריק לעכברי כתב osteoblasitc col2.3GFP 10,14 וצלם כ 20 שעה מאוחר יותר. בעל העכבר שתוכנן והגדרות ההדמיה הנדרש לביצוע הדמיה הזמן לשגות מהירה ריבוי נקודות של אותם האזורים על פני תקופה של שעות מרובות מתוארות בפירוט.
Protocol
כל הנהלים הקשורים לשימוש בבעלי החיים מתבצעים בהתאם לחקיקה המקומית. העבודה שלנו היא אושרה על ידי משרד הפנים בבריטניה, כמו גם את לוח הסקירה אתית Imperial College. הנהלים אפשרו מתוארים בתיעוד רישיונות פרויקט ופעלו בהתאם להנחיות שתבטחנה את רווחתם של בעלי החיים בכל העת. ודא לדבוק בחקיקה על ניסויים בבעלי חיים במדינה שבן העבודה נעשית.
.1 תיוג והזרקה של HSPCs:
- קציר תאים כפי שתואר על ידי Lo סלסו 14-15.
- הכן את התאים בריכוז של 10 6 תאים / מ"ל ב PBS. הערה: השתמש hemocytometer או המידע המסופק על ידי סדרן התא לספור את התאים; מספר התאים להיות מתויגים והזריק משתנה בהתאם לסוג התא (כתם למשל 10,000 - 20,000 HSCs, 100,000 - 300,000 HPCs); אם עובד עם פחות מ -10 5 תאים, גלול בשל PBS 100 μl; זה חשוב שיהיו התאים בPBS ללא כל סרום, כסרום מעכב את הכתמים.
- הוסף עשה להשעית התא בריכוז סופי של 5 מיקרומטר ומערבולת ההשעיה באופן מיידי על מנת להבטיח את הצבע לא לזרז את הפתרון ולא מצליחים לתייג את התאים.
- דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף על ידי ספינינג ב XG 500 למשך 5 דקות, decanting הנוזלי וresuspending גלולה בנפח מתאים לIV הזרקה (~ 100 - 150 μl)
- Resuspend התאים 200 μl של PBS ולאסוף לתוך מזרק אינסולין. הערה: מזרק אינסולין מומלץ על מזרק קונבנציונלי כי אין לו שטח מת מחט ולכן מאפשר ניהול כל ההשעיה התא לעכבר.
- הזרק תאים לעכבר קטלני מוקרן באמצעות הזרקה לוריד זנב. הערה: השפעת ההקרנה ידעה, ניכרת על microenvironment מח עצם (שני רכיבי hematopoietic וסטרומה), העוסק בפיתוח מעל tiשלי. לכן זה מאוד חשוב לשמור על תזמון עקבי להקרנה, הזרקת תאים (4 עד 24 שעות מהקרנה לקליטתם הטובות ביותר) והדמיה. כאן הקרנה מתבצעת שעה 6 לפני ההזרקה וההדמיה מתבצעת 20 שעות לאחר הזרקה.
- מניחים את העכבר בתא חם (37 מעלות צלזיוס) עד שוריד הזנב מופיע vasodilated.
- הזז את העכבר לעוצר ולהחליק את המחט לתוך וריד הזנב בזהירות.
- הזרק את התאים לתוך הווריד - אין התנגדות להזרקה צריכה להיות נתקלה.
- השאר את O העכבר / N על מנת לאפשר לתאים לנדוד לחללי מח עצם.
.2 הכנת העכבר להדמיה
- החיטוי זוג אחד של מלקחיים בסדר וזוג אחד של מספריים עדינים, כמו גם כיסוי ראש לפני השימוש ולאחסן בסביבת סטרילית.
- איפור הרדמה טרי ככל האפשר, (0.38 מ"ל קטמין + 0.25 מ"ל Medetomidine + 4.47 מ"ל מים). הערה: otההרדמה שלה אושרה, כוללים isoflurane וזריקות אחרות, תהיה יעילה יותר. הקוקטייל שתואר הוא להיות מנוהל intraperitoneally ב0.1 מ"ל ל10 גרם של משקל גוף, עם הראש הקופצים של 30 - 50 μl מנוהלים כל 45 דקות לשעה 1.
