Summary
조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.
Abstract
정지 및 증식, 자기 갱신과 차별화 된 자손의 생산 사이의 미묘한 균형을 통해 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 모든 성숙한 혈액 세포 계통의 매출을 유지한다. 특정 HSC 운명에 이르는 복잡한 신호의 조정은 조혈 모세포 아직도 제대로 이해하는 복잡한 골수 미세 환경, [1-2] 사이의 상호 작용에 의존한다.
우리는 다단계 촛점 및 생체 영상 기술의 이광자 안정된 동물 포지셔닝 새롭게 개발 시험편 홀더를 조합함으로써, 높은 해상도 3D HSPCs 함유 스택 및 그 주변 틈새를 수득하고 시간이 지남에 따라이를 모니터링 할 수있다 방법을 설명 멀티 포인트 시간 경과 영상을 통해. 고화질 영상은 검출 생체 표지 조혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)가 골수 내에 거주 할 수 있습니다. 또한, 멀티 포인트 시간 경과 3D 이미징, 오빠른 취득 설정 btained, HSPC 운동과 HSPCs 간질 세포 사이의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공합니다.
GFP 긍정적 인 조골 세포 관련 HSPCs의 추적이 방법의 예시적인 응용 프로그램으로 표시됩니다. 이 기술은 두 개관 마우스 골수 공간 내에서 관심있는 적절히 표지 된 기질 또는 조혈 세포를 추적하는 데 이용 될 수있다.
Introduction
줄기 세포 틈새는 후각 망울, 근육 섬유, 모낭 돌출 또는 CNS 뇌실 영역 4-7로 수십 세를 인정하고 잘 많은 조직에서 특징졌습니다에도 불구하고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 및 골수 미세 환경 사이의 상호 작용 ( BM)은 여전히 좋지 의한 직접 뼈를 통해 단일 세포뿐만 아니라 조직 자체의 유체 극히 자연 관찰의 어려움으로 이해된다. 이는 다른 세포 유형 및 규제 신호의 복잡한 네트워크가 정지 사이의 정교한 균형을 조절하는 책임이 있는지, 절제 또는 조혈 모세포 또는 미세 자체의 간질 세포 중 특정 유전자를 과발현에 기초한 기능적 많은 연구를 통해 밝혀졌다 , 증식, 확장 및 조혈 모세포 1-2의 차별화. 조혈 모세포와 그 틈새 사이의 크로스 토크는 직접 관찰을 통해 깊이 이해 될 수있다. 이 ACH입니다뿐만 현미경의 관점에서 가능한 기술을 조합 한 고급 이미징 프로토콜 개발 ievable 덕분뿐만 아니라 시편 홀더 솔루션 및 수집 소프트웨어.
마우스의 두개골 뼈의 BM 실에서 이식 된 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 단일 셀 해상도 라이브 영상은 engrafting의 HSPCs 더 미성숙 세포 SDF-1, VCAM-1 양성 혈관 8-9의 근접 것을 지역화 것으로 나타났다 자신의 자손이 10보다 원위부 동안 GFP 양성 골아 세포 (조골 세포 제한 콜라겐 1α 프로모터는 GFP 발현을 구동하는 Col2.3-GFP 유전자 변형 마우스 라인)에서 20 미크론 - 15 내에서 발견된다. 유사 관찰 해부 및 뼈 골절 된 대퇴골 (11)로부터와 박형화 tibeal 뼈 (12)로부터 수득 하였다. 개관 골수 내 이미징 번째 HSPCs 직접적인 시각화를 달성하기 위해 최소 침습 접근 남아EIR 기본 미세.
