Summary
De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.
Abstract
Door een delicate balans tussen rust en proliferatie, zelfvernieuwing en productie van gedifferentieerde nakomelingen hematopoietische stamcellen (HSCs) handhaven van de omzet van alle rijpe bloedcellen lineages. De coördinatie van complexe signalen leidt tot specifieke HSC lot berust op de wisselwerking tussen HSC en ingewikkelde beenmerg micro-omgeving die nog steeds slecht begrepen [1-2].
We beschrijven hoe een combinatie van een nieuw ontwikkelde monsterhouder voor stabiele dierlijke positionering meerstaps confocale en twee-foton in vivo beeldvorming, is het mogelijk om hoge-resolutie 3D stacks met HSPCs en hun omgevende niches en ze te tijdig te signaleren door middel van multi-point time-lapse imaging. High definition imaging laat het opsporen van ex vivo gelabeld hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) die woonachtig zijn in het beenmerg. Bovendien, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained met snellere acquisitie instellingen, geeft nauwkeurige informatie over HSPC beweging en de onderlinge interacties tussen HSPCs en stroma cellen.
Tracking van HSPCs inzake GFP positieve osteoblastische cellen wordt getoond als een illustratieve toepassing van deze methode. Deze techniek kan worden gebruikt om elke gemerkte hematopoietische of stromale cellen van belang in de muis calvarium beenmerg ruimte volgen.
Introduction
Ondanks stamcellen niches te zijn erkend voor tientallen jaren 3 en goed gekarakteriseerd in vele weefsels, zoals het reukorgaan, spiervezels, haarfollikel bobbel of CNS subventricular zone 4-7, de interacties tussen hematopoietische stamcellen (HSC) en beenmerg micro-omgeving ( BM) zijn nog slecht begrepen omdat het moeilijk direct te observeren enkele cellen door het bot en de zeer soepele aard van het weefsel zelf. Het is getoond, een aantal functionele studies gebaseerd op ablatie of door overexpressie van specifieke genen in zowel HSCs of de stromale cellen van de micro zelf, dat een ingewikkeld netwerk van verschillende celtypes en regulerende signalen verantwoordelijk voor het reguleren van het delicate evenwicht tussen rust , proliferatie, expansie en differentiatie van HSC 1-2. De overspraak tussen HSC en hun niches kunnen in de diepte alleen begrepen worden door middel van directe observatie. Dit is achievable dankzij de ontwikkeling van geavanceerde imaging protocollen, het combineren van de beschikbare technologie niet alleen in termen van microscopie, maar ook van de specimen houder oplossingen en van acquisitie software.
Single cell resolutie levende beeldvorming van getransplanteerde hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) in de BM compartiment van de muis schedeldak botten blijkt dat enting HSPCs lokaliseren in de nabijheid van SDF-1 en VCAM-1-positieve vaten 8-9 en meer onrijpe cellen gevonden binnen 15 - 20 micron van GFP-positieve osteoblastische cellen (Col2.3-GFP transgene muis lijn, waarbij de osteoblast beperkte collageen 1α promoter GFP-expressie) terwijl hun nakomelingen zijn distale 10. Soortgelijke waarnemingen werden verkregen uit ontleed en gebroken dijbeen botten 11 en vanaf uitgedund tibeal beenderen 12. Beeldvorming van calvarial beenmerg blijft de minst invasieve benadering van directe visualisatie van HSPCs binnen th bereikenMER inheemse micro-omgeving.