- הפעל את לייזר שני פוטונים במידת צורך ולאחר מכן להתחיל למיקרוסקופ ותוכנה, כיול השלב שבו תתבקש לעשות זאת. הפעל את הלייזרים ולאפשר להם להתחמם ולייצב בעת הכנת העכבר להדמיה.
- להרדים את העכבר באמצעות התערובת מוכנה הרדמה (שלב 2.2) להרדמה שנבחרה באמצעות זריקת intraperitoneal. לפקח על תחילתה של הרדמה עמוקה באמצעות רפלקס דוושה עכשיו ובמרווחים קבועים לאורך הפרוטוקול. הערה: העכבר חייב להיות במעקב צמוד לאורך כל ההליך ואם ההרדמה נראית ברקים (בדרך כלל לאחר 45 - 60 דקות) ולאחר מכן לנהל את המנה עליונה למעלה (כמפורט ב2.2). לצפות כמה וריאציה בין העכברים של גילים ומינים שונים. זה important כדי לדון בפרוטוקול ההרדמה עם הווטרינר המקומי שלך כדי להבטיח אמצעי זהירות נאותה נלקח על מנת להבטיח את שלומן של העכבר.
- ספוגית החלק העליון של הקרקפת עם אתנול 70% ברקמה, מה שמבטיח שלא יקבלו שום אתנול בעיניים של העכבר.
- בעזרת מלקחיים ומספריים סטרילי, להסיר בזהירות את החלק של הקרקפת המרכזי לחשוף את אזור calvarium להיות צילם: לעשות חתך קטן בחלק האחורי של הראש בין האוזניים על ידי הרמת העור עם המלקחיים. בעוד מחזיק את העור, חלק את המספריים מתחת לעור ולחתוך בעדינות לאורך מחוץ לאזור ההדמיה הרצוי.
- נגב את העצם החשוף עם מקלון צמר גפן סטרילי טבולה בPBS סטרילי כדי לשמור אותו לח.
- צרף את חתיכת ראש המתכת לגולגולת של העכבר מוכן להדמיה.
- לערבב כמות מספקת של דבק דנטלי בסירה שוקל עד שהוא הופך למשחה ומהירות תחול על המשטח התחתון של כיסוי הראש שייצרף לים כול.
- לפני שקיעת המלט, למקם את כיסוי הראש על הגולגולת של העכבר, כדי לוודא שלא יקבל שום מלט שיניים באזור ההדמיה, אז לחכות שזה כדי להגדיר.
- למרוח כמות קטנה של intrasite Hydrogel אשר משומרים על הגולגולת לחה.
- צרף את כיסוי הראש לבעל ובטוח במקום באמצעות הבורג, להבטיח כי החריצים שיתאימו לחריצי בעל.
- הסר את הידרוג'ל מהגולגולת עם ניצני כותנה סטרילי ונקיה עם PBS סטרילי לפני העברה למיקרוסקופ.
- הכנס את המחזיק לבמת מיקרוסקופ, מקם את מזרן החימום מתחת לעכבר, להחדיר את מכשיר מדחום רקטלי ולאבטח את הכל במקום על הבמה עם נייר דבק.
- מקום טיפה קטנה של משחת עיניים בעיניים של העכבר כדי להבטיח שהם לא יתייבשו בזמן הרדמה. הערה: העכבר אין להשאיר ללא השגחה בכל עת במהלך תהליך ההדמיה בזמן הרדמה.
התחת = הדמיה "jove_title"> 3 In Vivo:. סטאקס ברזולוציה גבוהה ורכישת הזמן לשגות
- להתמקד בגולגולת באמצעות חתיכות עין.
- מלא את חלון ההדמיה במים מטוהרים, סטרילי ושימוש בעדשת טבילה במים, מוריד אותו, כך שהוא נוגע בטיפת המים.
- התמקד בחלק העליון של הגולגולת באמצעות עינית המיקרוסקופ, באמצעות מנורה חיצונית כמו אור המקור.
- מקם את אזור ההדמיה על התפר המרכזי ולנוע לעבר חלקו האחורי של הראש כדי למצוא את תפר העטרה כעמדת פתיחה.
