Summary
La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.
Abstract
Grâce à un équilibre délicat entre la quiescence et la prolifération, auto-renouvellement et de la production de la descendance différenciée, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de maintenir le chiffre d'affaires de toutes les lignées de cellules sanguines matures. La coordination des signaux complexes qui entraînent des destins HSC spécifiques repose sur l'interaction entre les CSH et le microenvironnement complexe de la moelle osseuse, qui est encore mal comprise [1-2].
Nous décrivons par la combinaison d'un porte-échantillon nouvellement mis au point pour le positionnement des animaux stable avec confocal à plusieurs étapes et à deux photons dans des techniques d'imagerie in vivo, il est possible d'obtenir des empilements de 3D à haute résolution contenant des HSPCs et leurs créneaux environnantes et de les suivre dans le temps par multi-point imagerie time-lapse. Imagerie haute définition permet la détection ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques marqués (HSPCs) résidant dans la moelle osseuse. En outre, plusieurs points time-lapse imagerie 3D, obtained avec les paramètres d'acquisition plus rapides, fournit des informations précises sur le mouvement CSPS et les interactions réciproques entre HSPCs et les cellules du stroma.
Suivi de HSPCs par rapport à la GFP de cellules ostéoblastiques positif est représenté comme un exemple d'application de cette méthode. Cette technique peut être utilisée pour suivre toute hématopoïétiques ou cellules stromales étiquetés de manière appropriée des intérêts dans l'espace de la moelle osseuse de la calotte crânienne de la souris.
Introduction
Malgré niches de cellules souches ayant été reconnus depuis des décennies 3 et bien caractérisés dans de nombreux tissus tels que le bulbe olfactif, la fibre musculaire, follicule pileux renflement ou CNS zone sous-ventriculaire 4-7, les interactions entre les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et microenvironnement de la moelle osseuse ( BM) sont encore mal comprise en raison de la difficulté d'observer directement les cellules individuelles à travers l'os ainsi que la nature extrêmement fluide du tissu lui-même. Il a été démontré, à travers un certain nombre d'études fonctionnelles sur la base de l'ablation ou la surexpression de gènes spécifiques que ce soit dans les CSH ou les cellules stromales de la micro lui-même, un réseau complexe de différents types de cellules et des signaux de régulation est responsable de la régulation de l'équilibre délicat entre quiescence , la prolifération, l'expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques 1-2. La diaphonie entre les CSH et leurs niches peut être compris en profondeur que par l'observation directe. C'est achievable grâce à l'élaboration de protocoles d'imagerie de pointe, alliant la technologie disponible non seulement en termes de microscopie, mais aussi des solutions de support d'échantillons et de logiciel d'acquisition.
La résolution de la cellule à l'unité d'imagerie en temps réel des cellules transplantées souches hématopoïétiques et progénitrices (hspC) dans le compartiment BM des calvaria de souris os a montré que HSPCs de greffant localiser à proximité des vaisseaux SDF-1 et VCAM-1-positives 8-9 et que les cellules plus immatures se trouvent à l'intérieur de 15 - 20 microns à partir de cellules GFP-positives ostéoblastiques (lignée de souris transgénique Col2.3-GFP, dans laquelle le collagène 1α promoteur ostéoblastique restriction dirige l'expression de la GFP), tandis que leur progéniture sont plus distale 10. Des observations similaires ont été obtenus à partir d'os de fémur disséqués et fracturées 11 et à partir d'os tibeal amincies 12. Imagerie de la moelle osseuse crânienne reste l'approche la moins invasive pour obtenir une visualisation directe des HSPCs dans emicroenvironnement natif leu.