모든 살아있는 검체 이미징 인해 샘플 불필요한 움직임 아티팩트를 회피 할 수만큼 샘플을 여전히 유지하는 고유의 필요성이 존재한다. 호흡 개관 골수 촬상시 회피해야 마우스 헤드의 진동 운동을시킨다. 그들은 정면 뼈를 방해하기 때문에 뇌 영상 및 전기 생리학에 대한 예를 들어 사용되는 기존의 정위 홀더, 두 개관 영상에 적합하지 않습니다. 라이브 영상과 전기 생리학 연구 13시 고통을 최소화 할 마우스 홀더부터는 두 성분 홀더와 고정하거나 보장 큰 아암에 연결된 촬상 윈도우를 생성하는 마우스의 머리에 고정 작은 조각으로, 개발 현미경 단계에 단단히 고정 무거운베이스 플레이트. 여전히 제자리에 헤드를 고정화하고 적절 m을 제거하면서 마우스 두개골에 머리 부재를 고정하는 자유를 허용 호흡호흡에 의한 ovements. 홀더 본체에 헤드 부분을 연결하는 A '로크 및 키'기구는 윈도우의 크기가되므로 수술을 간소화, 측위 정밀도가 향상뿐만 아니라 최소로 할 수 있도록하고, 스테이지에베이스 플레이트의 착용감 현미경에 대한 정확한 정렬 할 수 있습니다. 세포 운동성을 정확하게 모니터링하기 위해, 멀티 - 포인트 시간 경과 프로토콜은 시점 간 5 분 간격으로 시간이 지남에 따라 세포의 추적을 할 수 있도록 설계되었다. 여기에, 표시 DID 조혈 모세포는 col2.3GFP의 osteoblasitc 기자 마우스 10, 14에 주입 약 20 시간 후 몇 군데 있습니다. 디자인 된 여러 시간에 걸쳐 동일한 부분을 신속 다점 경과 이미징을 수행하는데 필요한 촬상 설정을 상세하게 설명한다 마우스 홀더.
Protocol
동물의 사용과 관련된 모든 절차는 로컬 법에 따라 수행된다. 우리의 연구는 영국 홈 오피스뿐만 아니라, 임페리얼 칼리지 윤리적 검토 패널에 의해 승인되었습니다. 허용되는 절차는 프로젝트 라이센스 문서에 설명 된 모든 시간에 동물의 복지를 보장 지침을 준수하고 있습니다. 작업이 수행되는 나라의 동물 실험에 대한 법률을 준수해야합니다.
1 레이블과 HSPCs 사출 :
- 소호되었습니다 Celso 14 ~ 15에 의해 설명 된대로 수확 세포.
- PBS에 10 6 세포 / ml의 농도로 세포를 준비한다. NOTE : 세포를 세는 혈구 또는 셀 소터에 의해 제공된 정보를 사용하여; 표지와 주입되는 셀의 수는 (20,000 - 조혈 모세포, 100,000 - 10,000 예컨대 얼룩 300,000의 HPC)를 세포 종류에 따라 다르며 이하 10 5 세포, PBS 100 ㎕에 재현 탁 작업하는 경우; 혈청 얼룩을 억제로는, 임의의 혈청없이 PBS에서 세포를 갖는 것이 중요하다.
- 5 μM의 최종 농도에서 세포 현탁액에 않았고 용액으로부터 석출 셀 라벨을 실패하지 않는 염료를 보장하기 위해 현탁액을 즉시 와동 추가한다.
- 5 분 동안 500 XG에서 회전 액체를 경사 분리 및 IV 주입 (- 150 μL ~ 100)에 적절한 볼륨의 펠렛을 재현 탁하여 세척 한 후 37 ° C에서 10 분 동안 품어
- 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하고 세포를 인슐린 주사기에 수집한다. 참고 : 마우스로 전체 세포 현탁액을 관리 할 수 있으므로 더 바늘 죽은 공간이 없으며 때문에 인슐린 주사기는 기존의 주사기를 통해 권장합니다.
- 꼬리 정맥 주사를 통해 치명적으로 조사 된 마우스로 세포를 주입한다. 주 : TI를 통해 개발 골수 미세 환경 (조혈 및 기질 구성 요소를 모두)에 대한 조사 알려져있다 상당한 영향나. 그것은 일관된 사출 용 타이밍, 셀 주입 (최상 생착 대한 조사에서 4-24 시간) 및 이미징을 유지하는 것이 매우 중요하다. 여기 조사는 주입 전에 6 시간을 수행하고 영상은 주사 후 20 시간 수행됩니다.