- הגדר את המיקרוסקופ עד לאפשר עירור ואיתור יעילים של fluorophores הרלוונטי מפורט בטבלת העירור ופליטה. הערה: בעוד confocal הזקוף Leica SP5 עם ראש סריקת גלונומטר קונבנציונלי פועל פלטפורמת תוכנת LAS-AF משמש כאן, ההליך יכול להיות משוכפל בקלות בפלטפורמות מיקרוסקופ / תוכנה אחרות. העדשה משמשת כאן היא לייקה HCX IRAPO L 25x W / 0.95 NA בעדשות מקבילות ut של יצרנים אחרים זמינות עם הגדלה מתאימה וגבוה NA
- הנח את התוכנה למצב כדי ללכוד את שני תמונות XY, כמו גם 3D Z-מחסנית ומהירות הדמיה מוגדרת 400 הרץ והרזולוציה 512 x 512 פיקסלים. הערה: ההתקנה והחומרה כאן לגרום לשדה הראייה של 620 מיקרומטר וזה עשוי להיות שונה בפלטפורמות אחרות.
- הגדר את התוכנה כך שמספר רב של ערוצים / שירים יכולים להיות בשבי, כמו גם להבטיח כי שיטת הגבייה מוגדרת כדי לשנות את ההגדרות בין ערימות אם אפשר או בין מסגרות לכל הפחות. הגדר את 3 הגדרות לכידה עצמאיות, כיבוי תאורת הלייזר בסוף הרכישה של כל ערימה. הערה: שלושה ערוצים יידרשו להליך זה כדי להפחית crosstalk בין ערוצים.
- התקנת ההגדרות עבור הסריקה סדרתית הראשונה לאות שני פוטוני SHG עצם (840 עירור ננומטר; 400 - פליטת ננומטר 440); לפתוח את התריס לליזר MP ולהבטיח Mרווח P ולקזזם בצורה נכונה התקנה, כוח הלייזר הנו 12.5 - 25% והליזר מופעל. בחר PMT מתאים כגלאי בלבד ולשנות את הצבע לבן. הערה: יש להשתמש בגלאי NDD עם מסננים מתאימים לגילוי העצם כאשר זמין להשגת אות בהירה, עמוקה יותר.
- (; 560 - פליטת 600nm עירור 543 ננומטר) ועשה (עירור 633 ננומטר; 650 - פליטת ננומטר 720) חזור על מערך ערוצים המשמשים לערוץ GFP לautofluorescence בשילוב הליך תחת ההגדרות השניה לסרוק, תוך ניצול שני PMTs המתאים. לשנות את צבע הערוץ ירוק לautofluorescence ואדום לעשה. הערה: באמצעות ירוק כערוץ אוטומטי הקרינה מאפשר זיהוי קל יותר של תאים חיוביים עשו כאשר שני הערוצים יכסו - תאי autofluorescent מופיעים צהוב / כתומים בשל היותו בשני תוך הערוצים עשו תאים מופיעים רק כאדום מאז שהם מופיעים רק ב האם ערוץ. הערוץ אוטומטי הקרינהמשמש רק לצורך השוואה זו ולא נעשה שימוש בכל ניתוח סופי, אולם אם המשתמש רוצה, זה יכול להיות שונה לצבעים שונים למטרות תצוגה, כדי למנוע בלבול עם ערוץ GFP.
- לבסוף, הגדרת הסריקה השלישית והאחרונה לGFP (עירור ננומטר 488; 500 - פליטת ננומטר 530); לוודא את התריס פתוח במידת צורך ולאחר מכן קבע את כוח הלייזר של קו לייזר 488 ננומטר סביב 15% או בשימוש ברמה מתאימה לליזר, בחר PMT מתאים כגלאי פעיל בלבד ולשנות pseudocolor הירוק.
- הפעל מצב הדמיה 'בשידור חי' כדי להתחיל סריקה מקדימה של הערוץ שנבחר ולהתאים רווח גלאי וקוזז לחשיפה אופטימלית. חזור על פעולה זו עבור כל סריקה בחלון רציף.
- שמור את ההגדרות של סריקות רב ערוצים אלה לשימוש חוזר קל. הערה: זה מאפשר למשתמש כדי לטעון מחדש את ההגדרות בהפעלות שלאחר מכן.
- הפעל לכידה רבת עמדה, המכונה "מארקnd מצא 'בתוכנה הפגינה, ולאפס את הנקודות לתאם.