Met levende specimens beeldvorming is er een inherente noodzaak om de steekproef zo stil mogelijk te houden om onnodige artefacten als gevolg van sample verkeer te voorkomen. Ademhaling veroorzaakt oscillerende bewegingen van de muis hoofd, die moeten worden vermeden bij de beeldvorming calvarial beenmerg. Conventionele stereotactische houders, bijvoorbeeld gebruikt voor beeldvorming van de hersenen en de elektrofysiologie, zijn niet geschikt voor calvarium beeldvorming, omdat ze de voorhoofdsbeenderen belemmeren. Uitgaande van een muis houder gebruikt ongemak in levende imaging en elektrofysiologische studies 13 minimaliseren, werd een houder 2 componenten ontwikkeld, met een klein stuk naar de kop van de muis bevestigd aan een beeldvormende venster verbonden met een grotere arm waarborgen steady houden met creëren zware basisplaat die stevig is bevestigd aan de microscoop podium. Vastzetten van het kopstuk aan de schedel van de muis maakt vrije ademhaling terwijl het immobiliseren van het hoofd in plaats adequaat elimineren movements gevolg van de ademhaling. A lock-and-key "wetmatigheid hoofd-stuk naar het houderlichaam kan de grootte van het venster ook geminimaliseerd worden voor verhoogde nauwkeurigheid van de positionering derhalve vereenvoudiging van de operatie en de pasvorm van de basisplaat in het stadium accurate aanpassing aan de microscoop. Om beweeglijke cellen nauwkeurig te bewaken, werd een multi-point time lapse-protocol ontworpen om het bijhouden van de cellen mogelijk te maken in de tijd met 5 minuten intervallen tussen de tijdstippen. In casu heeft het label HSC worden geïnjecteerd in col2.3GFP osteoblasitc reporter muizen 10,14 en afgebeeld ongeveer 20 uur later. De muis houder die ontworpen en imaging instellingen waarbij snelle multi-point time-lapse imaging van dezelfde gebieden tijdens een periode van meerdere hr worden beschreven.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren worden vervoerd in overeenstemming met de lokale wetgeving. Ons werk is goedgekeurd door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en de Imperial College ethische beoordeling panel. De toegestane procedures zijn beschreven in het project licentie documentatie en volgen richtlijnen die het welzijn van de dieren te allen tijde te waarborgen. Verzekeren zich te houden aan de wetgeving inzake dierproeven van het land waar de werkzaamheden worden verricht.
1 Labeling en Injectie van HSPCs:
- Oogst cellen zoals beschreven door Lo Celso 14-15.
- Bereid de cellen bij een concentratie van 10 6 cellen / ml in PBS. OPMERKING: Gebruik een hemocytometer of de door de cel sorter informatie om de cellen te tellen; het aantal cellen te etiketteren en geïnjecteerd afhankelijk van het celtype (roestvrij bijvoorbeeld 10.000 - 20.000 HSCs, 100,000 - 300,000 HPC); als het werken met minder dan 10 5 cellen, resuspendeer in 100 ul PBS; is het belangrijk om de cellen in PBS zonder enig serum, zoals serum remt de kleuring.
- Toevoegden aan de celsuspensie in een uiteindelijke concentratie van 5 uM en vortex de suspensie onmiddellijk naar de kleurstof waarborgen niet neerslaat uit de oplossing en niet aan de cellen te labelen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C was daarna door spinnen bij 500 xg gedurende 5 min, decanteren van de vloeistof en de pellet opnieuw suspenderen in een geschikt volume voor intraveneuze injectie (~ 100 - 150 pl)
- Resuspendeer de cellen in 200 ul PBS en verzamelen in een insulinespuit. OPMERKING: een insulinespuit geprefereerd boven een conventionele injectiespuit omdat het geen naald dode ruimte en maakt daardoor het toedienen gehele celsuspensie om de muis.
- Injecteer cellen in een lethaal bestraalde muizen via staartader injectie. OPMERKING: Bestraling heeft gekend, een aanzienlijke impact hebben op het beenmerg micro-omgeving (zowel hematopoietische en stromale componenten), die zich ontwikkelt op time. Daarom is het zeer belangrijk is dat de timing voor bestraling celinjectie (4 tot 24 uur van bestraling voor de beste engraftment) en beeldvorming handhaven. Hier bestraling wordt uitgevoerd 6 uur vóór de injectie en beeldvorming wordt uitgevoerd 20 uur na de injectie.