Avec toute l'imagerie de l'échantillon en direct il ya un besoin inhérent à maintenir l'échantillon aussi immobile que possible pour éviter les artefacts inutiles en raison de mouvement de l'échantillon. La respiration provoque des mouvements oscillatoires de la tête de la souris, qui doivent être évités lors de l'imagerie crânienne moelle osseuse. Titulaires stéréotaxiques classiques, utilisés par exemple pour l'imagerie cérébrale et l'électrophysiologie, ne sont pas adaptés pour l'imagerie de la calotte crânienne, car ils empêchent les os frontaux. À partir d'un support de la souris utilisé pour minimiser la détresse durant imagerie et d'électrophysiologie études vivantes 13, un support 2 de composant a été développé, avec un petit morceau fixé à la tête de la souris pour créer une fenêtre d'imagerie connecté à un grand bras assurant le maintien stable avec un plaque de base lourde qui assure fermement dans la platine du microscope. Sécurisation de la pièce sur le crâne de la souris de la tête permet une respiration libre tout en immobilisant la tête en place et éliminer de manière adéquate movements en raison de la respiration. A 'de verrouillage et de clé «mécanisme reliant la pièce de tête sur le corps de support permet à la taille de la fenêtre à être réduite au minimum ainsi que la plus grande précision de positionnement, ce qui simplifie donc l'intervention chirurgicale, et l'ajustement de la plaque de base dans l'étape permet un alignement précis sur le microscope. Pour suivre avec précision les cellules mobiles, un protocole laps de temps multi-point a été conçu pour permettre le suivi des cellules au fil du temps avec des intervalles de 5 min entre les points de temps. CSH ici, avez marqués sont injectés dans col2.3GFP osteoblasitc journaliste souris 10,14 et imagés environ 20 heures plus tard. Le titulaire de la souris qui a été conçu et les paramètres d'imagerie nécessaires à l'exécution rapide multi-point imagerie time-lapse de la même région sur une période de plusieurs heures sont décrites en détail.
Protocol
Toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont effectués conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Home Office britannique, ainsi que le comité d'examen éthique de l'Imperial College. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent les lignes directrices qui assurent le bien-être de l'animal en tout temps. Assurez-vous de respecter la législation sur l'expérimentation animale du pays où le travail est effectué.
1. étiquetage et l'injection de HSPCs:
- Récupération des cellules telles que décrites par Lo Celso 14-15.
- Préparer les cellules à une concentration de 10 6 cellules / ml dans du PBS. REMARQUE: Utilisez un hématimètre ou les informations fournies par le trieur de cellules à compter les cellules; le nombre de cellules à étiqueter et injectée varie en fonction du type de cellule (par exemple la tache 10000 - 20000 CSH, 100,000 - 300 000 CPS); si l'on travaille avec moins de 10 5 cellules, de remettre en suspension dans 100 ul de PBS; il est important d'avoir des cellules dans du PBS sans sérum, comme le sérum inhibe la coloration.
- Ajoutez DiD de la suspension cellulaire à une concentration finale de 5 uM et vortex la suspension immédiatement pour assurer le colorant ne précipite pas la solution et ne pas étiqueter les cellules.
- Incuber pendant 10 min à 37 ° C puis laver par centrifugation à 500 g pendant 5 min, décanter le liquide et remettre en suspension le culot dans un volume approprié pour injection IV (~ 100 - 150 pi)
- Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et de recueillir dans une seringue à insuline. REMARQUE: une seringue à insuline est recommandée sur une seringue conventionnelle car il n'a pas l'aiguille espace mort et permet l'administration de la totalité de la suspension cellulaire à la souris donc.
- Injecter des cellules dans une souris mortellement irradiées par injection dans la veine caudale. NOTE: L'irradiation a connu, un impact considérable sur le microenvironnement de la moelle osseuse (deux hématopoïétiques et stromales composants), qui se développe sur timoi. Il est donc très important de maintenir le calendrier cohérent pour l'irradiation, l'injection de cellules (4 à 24 heures de l'irradiation pour une meilleure prise de greffe) et l'imagerie. Voici irradiation est effectuée 6 heures avant l'injection et de l'imagerie est effectuée 20 heures après l'injection.