- 꼬리 정맥이 vasodilated 나타날 때까지 따뜻한 챔버 (37 ° C)에 마우스를 놓습니다.
- 제한 수단으로 마우스를 이동 조심스럽게 꼬리 정맥에 바늘을 밀어 넣습니다.
- 정맥에 세포를 주입 - 주입에 아무 저항이 발생 될 수 없습니다.
- 세포가 골수 스페이스로 이주 할 수 있도록하기 위해 마우스 O / N을 남기기.
2 이미징을위한 마우스 준비
- 미세 겸자 일쌍 한 미세 쌍이 위뿐만 아니라 멸균 환경에서 사용하기 전에 헤드 피스 및 저장소를 압력솥.
- 가능한 한 신선한로 마취를 확인 (0.38 ML 케타민 + 0.25 ㎖의 Medetomidine + 4.47 ㎖의 물). 참고 : OT이소 플루 란 등의 주사를 포함하여 그녀의 승인 마취제은 너무 유효합니다. 1 시간마다 45 분 관리 50 μL - 설명 칵테일 (30)의 상단 업으로, 체중 10g 당 0.1 ㎖의 복강 내 투여한다.
- 필요한 경우 메시지가 표시되면 다음 단계를 교정, 현미경 및 소프트웨어를 시작 두 광자 레이저에 전환합니다. 레이저에 전환하고 워밍업 및 이미징을위한 마우스를 준비하는 동안 안정화 할 수 있습니다.
- 복강 내 주사를 통해 선택된 마취 용 준비 마취 혼합물 (단계 2.2)를 사용하여 마우스를 마취. 현재와 프로토콜에 걸쳐 정기적으로 페달 반사를 통해 깊은 마취의 발병을 모니터링합니다. 참고 : 마우스가 절차를 통해주의 깊게 모니터링하고 마취가 경감 될 나타나는 경우해야 - (2.2에서 설명하는대로) (일반적으로 +45 60 분) 후 최고 최대 용량을 관리 할 수 있습니다. 다양한 연령과 성별의 쥐 사이에 어떤 변화를 기대합니다. 그것은 떠오입니다적절한 예방 조치를 확인하기 위해 해당 지역의 수의학 담당관 마취 프로토콜을 논의하기 위해 TANT은 마우스의 복지를 보장하기 위해 가져옵니다.
- 마우스의 눈에 들어 에탄올을 얻을 않도록하면서, 조직에 70 % 에탄올로 두피의 상단 면봉.
- 멸균 된 핀셋 및 가위를 사용하여, 신중하게 묘화 될 수있는 두 개관 영역을 노출하는 두피 중앙부를 제거 포셉 피부를 올려 귀 사이의 후두부에 작은 절개를. 피부를 잡고있는 동안, 피부 아래에 가위를 밀어 부드럽게 원하는 이미징 영역의 바깥 쪽을 따라 절단.
- 습기를 유지하기 위해 멸균 PBS에 적신 멸균 면봉 노출 된 뼈를 닦습니다.
- 이미징을위한 준비 마우스의 두개골 금속 헤드 부분을 연결합니다.
- 이 페이스트가 될 때까지 계량 보트 치과 용 시멘트를 적당량 혼합하고 빠르게 S에 부착된다 헤드 피스의 저면에 적용컬 소장.
- 시멘트 설정하기 전에, 다음, 확인 이미징 영역에있는 모든 치과 시멘트 묻지 않도록하고, 마우스의 두개골에 투구 배치가 설정 될 때까지 기다립니다.
- 두개골 촉촉한 유지 사이트 내 히드로 겔의 작은 금액을 적용합니다.
- 홀더에 헤드 피스를 부착하고 홈이 홀더의 홈에 맞춰 보장, 나사를 사용하여 제자리에 고정합니다.
- 현미경으로 전송하기 전에 멸균 PBS로 멸균 면봉 두개골 깨끗한에서 하이드로 젤을 제거합니다.
- 현미경 단계에 홀더를 삽입 마우스 아래에있는 난방 매트를 놓고 직장 온도계 프로브를 삽입하고 접착 테이프로 무대에 장소에 모든 것을 고정합니다.