- Plaats de muis in een warme kamer (37 ° C) totdat de staartader verschijnt vasodilated.
- Beweeg de muis naar de weerhouder en schuif de naald in de staart ader.
- Injecteer de cellen in de ader - geen weerstand aan injectie worden aangetroffen.
- Laat de muis O / N zodat de cellen migreren naar het beenmerg ruimten.
2 Voorbereiding van de muis voor Imaging
- Autoclaaf een paar fijne tang en een paar fijne schaar en een hoofddeksel voorafgaand aan het gebruik en op te slaan in een steriele omgeving.
- Make up verdoving zo vers mogelijk, (0,38 ml Ketamine + 0,25 ml Medetomidine + 4,47 ml water). OPMERKING: othaar goedgekeurde anesthetica, zoals isofluraan en andere injecteerbare zullen ook effectief zijn. De beschreven cocktail wordt intraperitoneaal toegediend bij 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht, met boven-ups van 30 - 50 gl elke 45 minuten toegediend 1 uur.
- Schakel de twee-foton laser indien nodig start de microscoop en software, het kalibreren van het toneel wanneer daarom wordt gevraagd. Schakel de lasers en hen in staat stellen om op te warmen en te stabiliseren, terwijl de voorbereiding van de muis voor de beeldvorming.
- Verdoven van de muis met behulp van de voorbereide anesthesiemengsel (stap 2.2) voor de gekozen verdoving via intraperitoneale injectie. Bewaak het ontstaan van diepe narcose via pedaal reflex nu en op regelmatige tijdstippen gedurende het protocol. OPMERKING: de muis moet zorgvuldig worden gecontroleerd gedurende de procedure en als verdoving lijkt te verlichten (meestal na 45 - 60 min) dan toedienen van een top-up dosis (zoals beschreven in 2.2). Verwacht wat variatie tussen de muizen van verschillende leeftijden en geslacht. Het is IMPORtant aan de anesthesie protocol met uw lokale veterinaire ambtenaar bespreken om adequate voorzorgsmaatregelen worden genomen om ervoor te zorgen het welzijn van de muis te waarborgen.
- Veeg de bovenkant van de hoofdhuid met 70% ethanol op een weefsel, zodat geen enkele ethanol krijgen in de ogen van de muis.
- Met steriele pincet en schaar, verwijder het centrale deel van de hoofdhuid het calvarium gebied te beelden bloot: een kleine incisie aan de achterkant van het hoofd tussen de oren door het opheffen van de huid met de tang. Terwijl de huid omhoog, schuif de schaar onder de huid en zachtjes snijd langs de buitenkant van de gewenste beeldvorming gebied.
- Veeg de blootgestelde bot met steriel wattenstaafje bevochtigd met steriele PBS om het vochtig te houden.
- Bevestig de metalen kopstuk aan de schedel van de muis klaar voor beeldvorming.
- Meng een voldoende hoeveelheid tandheelkundig cement in een gewichtboot totdat het een pasta en snel toegepast op het onderoppervlak van het kopstuk die hechten aan de skull.
- Voordat het cement sets, plaats de helm op de schedel van de muis, en zorg ervoor dat er geen tandheelkundige cement op de beeldvorming gebied te krijgen, dan wachten tot het te stellen.
- Breng een kleine hoeveelheid van Intrasite Hydrogel waarvan de schedel vochtig houdt.
- Bevestig het kopstuk aan de houder en vast te zetten met behulp van de schroef, zodat de groeven passen binnen de houder inkepingen.
- Verwijder de hydrogel uit de schedel met steriele wattenstaafjes en schoon met steriele PBS alvorens naar de microscoop.
- Plaats de houder in de microscoop podium, plaats de verwarming mat onder de muis, plaatst de rectale thermometer sonde en zet alles op zijn plaats op het podium met plakband.