- Placez la souris dans une chambre chaude (37 ° C) jusqu'à ce que la veine de la queue semble vasodilated.
- Déplacez la souris dans le dispositif de retenue et faites glisser doucement l'aiguille dans la veine de la queue.
- Injecter les cellules dans la veine - pas de résistance à l'injection devrait être rencontré.
- Laisser la souris O / N afin de permettre aux cellules de migrer vers les espaces de la moelle osseuse.
2 Préparation de la souris pour l'imagerie
- Autoclave une paire de pinces fines et une paire de ciseaux fins ainsi que d'un casque avant de l'utiliser et de stocker dans un environnement stérile.
- Faire un anesthésique aussi frais que possible, (0,38 ml 0,25 ml kétamine + Médétomidine + 4,47 ml d'eau). REMARQUE: otses anesthésiques approuvés, y compris l'isoflurane et d'autres injectable, seront efficaces aussi. Le cocktail décrit doit être administrée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel, avec des recharges de 30 - 50 pi administrés toutes les 45 min à 1 h.
- Allumez le laser à deux photons si nécessaire puis démarrez le microscope et le logiciel, l'étalonnage de la scène lorsque vous êtes invité. Changer sur les lasers et leur permettre de se réchauffer et se stabiliser tout en préparant la souris pour l'imagerie.
- Anesthésier la souris en utilisant le mélange anesthésique préparée (étape 2.2) pour l'anesthésie choisi par injection intrapéritonéale. Surveiller l'apparition de l'anesthésie profonde avec une pédale réflexe maintenant et à intervalles réguliers tout au long du protocole. REMARQUE: la souris doit être surveillée attentivement tout au long de la procédure et si l'anesthésie semble être la foudre (généralement après 45 - 60 min), puis administrer une dose complémentaire (comme indiqué à la section 2.2). Attendez-vous à une certaine variation entre les souris de différents âges et le sexe. Il est importante pour discuter du protocole d'anesthésie avec votre agent vétérinaire local pour assurer les précautions nécessaires sont prises pour assurer le bien-être de la souris.
- Nettoyer la partie supérieure du cuir chevelu avec 70% d'éthanol sur un mouchoir en papier, garantissant de ne pas obtenir de l'éthanol dans les yeux de souris.
- En utilisant des pinces et ciseaux stériles, retirer délicatement la partie centrale du cuir chevelu pour exposer la zone de la voûte crânienne à imager: faire une petite incision à l'arrière de la tête entre les oreilles en soulevant la peau avec des pinces. Tout en maintenant la peau vers le haut, faites glisser les ciseaux sous la peau et délicatement couper le long de l'extérieur de la zone d'imagerie souhaitée.
- Essuyez l'os exposé avec coton-tige stérile humidifié avec du PBS stérile pour le garder humide.
- Fixer la pièce de tête métallique sur le crâne de la souris prêt pour l'imagerie.
- Mélanger une quantité suffisante de ciment dentaire dans un bateau peser jusqu'à ce qu'il devienne une pâte et appliquer rapidement à la surface inférieure de la pièce de tête qui se joindre à la sKull.
- Avant la prise du ciment, placez le casque sur le crâne de la souris, en veillant à ne pas mettre du ciment dentaire sur la zone d'imagerie, puis attendre pour fixation.
- Appliquez une petite quantité de Intrasite hydrogel qui maintient le crâne humide.
- Fixez le casque à la porte et fixer à l'aide de la vis, en veillant à ce que les rainures s'insèrent dans les encoches de maintien.
- Retirer l'hydrogel du crâne avec des cotons-tiges stériles et propres avec du PBS stérile avant de les transférer sur le microscope.
- Insérez le support dans la platine du microscope, placez le tapis chauffant sous la souris, insérez la sonde du thermomètre rectal et fixez le tout en place sur la scène avec du ruban adhésif.