- 그들이 마취에서 동안 건조하지 않도록 마우스의 눈에 안과 연고의 작은 방울을 놓습니다. 참고 : 마취 상태에서 마우스 이미징 프로세스 중 언제라도 방치하지 마십시오.
생체 이미징 : 고해상도 스택 및 시간 경과 취득
- 눈 조각을 통해 두개골에 초점을 맞 춥니 다.
- , 정제, 멸균 물과 물 침지 렌즈를 사용하여 이미지 창을 채우기는 물방울 닿도록 내려 놓습니다.
- 광원으로서 외부 램프를 사용하여, 현미경 접안 렌즈를 이용하여 두개골 위에 초점.
- 중앙 봉합에 촬상 영역을 배치하고 시작 위치로서 코로나 봉합사를 찾는 헤드의 후방을 향해 이동한다.
- 여기 및 발광 표에 지정된 해당 형광체의 유효 여기 및 검출을 허용하도록 현미경을 설정한다. 참고 : 기존의 검류계 스캔 헤드가 LAS-AF 소프트웨어 플랫폼을 실행하는 라이카 SP5 똑바로 공 초점은 여기에 사용되는 반면, 프로 시저가 쉽게 다른 현미경 / 소프트웨어 플랫폼에 복제 할 수 있습니다. 여기에 사용되는 렌즈는 라이카 HCX IRAPO L 25X W / B를 0.95 NA이며다른 제조사의 유타 해당하는 렌즈는 적절한 배율과 높은 NA 사용할 수 있습니다
- 512 X 512 픽셀로 모두 XY 이미지뿐만 아니라 400 Hz에서 3D Z-스택 및 설정 이미징 속도와 해상도를 캡처 모드로 소프트웨어를 놓습니다. 참고 : 설치 및 하드웨어는 여기에 620 μM의 시야 결과이 다른 플랫폼과 다를 수 있습니다.
- 다중 채널 / 트랙뿐만 아니라 수집 방법은 적어도 스택 가능한 경우 또는 프레임들 사이의 설정을 변경하는 설정되도록, 포착 될 수 있도록하는 소프트웨어를 설정한다. 각 스택의 취득의 끝에 레이저 조명을 끄, 세 독립적 인 캡처 설정을 설정한다. 참고 : 세 개의 채널 채널 사이의 크로스 토크를 줄이기 위해이 절차를 위해 필요합니다.
- 설정이 광자 SHG 뼈 신호 (840 nm의 여기, 400-440 nm의 발광)를위한 제 순차 스캔 설정; MP 레이저에 셔터를 열고 M을 보장25 % 및 레이저가 켜진다 - P 이득 및 오프셋이 올바르게 설치하고, 레이저 파워는 12.5이다. 유일한 검출기 등의 적절한 PMT를 선택하고 색상을 흰색으로 변경합니다. 참고 : 사용할 수있는 밝고 깊은 신호를 달성하기 위해 적절한 때 필터 NDD 감지기는 뼈 검출을 위해 사용되어야한다.
- 반복 채널 설정 결합 된 형광도에 대한 GFP 채널에 사용되는 절차 (543 nm의 여기, 560 - 600 ㎚ 방출) 및 DID (633 nm의 여기, 650-720 nm의 방출) 초 설정에서 두 적절한 PMT가를 활용하여 스캔 할 수 있습니다. 자가 형광 녹색, DID 빨간색으로 채널의 색상을 변경합니다. 참고 : 자동 형광 채널이 두 채널 오버레이 아르 DID 양성 세포를 쉽게 감지 할 수 있습니다 녹색으로 사용 - autofluorescent 세포 인해 두 채널의 동안 것에으로 노란색 / 오렌지색으로 표시했다 세포는 그들이 단지에 표시하기 때문에 빨간색으로 표시 채널을했다. 자동 형광 채널표시 목적은 GFP 채널과의 혼동을 피하기 위해, 사용자에 대해, 이것은 다른 컬러로 변경 될 수 있지만하고자하는 경우에만이 비교를 위해 사용되는 모든 최종 분석에 사용되지 않는다.