- Plaats een kleine daling van de oogzalf op de ogen van de muis om te zorgen dat ze niet uitdrogen tijdens het onder narcose. OPMERKING: de muis mag niet onbeheerd worden achtergelaten op elk moment tijdens de beeldvormende proces terwijl onder narcose.
in vivo beeldvorming: Hoge-resolutie Stacks en Time-lapse Acquisitie
- Focus op de schedel via het oog stukken.
- Vul de beeldvorming venster met gezuiverd, steriel water en met behulp van een water dompelen lens, zakken zodat deze tegen de waterdruppel.
- Concentreren op de bovenkant van de schedel de microscoop oculairs door externe lamp als lichtbron.
- Plaats het opnamegebied op de centrale hechtdraad en bewegen naar de achterkant van het hoofd naar de coronale hechtdraad als startpositie vinden.
- Stel de microscoop tot effectieve excitatie en detectie van de desbetreffende fluoroforen in de excitatie en emissie tafel mogelijk. OPMERKING: terwijl een Leica SP5 rechtop confocale met een galvanometer scan hoofd conventionele uitvoeren van de LAS-AF softwareplatform hier wordt gebruikt, kan de procedure eenvoudig worden overgenomen in andere microscoop / software platforms. De lens die hier gebruikt is de Leica HCX IRAPO L 25x B / 0.95 NA but equivalente lenzen van andere fabrikanten zijn beschikbaar met geschikte vergroting en hoge NA
- Plaats de software in een modus om zowel XY beelden en 3D Z-stack en stel afbeeldingssnelheid 400 Hz en resolutie vangen tot 512 x 512 pixels. OPMERKING: de setup en hardware hier resulteren in een gezichtsveld van 620 micrometer en dit kan op andere platformen.
- Stel de software, zodat meerdere kanalen / tracks kunnen worden vastgelegd, alsmede ervoor te zorgen dat de collectie is ingesteld op de instellingen tussen stapels indien mogelijk of tussen frames op zijn minst te veranderen. Opgezet 3 onafhankelijke opname-instellingen, het uitschakelen van de laser verlichting aan het einde van de overname van elke stapel. OPMERKING: drie kanalen nodig zal zijn voor deze procedure om overspraak te verminderen tussen de kanalen.
- Stel de instellingen in voor de eerste sequentiële scan voor de twee foton SHG bot-signaal (840 nm excitatie; 400-440 nm emissie); opent de sluiter voor de MP-laser en zorgen MP gain en offset zijn juist ingesteld, laservermogen is 12,5 - 25% en de laser wordt ingeschakeld. Selecteer een geschikte PMT als de enige detector en verander de kleur naar wit. Opmerking: NDD detectoren met geschikte filters worden gebruikt voor het bot detectie beschikbaarheid een helderder, dieper signaal bereiken.
- Herhaal channel setup-procedure gebruikt voor het GFP-kanaal voor een gecombineerde autofluorescentie (543 nm excitatie, 560 - 600 nm emissie) en DiD (633 nm excitatie; 650-720 nm emissie) onder het tweede instellingen te scannen, gebruik te maken van twee geschikte PMT's. Verander het kanaal kleur groen voor de autofluorescentie en rood voor de DiD. Let op: het gebruik van groen als de auto-fluorescentiekanaal vereenvoudigt detectie van DiD positieve cellen wanneer de twee kanalen worden overlay - autofluorescente cellen verschijnen als geel / oranje vanwege het feit dat in beide kanalen, terwijl DiD cellen verschijnen alleen als rood, omdat ze alleen in het verschijnen DiD kanaal. De auto-fluorescentiekanaalwordt alleen gebruikt voor deze vergelijking en wordt niet gebruikt in een uiteindelijk, maar als de gebruiker wenst, kan deze worden gewijzigd in een andere kleur voor tentoonstelling om verwarring met de GFP kanaal.
- Tot slot, het instellen van de derde en laatste scan voor GFP (488 nm excitatie; 500-530 nm emissie); zorg ervoor dat de sluiter open indien nodig en stel vervolgens het laservermogen van de 488 nm laser lijn tot ongeveer 15% of een passend niveau voor de laser wordt gebruikt, selecteert u het juiste PMT als enige werkzame detector en verander de pseudocolor naar groen.