- Placer une petite goutte de pommade ophtalmique sur les yeux de la souris afin de s'assurer qu'ils ne se dessèchent pas sous anesthésie. REMARQUE: la souris ne doit pas être laissé sans surveillance à tout moment pendant le processus d'imagerie sous anesthésie.
in vivo "jove_title": piles à haute résolution et d'acquisition Time-lapse
- Focus sur le crâne par les pièces de l'oeil.
- Remplir la fenêtre de formation d'image avec de l'eau purifiée stérile et en utilisant un objectif à immersion, l'abaisser jusqu'à ce qu'il touche la gouttelette d'eau.
- Focus sur le sommet du crâne à l'aide des oculaires du microscope, en utilisant une lampe externe comme source de lumière.
- Positionner la zone de formation d'image sur la suture et se déplacer vers le centre de l'arrière de la tête pour trouver la suture coronale en tant que position de départ.
- Régler le microscope de manière à permettre l'excitation et la détection efficace des fluorophores pertinentes indiquées dans le tableau d'excitation et d'émission. NOTE: si une confocal Leica SP5 verticale avec une tête de balayage de galvanomètre classique exécutant la plate-forme logicielle LAS-AF est utilisé ici, la procédure peut être facilement reproduit dans d'autres plates-formes microscope / logiciels. L'objectif utilisé ici est le Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentilles équivalentes ut d'autres fabricants sont disponibles avec un grossissement adapté et de haute NA
- Placez le logiciel dans un mode de capturer deux images XY ainsi que d'un Z-stack 3D et régler la vitesse d'imagerie à 400 Hz et une résolution de 512 x 512 pixels. REMARQUE: l'installation et le matériel ici le résultat dans un champ de vision de 620 um et cela peut varier sur d'autres plates-formes.
- Configurer le logiciel de sorte que plusieurs canaux / pistes sont capables d'être capturé, ainsi que veiller à ce que la méthode de collecte est en train de changer les réglages entre les piles si possible ou entre les images à tout le moins. Mettre en place trois réglages indépendants de capture, la coupure de l'éclairage laser à la fin de l'acquisition de chaque pile. REMARQUE: trois canaux seront requis pour cette procédure pour réduire la diaphonie entre les canaux.
- Configurer les paramètres de la première analyse séquentielle pour le signal de l'os SHG à deux photons (840 nm d'excitation; 400-440 nm émission); ouvrir l'obturateur pour le laser MP et assurer MP gain et de décalage sont correctement configuré, la puissance du laser est de 12,5 - 25% de et le laser est activé. Sélectionnez un PMT approprié que le seul détecteur et changer la couleur de blanc. Remarque: les détecteurs NDD avec des filtres appropriés devraient être utilisés pour la détection de l'os lorsqu'il est disponible pour obtenir un signal plus profond brillant.
- Répétez la procédure de configuration du canal utilisé pour le canal de la GFP pour une auto-fluorescence combinée (543 nm d'excitation; 560 - 600 nm émission) et DiD (excitation à 633 nm; 650-720 nm émission) au titre des deuxième paramètres de numérisation, en utilisant deux PMT appropriées. Changez la couleur de canal au vert pour le autofluorescence et rouge pour le DiD. Remarque: l'utilisation vert comme le canal auto-fluorescence permet la détection facile de cellules positives n'ai lorsque les deux canaux sont recouvertes - cellules autofluorescentes apparaissent comme jaune / orange en raison d'être à la fois les chaînes en DiD cellules apparaissent uniquement en rouge car ils n'apparaissent que dans la canal DiD. Le canal auto-fluorescenceest utilisé uniquement pour la comparaison et ne sont pas utilisées dans l'analyse finale, si l'utilisateur le souhaite, il peut être changé en une couleur différente à des fins d'affichage pour éviter toute confusion avec le canal de la GFP.