- 마지막으로, 설치 GFP의 세 번째이자 마지막 스캔 (488 nm의 여기, 500-530 nm의 방출); 필수 후 약 15 %의 488 nm의 레이저 라인의 레이저 파워를 설정하거나 레이저 적절한 수준이 활성 검출기로서 적절한 PMT를 선택하고 녹색에 그 의사 색조를 변경, 사용되는 경우에 셔터가 개방되어 있는지 확인.
- 선택된 채널의 미리보기 스캔을 시작하고 검출기 이득을 조정하고 최적의 노출을 상쇄하기 위해 '라이브'영상 모드를 활성화합니다. 연속 창에서 각 스캔에 대해이 작업을 반복합니다.
- 쉽게 다시 이러한 멀티 채널 스캔의 설정을 저장합니다. 참고 :이 사용자가 이후 세션의 설정을 다시로드 할 수 있습니다.
- '마크라고도 다중 위치 캡처, 활성화차 입증 된 소프트웨어에서 '찾아 좌표 점을 다시 설정합니다.
- 중앙 및 관상 봉합의 교점에서 시작하여 뼈 촬상 영역을 스캔, 모두 자기 형광을 이용하여 골수 영역의 깊이를 스캔 (의사 녹색 컬러) 및 DID (의사 컬러 적색) 복합체보기. 참고 : autofluorescent 세포는 두 채널 모두에 존재하고 표지 세포가 합성 이미지 빨간색 전용 세포로 나타납니다 않은 반면, 합성 이미지에 노란색 / 오렌지 나타납니다.
- 셀이 감지되면 마크 "의 왼쪽에 새로운 위치 아이콘을 추가"찾기 "창을 클릭하여 도구를 새로운 좌표 위치 (X, Y 및 Z)로이 마크 '마크와 찾기' .
- 뷰의 현재의 필드가 검토 된 경우, 왼쪽 / 오른쪽 / 위 / 아래 어느 뷰의 하나의 필드의 무대에게 거리를 이동합니다. 서서히 번째의 좌측 전체 촬상 창 주변 작동 뷰의 각 필드에 대해이 과정을 반복전자 중앙 봉합, 마우스의 코쪽으로 이동. 중앙 봉합 분기점 광경되면 봉합사의 우측으로 이동하여 (코로나 봉합을 향해, 즉 ') 반대 방향으로 좌측 스캔 절차를 반복한다. 사용하여이자의 새로운 세포의 좌표 마크 '표시를하고 찾기'도구를.
- 촬상 화면의 주사가 완료되면, '마크 및 찾기'를 사용하는 점을 검토 툴 (원하는 지점을 선택하고 개별적으로 각 점을 검토). 각 위치에 대한 각 셀 주위에 Z-스택의 상단과 하단을 설정, (많은 소프트웨어 플랫폼은 빈 공간을 캡처 감소 각 위치에 대한 독립적 인 Z-스택을 수행 할 수 있습니다). 각 지점의 경우, 최대 초점을 아래로 3D Z-스택 캡처 상단과 하단 Z 위치를 설정하고의 개별 지점을 업데이트 '마크와 찾기'. 도 5μm에 Z-스택 간격을 설정하고 적절한 품질에 대한 각 순차 스캔 채널에 대한 평균 : 라인 오R 프레임 평균. NOTE : 평균 스캔 할 수 늘리기가 획득 시간을 증가시킨다.
- 전체 스캔 절차를 시작하여 관심있는 각각의 점에 대한 높은 품질 기준을 획득 스택 (종종 오히려 "캡처"보다 '시작'이라 함). 참고 :이 검사는 미래 고속 이미징에 대한 기준 역할을 할 수 있습니다.
- 일단, 고품질의 스캔으로 완성 캡처 저속 설정을 활성화.