- Activeer een 'Live' imaging-modus om een voorbeeld scan van het geselecteerde kanaal te beginnen en pas detector Gain en Offset voor een optimale belichting. Herhaal dit voor elke scan in de sequentiële venster.
- Sla de instellingen van deze multi-channel scans voor eenvoudig hergebruik. LET OP: dit kan de gebruiker de instellingen opnieuw te laden in de volgende sessies.
- Activeer multi-positie vast te leggen, aangeduid als 'markerennd zoeken 'in de aangetoonde software, en het coördineren van punten gereset.
- Scan de bot beeldvormende gebied, vanaf de kruising tussen de centrale en coronale hechtdraad, scan de diepte van beenmerg gebied met behulp van zowel autofluorescence (pseudo gekleurde groen) en DiD (pseudo-gekleurde rood) met een samengestelde oog. OPMERKING: autofluorescente cellen zal aanwezig zijn in beide kanalen en verschijnen oranje / geel in het samengestelde beeld terwijl DiD gelabelde cellen zal verschijnen als enige rood-cellen in de samengestelde afbeelding.
- Wanneer een cel wordt gedetecteerd, markeer dit als een nieuwe coördinaat positie (x, y en z) in de 'Mark en Find' functie door te klikken op het venster "Nieuwe Positie pictogram aan de linkerkant van de" Mark en zoeken " .
- Wanneer de huidige gezichtsveld is onderzocht, verplaats de fase van de afstand van een gezichtsveld zowel links / rechts / onder / boven. Herhaal dit proces voor elk gezichtsveld geleidelijk werken rond de hele beeldvorming raamoppervlak aan de linkerkant van the centrale hechtdraad, bewegen naar de neus van de muis. Zodra de centrale hechting bifurcatie in zicht, naar rechts van de hechtdraad en herhaal de procedure scannen links in de omgekeerde richting (dat wil zeggen, naar de coronale hechtdraad). Markeer de coördinaten van elke nieuwe cellen van belang het gebruik van de 'Mark en zoeken' tool.
- Zodra het scannen van de imaging-venster is voltooid, gebruikt u de 'Mark en zoeken' tool om herziening van de punten (selecteer het gewenste punt en elk punt beoordelen individueel). Stel de boven-en onderkant van een Z-stack rond elke cel voor elke positie, (veel software platforms kunt u onafhankelijke z-stacks te voeren voor elke positie, die vermindert het vastleggen van lege ruimte). Voor elk punt, zich richten op en neer en stel boven en onder Z-posities voor 3D z-stack vastleggen en actualiseren van de individuele punt in de 'Mark en zoeken'. Set Z-Stack interval naar 5 urn en een gemiddelde voor elke sequentiële scan kanaal naar een geschikte kwaliteit: Line or Frame gemiddelde. LET OP: Het verhogen van het aantal scans tot gemiddeld verhoogt de lengte van de acquisitie tijd.
- Verwerven van een hoge kwaliteit verwijzing stack voor elk punt van belang bij het starten van de gehele scan procedure (vaak aangeduid als 'Start' in plaats van "Capture"). OPMERKING: deze scan kan fungeren als referentie voor toekomstige high-speed imaging.
- Eenmaal klaar met de hoge kwaliteit scan, activeert een time-lapse-instelling voor het vastleggen.
- In de time-lapse-instellingen, stel het tijdsinterval tot 5 min en de totale looptijd tot de gewenste lengte (bijvoorbeeld, 5 uur). Deze instellingen op 'Toepassen' om de totale scan. OPMERKING: om deze scan tijd om een 5 minuten time lapse interval toe te verminderen, moet men naar het aantal scans gebruikt voor middeling te verminderen, beperken de resolutie tot 512 x 512 pixels, zet het scannen naar bidirectionele (met de vereiste fase correctie zowel scan richtingen af te stemmen), en / of het verhogen van de scansnelheid tot 600 Hz of meer (meer dan 600Hz zal veroorzaken zoomen van de beeldvorming gebied voor de bewezen software platform). Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl een sequentiële imaging werd gebruikt om een hoge beeldkwaliteit stapel aanvankelijk te verwerven, wordt gelijktijdige aankoop gebruikt om de snelheid te verhogen tijdens de time-lapse imaging - dit kan leiden tot een lichte overspraak tussen de kanalen die extra plaatsen belang op de eerste vangst van het nauwkeurig gescheiden referentie-stacks.