- Enfin, la configuration la troisième et dernière analyse pour la GFP (excitation à 488 nm; 500-530 nm émission); assurez-vous que l'obturateur est ouvert, si nécessaire, puis régler la puissance de laser de la ligne de laser de 488 nm à environ 15% ou un niveau approprié pour le laser utilisé, sélectionnez un PMT approprié que le seul détecteur active et changer son pseudo-vert.
- Activer un mode d'imagerie 'Live' pour commencer un aperçu de numérisation de la chaîne sélectionnée et régler le détecteur de gain et de décalage pour une exposition optimale. Répétez cette opération pour chaque balayage dans la fenêtre séquentiel.
- Enregistrer les paramètres de ces analyses multi-canaux pour une réutilisation facile. REMARQUE: cela permet à l'utilisateur de recharger les paramètres lors de sessions ultérieures.
- Activer multi-capture de position, dénommé «Marquer unTrouver ème 'dans le logiciel démontré, et de réinitialiser les points de coordonnées.
- Balayer la zone d'imagerie osseuse, à partir de l'intersection entre la suture coronale et centrale, analyser la profondeur de la zone de la moelle osseuse en utilisant à la fois auto-fluorescence (pseudo de couleur verte) et DiD (pseudo-couleur rouge) avec une vue composite. REMARQUE: les cellules autofluorescentes seront présents dans les deux canaux et une couleur orange / jaune dans l'image composite alors que n'avons cellules marquées apparaissent en rouge-seules les cellules de l'image composite.
- Quand une cellule est détectée, marquer cela comme une nouvelle position de coordonnées (x, y et z) dans le «Mark et Trouver 'outil en cliquant sur la fenêtre" Ajouter une nouvelle icône de votre position sur le côté gauche de la "Mark et Trouver" .
- Lorsque le champ de vision actuel a été examiné, déplacer la scène de la distance d'un champ de vision soit à gauche / droite / haut / bas. Répétez ce processus pour chaque champ de vue, un travail progressif autour de l'ensemble de la zone de la fenêtre d'imagerie à la gauche de ee suture centrale, se déplaçant vers le nez de la souris. Une fois la suture bifurcation centrale est en vue, se déplacer sur le côté droit de la suture et répétez la procédure balayer le côté gauche dans le sens inverse (c'est à dire, vers la suture coronale). Marquer les coordonnées de toutes les nouvelles cellules d'intérêt en utilisant le «Mark et Trouver 'outil.
- Une fois la numérisation de la fenêtre d'imagerie est terminée, utilisez le «Mark et Trouver 'outil pour étudier les points (sélectionner le point désiré et examiner chaque point individuellement). Réglez le haut et le bas d'un Z-stack autour de chaque cellule pour chaque position, (beaucoup de plates-formes logicielles vous permettent d'effectuer des z-piles indépendants pour chaque poste, ce qui réduit la capture espace vide). Pour chaque point, l'accent de haut en bas et mettre en positions supérieure et inférieure Z pour 3D z-stack capture et mettre à jour le point individu dans le «Mark et Trouver. Réglez l'intervalle Z-Stack à 5 um et moyenne pour chaque canal de balayage séquentiel à une qualité appropriée: o Ligner moyenne de trame. REMARQUE: L'augmentation du nombre de scans en moyenne augmente la longueur de temps d'acquisition.
- Acquérir une pile de référence de haute qualité pour chaque point d'intérêt en lançant la procédure de numérisation ensemble (souvent dénommé «Démarrer» plutôt que «Capture»). NOTE: cette analyse peut servir de référence pour l'avenir de l'imagerie à grande vitesse.
- Une fois que vous avez terminé avec le balayage de haute qualité, d'activer un réglage time-lapse pour la capture.