- סרוק את אזור ההדמיה העצם, החל מהצומת שבין התפר המרכזי ועטרה, לסרוק את העומק של אזור במח עצם בשתי autofluorescence (פסאודו בצבע ירוק) ועשה (פסאודו בצבע אדום) עם נוף מורכב. הערה: תאי autofluorescent יהיו נוכחים בשני הערוצים ומופיעים כתום / צהוב בתמונה המורכבת ואילו עשה תאים שכותרתו יופיעו כתאים אדומים רק בתמונה המורכבת.
- כאשר תא מזוהה, מסמן זאת כעמדה לתאם חדשה (x, y וz) ב'מארק ומצא את 'כלי על ידי לחיצה על חלון "הוסף סמל התפקיד חדש בצד השמאלי של" מארק ומצא " .
- כאשר השדה הנוכחי מבט נבדק, להעביר את שלב המרחק של שדה אחד של השקפה או / ימינה / למטה / למעלה מימין מ. חזור על תהליך זה עבור כל שדה הראייה, עובד בהדרגה ברחבי האזור כולו חלון הדמיה בצד השמאל של התפר מרכזי דואר, נע לכיוון האף של העכבר. ברגע שהסתעפות התפר המרכזי נמצאת בטווח ראייה, לעבור לצד ימין של התפר ולחזור על תהליך הסריקה בצד השמאל בכיוון ההפוך (כלומר, לכיוון תפר העטרה). סמן את הקואורדינטות של כל תאים חדשים של עניין באמצעות 'מארק ומצא את' כלי.
- ברגע שהסריקה של חלון ההדמיה הושלמה, השתמש 'מארק ומצא את' כלי לבחינת הנקודות (לבחור את הנקודה הרצויה ולבדוק כל נקודה בנפרד). הגדר את החלק העליון ותחתון של Z-ערימה מסביב לכל תא לכל תפקיד, (פלטפורמות תוכנה רבות תאפשר לך לבצע z-ערימות עצמאיות לכל תפקיד, אשר מפחית לכידת חלל ריק). עבור כל נקודה, להתמקד למעלה ולמטה ולהגדיר את עמדות Z עליונה ותחתונים עבור לכידת z-ערימת 3D ולעדכן את הנקודה בודדת ב'מארק ומצא '. הגדרת מרווח Z-Stack ל5μm וממוצע לכל ערוץ סריקה סדרתית לאיכות מתאימה: קו oממוצע מסגרת r. הערה: הגדלת מספר הסריקות לממוצע מגדילה את משך זמן רכישה.
- לרכוש מחסנית התייחסות באיכות גבוהה עבור כל נקודת העניין על ידי שתתחיל בהליך הסריקה כולו (המכונה לעתים קרובות "התחל" ולא "ללכוד"). הערה: סריקה זה יכול לפעול כהתייחסות להדמיה במהירות גבוהה בעתיד.
- ברגע שסיימתי עם הסריקה באיכות גבוהה, להפעיל את הגדרת הזמן לשגות ללכידה.
- בהגדרות הזמן לשגות, להגדיר את מרווח הזמן 5 דקות וזמן ריצה הכולל לאורך הרצוי (למשל, שעה 5). 'החל' בהגדרות אלה כדי הסריקה הכוללת. הערה: על מנת לקצר את זמן סריקה זו כדי לאפשר מרווח הזמן לשגות 5 דקות, אחד ייתכן שתצטרך לצמצם את מספר הסריקות משמשות למיצוע, להגביל את הרזולוציה ל512 x 512 פיקסלים, להמיר את הסריקה לכיוונית (עם תיקון שלב נדרש כדי ליישר שני כיווני הסריקה), ו / או להגדיל את מהירות סריקה ל600 הרץ או יותר (יותר מ600הרץ יגרום התקרבות של אזור ההדמיה לפלטפורמת התוכנה הפגינה). כמו כן, חשוב לציין כי בעוד שמצב הדמיה רציף שימש לרכישת מחסנית תמונה באיכות גבוהה בתחילה, רכישה בו זמנית משמשת כדי להגדיל את המהירות במהלך ההדמיה הזמן לשגות - זה עלול לגרום לכמה לדבר לחצות קל בין ערוצים אשר מציב נוסף חשיבות בלכידה הראשונית של ערימות התייחסות מופרדות באופן מדויק.