- Beginnen beeldvorming (zoals eerder door te klikken op de knop 'Start' in de aangetoonde software). OPMERKING: zorg ervoor dat het juiste niveau van anesthesie te handhaven door het toedienen van verdere, kleinere doses indien nodig, zorg dat u de muis niet aan een overdosis, regelmatig bijvullen van het water om de doelstelling te verzekeren niet uitdroogt en bewaken vitale functies en verwarming-pad temperatuur heel.
- Wanneer u klaar bent, til de lens uit de houder en verwijder de houder uit de microscoop podium, zodat de draden van de rectale sonde en heten mat niet beschadigd.
- Schroef het kopstuk van het podium houder en verwijder voorzichtig de muis. Ruiming van de muis met behulp van cervicale dislocatie en verwijder het metalen kop-stuk door snapping het uit de schedel. Gegevens op te slaan op uw harde schijf en over te dragen aan de server voor latere analyse. OPMERKING: Het kopstuk is ideaal gereinigd door dompelen in aceton voor een paar uur en uiteindelijk wrijven de resterende cement af.
Representative Results
De op maat gemaakte, hoge precisie muis houder inclusief een calvarium imaging venster laat langdurige beeldvorming van FACS gezuiverd, gelabeld HSPCs geïnjecteerd in dodelijk bestraalde ontvanger muizen (figuur 1A). Typisch, na injectie van tussen 15-20.000 gemerkte cellen, 8 tot 15 cellen wordt binnen het beenmerg opnamegebied van de schedel de volgende dag herkenbaar. Hier wordt getoond hoe enkele cel resolutie 3D stapels HSPC bevattende beenmerg gebieden van ongeveer 90 verwerven - 120 micrometer dik, (Figuur 1B), gevolgd door 4D time-lapse filmpjes van de HSPCs geïdentificeerd (figuur 1C en film).
Suboptimale resultaten worden verkregen indien het tandcement niet optimaal voorbereid, bijvoorbeeld het water kunnen lekken uit niet zijn afgesloten, en hoewel het kan worden bijgevuld uit de bovenkant van de houder, een periode van tijd waarin het objectief niet ondergedompeld in water leidt tot zwart f Rames. Sommige drift in de beelden onvermijdelijk gevolg van thermische uitzetting van de materialen van de muis houder, maar kan worden versterkt door suboptimale cement adhesie, waardoor geleidelijke loslating van de muis, en veranderingen van de ingestelde imaging, waardoor plotselinge sprongen van de focus tijdens de time-lapse imaging. Drift tijdens multi-point time-lapse imaging kan ook worden veroorzaakt door onnauwkeurigheden in de fase bewegingen bij het herzien van eerder afgebeeld posities. Drift en stotteren artefacten in time-lapse filmpjes kunnen worden gecorrigeerd door het gebruik van beeldregistratie algoritmen.
Tabel 1 excitatie en emissie-instellingen.
| Kleur Channel | Excitatie | Emissie |
| GFP | 13px; "> 488 nm500-530 nm | |
| Autofluorescence | 543 nm | 560-610 nm |
| DiD | 633 nm | 640-700 nm |
| SHG | 840 nm (MP) | 400-450 nm |
Figuur 1 In vivo beeldvorming van 4D HSPCs in muizen calvarium. (A) Schema van het experiment (B - C).. Voorbeelden van resultaten (B) 2D segmenten van een 3D-stapel (totale diepte is 114 urn), bevattende signaal van collageen bot (wit) leverde gemerkte cellen (rood) , autofluorescente cells (geel) en osteoblasten (groen). Schaal bars:. 100 micrometer (C) 2D plakjes van een 4D time-lapse filmpje toont een DiD gelabeld HSC (rood) migreren in de nabijheid van deze osteoblasten (groen). De stippellijn wijst de verplaatsing van de cel. Schaalbalken: 50 pm (B) en 100 urn (C). NB:. De film verkregen van de time-lapse acquisitie in (C) wordt weergegeven tijdens het video artikel Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Wat werd bereikt?