- 저속 설정에서 원하는 길이 (예를 들어, 5 시간)으로 5 분, 전체적인 실행 시간에 시간 간격을 설정한다. 전체 스캔 이러한 설정을 '적용'. 주 : 5 분의 시간 경과 간격을 허용하기 위해이 검사 시간을 줄이기 위해, 한 평균화에 사용되는 스캔의 수를 줄일 512 X 512 픽셀의 해상도를 제한 할 필요 위상 정정 (양방향으로 스캐닝을 변환 할 필요가있다 ) 모두 스캔 방향을 정렬 및 / 또는 600 Hz에서 이상 (600 개 이상으로 스캔 속도를 증가Hz에서)를 보여 소프트웨어 플랫폼에 대한 이미징 영역의 확대의 원인이됩니다. 이것은 순차 촬상 모드가 초기 고화질 화상 스택을 획득하기 위해 사용되는 동안, 동시 취득이 경과 촬상 중에 속도를 증가시키는 데 사용된다는 점에 유의하는 것이 중요하다 -이 추가 배치 채널간에 약간의 혼선이 발생할 수있다 정확하게 분리 참조 스택의 초기 캡처에 대한 중요성.
- (입증 된 소프트웨어의 '시작'버튼을 클릭하여 이전) 이미징 시작. 참고 : 건조하고 활력 징후 및 난방 패드의 온도를 모니터링하지 않습니다 정기적으로 필요할 때 마우스를 과잉 섭취하지 않도록주의, 더 작은 용량을 투여하여 마취의 적절한 수준을 유지 목적을 보장하기 위해 물을 위로해야 전역.
- 완료되면, 직장 프로브와 시간에서 와이어를 보장 홀더에서 렌즈를 인상 한 후 현미경 스테이지에서 홀더를 제거매트를 먹는 것은 손상되지 않습니다.
- 무대 홀더에서 투구를 풀고 조심스럽게 마우스를 제거합니다. 자궁 전위를 사용하여 마우스를 추려 두개골 떨어져 끼워 금속 머리 조각을 제거합니다. 디스크에 데이터를 저장하고 나중에 분석을 위해 서버로 전송합니다. 참고 : 머리 조각이 이상적으로 몇 시간 동안 아세톤에 침지 마지막 잔여 시멘트 오프를 문질러 청소한다.
Representative Results
만든 사용자 정의는 두 개관 영상 창을 포함하여 고정밀 마우스 홀더는 치명적으로 조사받는 마우스 (그림 1A)에 주입 FACS 정제, 표시 HSPCs의 장기 이미징을 할 수 있습니다. 일반적으로 15 사이의 주사 후 - 천 (20) 레이블 세포, 8-15 세포는 두개골 다음 일의 골수 이미징 영역 내에서 일반적으로 인식 할 수 있습니다. 확인 된 HSPCs (그림 1C 및 동영상)의 4D 시간 경과 영화 다음 120 μm의 두께 (그림 1B) - 여기에는 약 90의 골수 영역을 HSPC이 함유 단일 셀 해상도 3D 스택을 취득하는 방법에 표시됩니다.
치과 용 시멘트가 최적으로 제조되지 않은 경우 차선의 결과는, 예를 들면 물과는 홀더의 상부로부터 얹어 될 수 있더라도, 비 밀봉 영역으로부터 누출 수 얻어지는, 시간의 기간이되는 렌즈를 침지되지 않는다 물에 검은 색 F 리드 rames. 이미지의 일부 드리프트 갑작스런 점프 선도 그러나 그것은 마우스 프로그레시브 박리로 이어지는 차선 시멘트 밀착성 의해 지기도하고, 설정된 촬상의 섭동에 의해 수 인해 마우스 홀더의 재료의 열팽창에 불가피 시간 경과 이미징 동안 초점. 이전에 몇 군데 위치를 다시 방문 할 때 멀티 포인트 시간 경과 이미징 동안 드리프트는 무대의 움직임에 부정확 발생할 수 있습니다. 시간 경과 영화 드리프트와 더듬 유물 이미지 등록 알고리즘을 사용하여 보정 할 수 있습니다.