- להתחיל הדמיה (כמו קודם על ידי לחיצה על הכפתור "התחל" בתוכנה הפגינה). הערה: הקפד לשמור על הרמה המתאימה של הרדמה על ידי מתן נוסף, במינונים קטנים יותר בעת צורך, נזהר שלא ממנת יתר העכבר, באופן קבוע למעלה את המים על מנת להבטיח את המטרה לא להתייבש ולעקוב אחר סימנים חיוניים וטמפרטורת חימום-pad לאורך כל דרך.
- כאשר סיים, להעלות את העדשה מהמחזיק ולאחר מכן הסר את המחזיק מבמת מיקרוסקופ, על מנת להבטיח את החוטים מהבדיקה וh רקטליתאכילת מחצלת אינם פגומים.
- להתיר את כיסוי הראש ממחזיק הבמה ולהסיר את העכבר בזהירות. לברור את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם ולהסיר את ראש חתיכת מתכת על ידי מצלם אותו מהגולגולת. שמור את הנתונים לדיסק ולהעביר לשרת לניתוח מאוחר יותר. הערה: חתיכת הראש הוא ניקה באופן אידיאלי על ידי הטבילה באצטון למשך כמה שעות ולבסוף משפשפים את המלט השיורי.
Representative Results
המנהג עשה, בעל עכבר דיוק גבוה כוללים חלון הדמיה calvarium מאפשר הדמיה ממושכת של HSPCs FACS המטוהר, שכותרתו הזריק לעכברים קטלני המוקרנים נמען (איור 1 א). בדרך כלל, לאחר ההזרקה של בין 15-20,000 תאים שכותרתו, 8 עד 15 תאים הם בדרך כלל מוכרים בתחום ההדמיה מח עצם של גולגולת היום הבא. כאן הוא הראה כיצד לרכוש ערימות 3D רזולוציה תא בודדות של HSPC המכיל אזורי מח עצם של כ 90 - 120 עובי מיקרומטר, (איור 1), ואחריו זמן לשגות סרטי 4D של HSPCs זוהה (איור 1 ג וסרט).
תוצאות שאינן אופטימליות מתקבלות אם מלט השיניים אינו ערוך בצורה אופטימלית, למשל המים יכולים לדלוף מאזורים אטומים שאינם, ועל אף שניתן עקף מהחלק העליון של בעלה, כל תקופת הזמן שבה העדשה לא טבלה לתוך מים מוביל לf השחורה Rames. להיסחף קצת בתמונות הוא בלתי נמנע בשל התפשטות תרמית של החומרים של בעל העכבר, אולם ניתן מודגש על ידי הידבקות בטון הכי מוצלחת, שהובילו לניתוק הדרגתי של העכבר, ועל ידי הפרעות של ההדמיה להגדיר, שמוביל לקפיצות פתאומיות של המוקד במהלך הדמיה הזמן לשגות. הסחף במהלך הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות יכול להיגרם גם על ידי אי דיוקים בתנועות השלב שבו בוחנים מחדש את העמדות צילמו בעבר. חפצי דריפט וגמגום בזמן לשגות סרטים ניתן לתקן על ידי שימוש באלגוריתמי רישום תמונה.
שולחן עירור 1 והגדרות פליטה.
| צבע ערוץ | עירור | פליטה |
| GFP | 13px; "> 488 ננומטר500-530 ננומטר | |
| Autofluorescence | 543 ננומטר | 560-610 ננומטר |
| עשיתי | 633 ננומטר | 640-700 ננומטר |
| SHG | 840 ננומטר (MP) | 400-450 ננומטר |
איור 1 בהדמית 4D vivo של HSPCs בcalvarium עכבר. תאי דוגמאות לתוצאות שהתקבלו (ב ') פרוסות 2D מערימת 3D (עומק כולל הוא 114 מיקרומטר), המכילה אות מעצם קולגן (לבן), עשה שכותרתו (אדומה) - מתאר () של הניסוי (C B).. , Cel autofluorescentls (צהוב) ותאי osteoblastic (ירוק). ברים סולם: 100 מיקרומטר פרוסות (C) 2D מסרט 4D הזמן לשגות מראה HSC (אדום) עשה שכותרתו הנודד בקרבת תאי osteoblastic (ירוק).. הקו המקווקו מדגיש את התזוזה של התא. ברים סולם: 50 מיקרומטר (B) ו100 מיקרומטר (C). הערה:. הסרט המתקבל מרכישת הזמן לשגות ב( C) מוצג במאמר וידאו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
מה שהושג?