Het protocol maakt gebruik van time-lapse multidimensionale beeldvorming om de migratie van FACS gezuiverd, ex vivo gemerkte, HSPCs getransplanteerd in muizen calvarial beenmerg controleren. Identificatie van afzonderlijke getransplanteerde cellen is verworven en deze werden gevolgd gedurende langere tijd (uur) met hoge nauwkeurigheid. Ademhaling geïnduceerde beweging artefacten zijn geminimaliseerd en de cellen zijn herhaaldelijk reimaged over een langere tijd-cursus.
Wat zijn toekomstige ontwikkelingen?
Ontwikkeling van de techniek kan ontwikkelen tot herstel experimenten toe te staan voor de beeldvorming over meerdere dagen, in de loop van een week of meer en gebruik van gas anesthetica, zoals isofluraan te verkorten en vereenvoudigen het herstelproces voor de muis (Let op: recovery experimenten vereisen strikt steriele chirurgische omstandigheden en de administratie van de juiste pijnstillers). Develing van een grotere kleur-palet in vivo kleurstoffen alsmede efficiënte genetische kenmerken van hematopoietische cellen ook multi-labeling experimenten vergemakkelijken, meer inzicht in cel-cel interacties in het beenmerg en zorgen voor meer complexe experimenten in de toekomst. Daarnaast zal gelijktijdige vermelding van meerdere beenmerg structuren en stroma componenten een completer beeld van de gebeurtenissen die plaatsvinden in HSPC niches bieden. Stabiliteit van het beeld van de time-lapse filmpjes kan worden verbeterd preacquisition door het stabiliseren van de microscoop verder evenals het minimaliseren van de temperatuur gradiënten in het monster en postacquisition door beeldregistratie algoritmen.
Beperkingen:
De beschreven techniek presenteert een aantal beperkingen. Overleving van muizen na toediening van injecteerbare anesthetica is onvoorspelbaar en is zeer eenvoudig te bieden complicaties afhankelijk van de individuele respons op deverdoving. In het algemeen, hoe langer een opnamesessie, hoe moeilijker is voor de muis om te herstellen van anesthesie en het is daarom belangrijk om zorgvuldig te plannen als de muis in te vorderen, idealiter het beperken van de duur van de time-lapse imaging. Het gebruik van injecteerbare anesthetica beperkt de tijd die elke opnamesessie kan duren. Hoewel het mogelijk is om de anesthesie te verlengen door opnieuw toedienen van de dosering van verdoving moeilijk voert deze nauwkeurig en overdosering de muis is een van de belangrijkste oorzaken van voortijdige beëindiging van in vivo imaging. Gas anesthesie is minder giftig en zorgt voor een langere eerste opnamesessie echter snel herstel van de muis na> 2 uur lang de toediening van isofluraan is zelden succesvol. Een andere beperking van de techniek is de beperkte resolutie van de beelden die worden verkregen bij multi-point time-lapse imaging, vanwege de noodzaak om beelden snel verwerven. Dit, in combinatie met focale afwijking of veld springt (discboven ussed), kan het volgen van de cellen moeilijk te maken.