- Dans les paramètres time-lapse, définir l'intervalle de temps de 5 min et le temps total de course à la longueur désirée (par exemple, 5 h). «Appliquer» ces paramètres pour l'analyse globale. REMARQUE: afin de réduire ce temps de cycle pour permettre un intervalle de temps écoulé 5 min, on devra peut-être réduire le nombre de balayages utilisés pour calculer la moyenne, limiter la résolution de 512 x 512 pixels, convertir le balayage à bidirectionnel (avec correction de phase nécessaire pour aligner les deux sens de balayage), et / ou d'augmenter la vitesse de balayage de 600 Hz ou plus (plus de 600Hz provoquera un zoom de la zone de formation d'image pour la plate-forme logicielle montré). Il est également important de noter que si un mode d'imagerie séquentielle a été utilisé pour acquérir une image pile de haute qualité d'abord, l'acquisition simultanée est utilisée pour augmenter la vitesse lors de l'imagerie time-lapse - il peut en résulter une légère diaphonie entre les canaux qui place supplémentaire importance sur la capture initiale des piles de référence séparées avec précision.
- Commencer l'imagerie (comme avant en cliquant sur le bouton "Démarrer" dans le logiciel démontré). REMARQUE: assurez-vous de maintenir le niveau approprié de l'anesthésie en administrant en outre, des doses plus faibles en cas de besoin, en faisant attention de ne pas surdoser la souris, régulièrement recharger l'eau pour assurer l'objectif ne se dessèche pas et surveiller les signes vitaux et de la température de chauffage pad tout au long.
- Lorsque vous avez terminé, soulever la lentille du support, puis retirez le support de la platine du microscope, s'assurer que les fils de la sonde dans le rectum hmanger tapis ne sont pas endommagés.
- Dévissez le casque du titulaire de la scène et retirez soigneusement la souris. Abattre la souris par dislocation cervicale et retirer la tête-pièce de métal en l'enclenchant hors du crâne. Enregistrer des données sur le disque et transférer au serveur pour une analyse ultérieure. REMARQUE: La pièce de tête est parfaitement nettoyée par immersion dans de l'acétone pendant quelques heures et, enfin, le ciment de frottement résiduel.
Representative Results
Le sur mesure, porte-souris de haute précision comprenant une fenêtre d'imagerie crânienne permet imagerie prolongée de FACS, HSPCs purifiés marqués injectées dans des souris receveuses irradiées de façon létale (Figure 1A). Typiquement, après l'injection comprise entre 15 à 20.000 cellules marquées, de 8 à 15 cellules sont généralement reconnaissable à l'intérieur de la zone d'imagerie de la moelle osseuse du crâne le lendemain. Ici, il est montré comment acquérir simples piles 3D de résolution de cellule de CSPS contenant les zones de la moelle osseuse d'environ 90 à 120 um d'épaisseur (figure 1B), suivie par 4D films time-lapse des HSPCs identifiés (figure 1C et cinéma).
On obtient des résultats sous-optimaux si le ciment dentaire n'est pas optimale préparé, par exemple, l'eau peut couler à partir de zones non scellées, et même si elle peut être rechargée à partir de la partie supérieure de la porte, d'une période de temps dans laquelle la lentille n'est pas trempée dans l'eau conduit au noir f rames. Certains dérive des images est inévitable en raison de la dilatation thermique des matériaux du support de la souris, mais il peut être accentué par l'adhérence du ciment sous-optimale, ce qui conduit à un décollement progressif de la souris, et par perturbation de la formation d'image mis en place, ce qui conduit à des changements soudains de la mise au point lors de l'imagerie time-lapse. Drift cours multi-point imagerie time-lapse peut aussi être causée par des inexactitudes dans les mouvements de la scène lors d'une nouvelle positions précédemment imagées. Drift et bégaiement artefacts dans les films en accéléré peuvent être corrigées par l'utilisation d'algorithmes d'enregistrement de l'image.