הפרוטוקול עושה שימוש בהדמיה רב ממדית זמן לשגות כדי לפקח על ההגירה של FACS המטוהרים, vivo לשעבר HSPCs שכותרתו, הושתל במח עצם calvarial עכבר. זיהוי של תאים מושתלים יחידים הושג ואלה היו במעקב לאורך תקופות ממושכות של זמן (שעות) ברמת דיוק גבוהה. חפצי תנועה מושרה נשימה כבר ממוזערים ותאים כבר reimaged שוב ושוב על פני זמן ממושך, כמובן.
מה הם כיוונים עתידיים?
פיתוח של הטכניקה יכול להתקדם לעבר ניסויי התאוששות כדי לאפשר הדמיה בימים מרובים, במהלך שבוע או יותר ושימוש בהרדמת גז כגון isoflurane לקצר ולפשט את תהליך ההתאוששות לעכבר (הערה: ניסויי התאוששות דורשים אך ורק תנאים סטריליים ניתוח וניהול של משככי כאבים מתאימים). Development של צבע צבעים גדולים יותר של צבעי in vivo, כמו גם תיוג גנטי יעיל של תאי hematopoietic גם יקל על ניסויים רב תיוג, מספק תובנה רבה יותר על תאי תאי אינטראקציות בתוך מח העצם ומאפשר לניסויים מורכבים יותר בעתיד. בנוסף, תיוג בו זמנית של מבני מח עצם מרובים ורכיבי סטרומה יספק תמונה של האירועים המתרחשים בנישות HSPC מלאה יותר. יציבות תמונה של הזמן לשגות סרטים יכולה להיות שיפור preacquisition ידי ייצוב מיקרוסקופ נוסף, כמו גם צמצום הדרגתיים בטמפרטורה במדגם וpostacquisition על ידי שימוש באלגוריתמי רישום תמונה.
מגבלות:
הטכניקה המתוארת מציגה כמה מגבלות. הישרדות של עכברים לאחר מתן הרדמה בזריקות היא בלתי צפויה והיא קלה מאוד לסיבוכים ניסיון תלוי בתגובת אדם להרדמה. בדרך כלל, זמן רב יותר פגישת הדמיה, קשה יותר הוא לעכבר כדי להתאושש מהרדמה ולכן חשוב לתכנן בקפידה אם העכבר הוא להיות התאושש, באופן אידיאלי הגבלת משך הזמן של הדמיה הזמן לשגות. השימוש בהרדמה בזריקות מגבילה את הזמן בכל פגישת הדמיה יכולה להימשך. למרות זאת, ניתן להאריך את ההרדמה על ידי readministering מינון קטן יותר של חומר הרדמה, שקשה לבצע את זה בצורה מדויקת ומינון יתר העכבר הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר לסיום המוקדם של ההדמיה in vivo. ההרדמה גז היא פחות רעילה ומאפשרת לפגישת הדמיה ראשונית ארוך יותר, אולם התאוששות מהירה של העכבר לאחר> 2 שעות ממשל של isoflurane ארוך הוא מוצלח רק לעתים נדירות. מגבלה נוספת של הטכניקה היא ברזולוציה המוגבלת של התמונות שניתן להשיג במהלך הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות, כתוצאה מהצורך לרכוש תמונות במהירות. זה, בשילוב עם סחף או שדה מוקדי קופץ (דיסקussed לעיל), יכול לעשות מעקב של תאים קשים.