Vergelijking met alternatieve methoden:
HSPCs worden gewoonlijk gelabeld met de lipofiele kleurstof deed, maar DiR en Dil kleurstoffen gelijkwaardige alternatieven en andere mobiele kleurstoffen kunnen worden gebruikt zolang als voldoende helder, zoals beoordeeld in [16]. Alhoewel ex vivo labeling van cellen met WIST is aangetoond dat geen invloed op de werking op lange termijn van HSCs, heeft de beperking dat DiD (of andere chemische kleurstoffen) wordt verdund op celdeling. Aangezien HSCs prolifereren gedurende de eerste dagen na transplantatie, de signaal-ruis verhouding voor deze cellen snel verslechtert. Endogene labeling van cellen door middel van genetische manipulatie en expressie van fluorescerende eiwitten een levensvatbaar alternatief werkwijze, zolang de fluorescerende eiwitten tot expressie bij voldoende hoge niveaus detecteerbaar signaal via schedelbeen genereren. Er zijn een aantal alternatieve techniques beschikbaar voor beeldvorming van HSPCs voeren binnen het beenmerg ruimte, elk met hun eigen voordelen en beperkingen. Inbrengen van glasvezel-gebaseerde beeldapparatuur toegestaan voor beeldvorming van het beenmerg reconstitutie in lange beenderen [8], terwijl de confocale beeldvorming na chirurgische blootstelling van het scheenbeen en het dunner worden van het bot emaille met een chirurgische boor [12] geproduceerd gedetailleerde beelden van HSPCs woonachtig in de perifere gebieden van de lange beenderen. Deze methoden zijn echter veel invasief dan de hier beschreven en derhalve niet toe om beeldvorming sessies gericht op dezelfde beenmerg stippellijn in dezelfde muis herhalen. Bovendien is het mogelijk dat deze technieken kunnen hebben op de waargenomen gezien de onvermijdelijke reactie op grote schade in het omringende weefsel cellen. HSPCs zijn afgebeeld gedurende korte tijd door dekglaasjes geplaatst over uitgesneden, gebroken dijbeen [11], maar de gevolgen van dit ruwe preparaat van het weefsel op HSPCs niet clear en de techniek uniek gebruikt keer puntwaarnemingen verkrijgen. Vaste botten zijn verdeeld in seriële secties, gekleurd, en de verkregen beelden gereconstrueerd in een 3D-model, met een uitstekende 3D-resolutie, vooral als vasculaire afgietsels worden gebruikt [17], en Laser onlangs Scanning Cytometry (LASC) is gebruikt voor het verkrijgen van kwantitatieve maatregelen over HSPCs in situ, benadrukt door immuunkleuring [18], maar zijn niet in staat om enige tijd informatie over de cellen gedrag. De in deze nieuwe techniek beschreven technieken bieden een combinatie van goede resolutie in 3D voldoende spreiding in voor de controle cellen in 4D en ze zijn relatief niet-invasieve, biedt daarom een ideale benadering langdurige bewaking van HSPCs bereiken interactie met het beenmerg micro-omgeving.
Acknowledgments
Beeldvorming werd uitgevoerd op een rechtopstaande Leica SP5 confocale microscoop gelegen binnen de FILM faciliteit van het Imperial College in Londen, geleid door Dr Martin Spitaler uitgevoerd.
De monsterhouder en kopstuk werd gemaakt in samenwerking met de afdeling Chemische Technologie van het Imperial College in Londen, met advies van Samuel Jones en Dr Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz en CBS medewerkers aan het Imperial College waren instrumentaal voor hun hulp en advies op de muis en veeteelt. Mark Scott wordt gefinancierd door HFSP en FILM, Olufolake Akinduro door CRUK en Cristina Lo Celso door CRUK, KKLF, BBSRC en HFSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
References
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance. J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).
- Wang, L. D., Wagers, A. J. Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).
- Schofield, R. The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).
- Bischoff, R. Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers. Development. 109 (4), 943-952 (1990).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators. Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Lewandowski, D., et al. In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Xie, Y., et al. Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging. Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).
- Köhler, A., et al. Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones. Blood. 114 (2), 290-298 (2009).
- Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells. J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).
- Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow. Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso,, C, From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Ellis, S. L., et al. The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Nombela-Arrieta, C., et al. Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment. Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).