표 1 여기 및 방출 설정.
| 컬러 채널 | 여기 | 방출 |
| GFP | 13px; "> 488 nm의500-530 nm의 | |
| 자기 형광 | 543 nm의 | 560-610 nm의 |
| DID | 633 nm의 | 640-700 nm의 |
| SHG | 840 nm의 (MP) | 400-450 nm의 |
마우스 두 개관에서 HSPCs의 생체 4D 영상에서 그림 1. 실험의 (A) 개요 (B - C).. 얻어진 결과의 예 (B) 3D 스택에서 2D 조각 (총 깊이 114 μm의 경우), 콜라겐 뼈 (흰색)에서 신호를 포함하는 표시 DID 세포 (적색) , autofluorescent CELLS (노란색)와 조골 세포 (녹색). 스케일 바 :. 골아 세포 (녹색)에 근접하여 마이그레이션 레이블 않았다 HSC (빨간색)를 보여주는 4D 시간 경과 영화에서 100 μm의 (C) 2D 조각. 점선은 셀의 변위를 강조한다. 스케일 바 : 50 μm의 (B) 및 100 μm의 (C). 참고 :. 비디오 문서에 보이는 (C)의 시간 경과 수집에서 얻은 동영상 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
무엇을 성취했다?
프로토콜은 마우스 두개골 골수 정제하여 FACS의 이주, 생체 표지, 이식 HSPCs을 모니터링 경과 다차원 이미징을 사용한다. 하나의 이식 세포의 확인이 달성되었고, 이러한 고정밀 시간 (시간)의 장기간에 걸쳐 모니터링 하였다. 호흡에 의한 움직임 아티팩트는 최소화하고 세포를 반복적으로 오랜 시간에 걸쳐 이미지를 다시하고있다.
향후 방향은 무엇입니까?
기술의 발전은 단축과 주 (마우스에 대해 복구 프로세스를 단순화하기 위해 주 이상 및 이소 플루 란과 같은 가스 마취제의 사용 과정을 통해, 여러 날 촬상 있도록 회복 실험 진전 수 : 회복 실험이 엄격하게 필요 무균 수술 조건으로 적절한 진통제의 투여). 데브생체 염료의 큰 컬러 팔레트뿐만 아니라, 또한, 멀티 - 표지 실험을 용이 골수 내의 세포 - 세포 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공하고, 미래에 더욱 복잡한 실험 허용 조혈 세포의 효율적인 유전자 표지의 elopment. 또한, 다수의 골수 구조 및 기질 성분의 동시 라벨링 HSPC 틈새에서 발생하는 이벤트의보다 완전한 화상을 제공 할 것이다. 시간 경과 영화 이미지 안정성은 현미경을 안정화뿐만 아니라, 상기 이미지 정렬 알고리즘을 사용하여 샘플과 postacquisition에서 온도 구배를 최소화함으로써 preacquisition을 향상시킬 수있다.
제한 사항 :
설명이 기술은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 주 사용 마취제의 투여 후 쥐의 생존은 예측 불가능하며 개별 응답에 따라 경험 합병증에 매우 쉽습니다마취. 마우스를 마취로부터 회복하고 마우스 이상적 시간 경과 영상의 재생 시간을 제한하는, 복구 할 경우주의 깊게 계획하는 것이 중요하다 위해 일반적으로 촬상 세션 이상 어렵게이다. 주 사용 마취제의 사용은 각 이미징 세션이 지속될 수있는 시간을 제한한다. 이 마취제의 작은 투여하여 마취 readministering을 연장하는 것이 가능하지만, 그것은 어려운이 정확하고 마우스를 과잉 투여하는 것은 생체 내 이미징의 조기 종료의 가장 흔한 원인 중 하나로 수행된다. 이소 플루 란의> 2 시간 오랫동안 관리가 거의 성공 후 가스 마취 마우스 그러나 빠른 회복, 적은 독성이 더 긴 초기 이미징 세션 수 있습니다. 또 다른 기술의 한계로 인해 급속하게 이미지를 수집 할 필요성으로, 다점 경과 촬상 동안 얻을 수있다 화상의 해상도가 제한된다. 초점 드리프트 또는 필드 결합이, (디스크 점프) 위 ussed, 세포의 추적을 어렵게 만들 수 있습니다.