השוואה עם שיטות חלופיות:
HSPCs בדרך כלל מסומנים עם צבע lipophilic עשה, אבל צבעי דיר וDiI חלופות שווי ערך וניתן להשתמש בם כל עוד מספיק בהירים צבעי תא אחרים, כפי שנסקר ב[ 16]. למרות תיוג vivo לשעבר של תאים עם עשה הוכח שלא משפיע על התפקוד לטווח הארוך של HSCs, יש לו את המגבלה שעשתה (או כל צבע כימי אחר) בדילול מלא על חלוקת תא. מאז HSCs להתרבות בימים הראשונים שלאחר השתלה, יחס האות לרעש לתאים אלה במהירות מתדרדרת. תיוג אנדוגני של תאים באמצעות מניפולציה וביטוי של חלבוני ניאון גנטיים הוא שיטה חלופית בת קיימא, כל עוד חלבוני הניאון באים לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק כדי ליצור אות לזיהוי דרך עצם הגולגולת. ישנם מספר של techn החלופיiques זמין לביצוע הדמיה של HSPCs בתוך חלל מח עצם, כל אחד עם מגבלות יתרונות שלהם ו. החדרה של מכשירי הדמיה מבוססת סיבים אופטיים אפשרה להדמיה של הכינון מחדש של מח עצם בעצמות [8] ארוכות, תוך ההדמיה confocal לאחר חשיפה כירורגית של עצם השוק והדילול של אמייל עצם עם מקדחה כירורגית [12] פיק תמונות מפורטות של HSPCs המתגורר ב אזורי פריפריה של עצמות ארוכות. שיטות אלה עם זאת הן הרבה יותר חודרניים מזו שתוארה כאן ולכן אינו מאפשרת לחזור על פגישות הדמיה מתמקדות באותו האזור במח עצם באותו העכבר. יתר על כן, זה אפשרי, כי טכניקות אלה עשויות להשפיע על התאים שנצפו ניתנה תגובה בלתי נמנעת לפגיעה נרחבת ברקמה הסובבת. HSPCs כבר צילם לתקופות קצרות של זמן באמצעות coverslips ממוקם מעל, עצמות ירך נכרת שבורות [11], אולם ההשפעה של הכנה קשה זו של הרקמה על HSPCs אינה קליאהr והטכניקה היה בשימוש באופן ייחודי כדי להשיג תצפיות נקודת זמן אחת. עצמות קבועים כבר מחולק למקטעים סדרתי, מוכתמת, והתמונות שהתקבלו שחזרו למודל 3D, מתן פתרון 3D מצוין, במיוחד כאשר יציקות כלי דם נמצאות בשימוש [17], ולאחרונה סריקת הלייזר Cytometry (LaSC) נעשה שימוש כדי להשיג כמותיים צעדים על HSPCs באתר, מודגש על ידי immunostaining [18] אך אינם מסוגלים לספק כל מידע זמני על התנהגות התאים. הטכניקות מתוארות בטכניקה חדשה זו מספקות שילוב של רזולוציה טובה ב3D, דגימה זמנית מספיק לניטור תאי 4D והם יחסית לא פולשנית, ולכן מציעים גישה אידיאלית להשגת ניטור ארוך טווח של HSPCs אינטראקציה עם מח העצם microenvironment.
Acknowledgments
ההדמיה בוצעה על מיקרוסקופ confocal זקוף Leica SP5 ממוקם בתוך מתקן FILM של Imperial College בלונדון, המנוהל על ידי ד"ר מרטין Spitaler.
בעל הדגימה וכיסוי הראש נעשה בשיתוף פעולה עם המחלקה להנדסה הכימית של Imperial College בלונדון, עם עצות מסמואל ג'ונס וד"ר סיימון Schultz.
ניקולה Ruivo, פרנסיסקו דיאז וצוות הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה בImperial College סייעו לסיועם ועצות על גידול בעלי עכבר. מארק סקוט ממומן על ידי HFSP וקולנוע, Olufolake Akinduro ידי CRUK וכריסטינה Lo סלסו ידי CRUK, KKLF, BBSRC וHFSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance. J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).
- Wang, L. D., Wagers, A. J. Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).
- Schofield, R. The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).
- Bischoff, R. Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers. Development. 109 (4), 943-952 (1990).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators. Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Lewandowski, D., et al. In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Xie, Y., et al. Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging. Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).
- Köhler, A., et al. Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones. Blood. 114 (2), 290-298 (2009).
- Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells. J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).
- Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow. Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso,, C, From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Ellis, S. L., et al. The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Nombela-Arrieta, C., et al. Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment. Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).