Tableau 1 excitation et les paramètres d'émission.
| Couleur Canal | Excitation | Émission |
| GFP | 13px; "> 488 nm500 à 530 nm | |
| Autofluorescence | 543 nm | 560 à 610 nm |
| DiD | 633 nm | 640 à 700 nm |
| SHG | 840 nm (MP) | 400 à 450 nm |
Figure 1: L'imagerie 4D in vivo de HSPCs dans la calotte crânienne de la souris. Cellules des exemples de résultats obtenus (B) tranches 2D à partir d'une pile 3D (profondeur totale est de 114 um), contenant le signal de collagène osseux (blanc), avez marqués (rouge) - (A) Schéma de l'expérience (C B).. , cel autofluorescentels (jaunes) et les ostéoblastes (en vert). Les barres d'échelle: 100 um tranches (C) 2D à partir d'un film de temps de déchéance 4D montrant un État n'ont marqué (rouge) de la migration dans la proximité des ostéoblastes (en vert).. La ligne pointillée met en évidence le déplacement de la cellule. Barres d'échelle: 50 um (B) et 100 um (c). REMARQUE:. Le film obtenu à partir de l'acquisition temps-lapse en (C) est montré pendant l'article vidéo S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Qu'est-ce qui a été accompli?
Le protocole utilise l'imagerie multidimensionnelle time-lapse de suivre la migration des FACS purifié, ex vivo étiquetés, HSPCs transplantées chez la souris crânienne moelle osseuse. Identification des cellules transplantées simples ont été réalisés et ceux-ci ont été suivis pendant des périodes prolongées (h) avec une grande précision. La respiration des artefacts de mouvement induits ont été minimisés et les cellules ont été reimaged plusieurs reprises sur une période prolongée plats.
Quelles sont les orientations futures?
Développement de la technique pourrait progresser vers des expériences de récupération pour permettre l'imagerie sur plusieurs jours, au cours d'une semaine ou plus et l'utilisation d'anesthésiques gazeux tels que l'isoflurane pour raccourcir et simplifier le processus de récupération de la souris (Remarque: des expériences de récupération doit impérativement conditions de chirurgie stériles et l'administration d'analgésiques approprié). Developpement d'une plus grande palette de couleurs de colorants in vivo ainsi que l'étiquetage génétique efficace des cellules hématopoïétiques facilitera également les expériences multi-étiquetage, permettront de mieux comprendre les interactions cellule-cellule au sein de la moelle osseuse et autoriser des expériences plus complexes à l'avenir. En outre, l'étiquetage simultanée de plusieurs structures de la moelle osseuse et les composants du stroma fournira un tableau plus complet des événements qui se déroulent dans des niches CSPS. la stabilité de l'image des films en accéléré pourrait être améliorée pré-acquisition en stabilisant le microscope autre ainsi que de minimiser les gradients de température dans l'échantillon et postacquisition en utilisant des algorithmes d'enregistrement de l'image.
Limitations:
La technique décrite présente certaines limitations. La survie des souris après l'administration d'anesthésiques injectables est imprévisible et il est très facile de complications de l'expérience en fonction de la réponse individuelle de l'anesthésique. Généralement, plus une session d'imagerie, le plus difficile est pour la souris pour récupérer de l'anesthésie et il est donc important de planifier soigneusement si la souris doit être récupéré, ce qui limite la durée idéale de la déchéance imagerie en temps. L'utilisation d'anesthésiques injectables limite la durée de chaque séance d'imagerie peut durer. Alors qu'il est possible de prolonger l'anesthésie par réadministrer une dose plus faible d'anesthésique, il est difficile effectuer cette précision et un surdosage de la souris est une des causes les plus fréquentes de la fin prématurée de l'imagerie in vivo. anesthésie au gaz est moins toxique et permet de plus d'une session de formation d'image initiale, mais une récupération rapide de la souris après> 2 heures de temps d'administration de l'isoflurane est rarement couronnées de succès. Une autre limitation de la technique est la résolution limitée des images qui peuvent être obtenus au cours de plusieurs points imagerie time-lapse, en raison de la nécessité d'acquérir rapidement des images. Ceci, couplé avec la dérive ou champ focal saute (disqueussed ci-dessus), peut faire le suivi des cellules difficile.