다른 방법과의 비교 :
HSPCs는 일반적했던 친 유성 염료로 표시되어 있지만, [16]에서 검토로 DIR 및 DII 염료는, 대신 할 수있는 대체 및 다른 세포 염료만큼 충분히 밝은 사용할 수 있습니다. 세포의 체외로 라벨링이 조혈 모세포의 장기 기능에 영향을주지 밝혀졌다 않았지만, 그것은 세포 분열에 희석 DID 제한 (또는 다른 화학적 염색)를 갖는다. 조혈 모세포 이식 후 처음 일 동안 증식 때문에, 이러한 셀들에 대한 신호 대 잡음비가 급격히 저하된다. 유전자 조작 및 형광 단백질의 발현에 의해 세포의 내생 라벨링 형광 단백질 두개골 뼈를 통해 검출 신호를 생성하기에 충분히 높은 수준으로 발현되는만큼, 대안 방법이다. 대안 TECHN에는 여러 가지가 있습니다사용할 iques 자신 장점과 한계, 골수 공간 내 각 HSPCs의 촬상을 수행한다. 공 촛점 이미지는 외과 드릴 경골 뼈 에나멜 얇아 수술 노출을 따르면서 광섬유 기반 이미징 장치의 삽입은, 긴 뼈 [8]에서 골수 재구성의 촬상 허용 [12] HSPCs가 거주의 상세한 이미지를 생성 긴 뼈의 주연 영역. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 침습적 여기서 설명과 동일하므로 마우스 내의 동일 골수 영역에 초점을 촬상 세션을 반복하도록 허용하지 않는 한보다. 또한, 이들 기술은 주변 조직에 큰 손상을 피할 응답 주어진 관찰 세포에 영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하다. HSPCs은 절제, 골절 된 대퇴골 [11] 위에 배치 된 커버를 통해 짧은 시간 동안 묘화되어, HSPCs에 조직이 거칠고 준비하지만 영향 클레아 아니다R 및 기술은 하나의 시점에 관찰을 얻기 위해 고유 사용 하였다. 고정 뼈 염색, 직렬 섹션으로 절단하고, 얻어진 화상이 혈관 캐스트가 사용되는 특히 우수한 3D 해상도를 제공하는, 3 차원 모델로 재구성되었다 [17], 최근에는 레이저 스캐닝 세포 계측법 (LASC) 정량적 얻기 위해 사용되었다 현장에서 HSPCs에 대한 조치는 [18] 면역 염색에 의해 강조하지만, 세포의 행동에 대한 시간 정보를 제공 할 수 없습니다. 이 새로운 기술에 설명 된 기술들은 4d에 셀을 모니터링하는 차원에서 양호한 해상도, 충분한 시간적 샘플링의 조합을 제공하고 따라서 골수와 상호 작용 HSPCs 장기간 모니터링을 달성하기 위해 적합한 방법을 제공하고, 상대적으로 비 침습 미시.
Acknowledgments
영상은 박사 마틴 Spitaler에 의해 관리 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 FILM 시설 내에있는 수직 라이카 SP5 공 초점 현미경을 실시 하였다.
시편 홀더와 헤드 피스는 사무엘 존스 박사 사이먼 슐츠의 조언과 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 화학 공학과와 공동으로 이루어졌다.
니콜라 Ruivo, 시스코 디아즈와 임페리얼 칼리지에서 CBS 직원은 마우스 사육에 자신의 지원과 조언을 쓸모 있었다. 마크 스콧 CRUK, KKLF, BBSRC 및 HFSP에 의해 CRUK와 크리스티나 소호되었습니다 Celso에 의해 HFSP 및 FILM, Olufolake Akinduro에 의해 투자된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance. J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).
- Wang, L. D., Wagers, A. J. Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).
- Schofield, R. The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).
- Bischoff, R. Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers. Development. 109 (4), 943-952 (1990).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators. Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Lewandowski, D., et al. In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Xie, Y., et al. Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging. Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).
- Köhler, A., et al. Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones. Blood. 114 (2), 290-298 (2009).
- Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells. J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).
- Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow. Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso,, C, From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Ellis, S. L., et al. The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Nombela-Arrieta, C., et al. Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment. Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).