Comparaison avec d'autres méthodes:
HSPCs sont habituellement marqués avec le colorant lipophile DiD, mais DIR et DiI colorants sont des alternatives équivalentes et d'autres colorants cellulaires peuvent être utilisés aussi longtemps que suffisamment de lumière, tel que révisé en [16]. Même si avec DID a été démontré marquage ex vivo de cellules de ne pas affecter le fonctionnement à long terme de cellules souches hématopoïétiques, il a la limitation qui n'a (ou tout autre colorant chimique) est dilué sur la division cellulaire. Etant donné que les CSH se multiplient pendant les premiers jours suivant la transplantation, le rapport signal sur bruit de ces cellules se détériore rapidement. Marquage endogène de cellules au moyen d'une manipulation génétique et l'expression de protéines fluorescentes est une méthode alternative viable, tant que les protéines fluorescentes sont exprimés à des niveaux suffisamment élevés pour produire le signal détectable à travers l'os du crâne. Il existe un certain nombre d'alternatives techniques disponibles pour effectuer l'imagerie de HSPCs dans l'espace de la moelle osseuse, chacun avec leurs propres avantages et les limites. L'insertion de dispositifs d'imagerie à base de fibres optiques autorisé pour l'imagerie de la reconstitution de la moelle osseuse dans les os longs [8], tandis que l'imagerie confocale après une exposition chirurgicale du tibia et l'amincissement de l'émail de l'os avec un foret chirurgical [12] a produit des images détaillées de HSPCs demeurant à les zones périphériques des os longs. Cependant, ces méthodes sont beaucoup plus invasive que celle décrite ici et ne permettent donc pas de répéter les séances d'imagerie portant sur la même zone de la moelle osseuse dans la même souris. En outre, il est possible que ces techniques peuvent affecter les cellules observées donné la réponse inévitable à d'importants dégâts dans les tissus environnants. HSPCs ont été imagées pour de courtes périodes de temps par des lamelles placées sur excisées, fractures du fémur [11], mais l'impact de cette préparation dure du tissu sur HSPCs n'est pas CLEAr et de la technique a été utilisée uniquement pour obtenir simples observations ponctuelles de temps. Os fixes ont été coupés en sections de série, taché, et les images obtenues reconstruit dans un modèle 3D, offrant une excellente résolution en 3D, surtout quand moulages vasculaires sont utilisés [17], et plus récemment à balayage laser cytométrie (CTAS) a été utilisée pour obtenir quantitative mesures sur HSPCs in situ, mis en évidence par une coloration immunologique [18], mais sont incapables de fournir toute information temporelle sur le comportement des cellules. Les techniques décrites dans cette nouvelle technique fournissent une combinaison d'une bonne résolution en 3D, l'échantillonnage temporel suffisant pour le suivi des cellules en 4D et ils sont relativement non-invasive, par conséquent, offre une approche idéale pour réaliser un suivi à long terme de HSPCs interagir avec la moelle osseuse microenvironnement.
Acknowledgments
L'imagerie a été effectuée sur un Leica SP5 microscope confocal verticale situé dans le centre de FILM de l'Imperial College de Londres, dirigé par le Dr Martin Spitaler.
Le porte-échantillon et le casque a été fait en collaboration avec le département de génie chimique de l'Imperial College de Londres, avec les conseils de Samuel Jones et le Dr Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz et personnel de la SCS à l'Imperial College ont contribué pour leur aide et des conseils sur l'élevage de la souris. Mark Scott est financé par le programme au et FILM, Olufolake Akinduro par CRUK et Cristina Lo Celso par CRUK, KKLF, BBSRC et PSFH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
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