Naturen av samspillet mellom blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) og beinmargs nisjer er dårlig forstått. Tilpassede hardware modifikasjoner og en multi-trinn oppkjøpet protokollen tillater bruk av to-foton og konfokalmikroskopi til bilde ex vivo merket HSPCs omplassert innen benmargs områder, sporing samhandling og bevegelse.
Gjennom en hårfin balanse mellom quiescence og spredning, selvfornyelse og produksjon av differensiert avkom, blodkreft stamceller (HSCs) opprettholde omsetningen til alle modne blodceller linjene. Samordningen av de komplekse signaler som fører til bestemte HSC skjebner er avhengig av samspillet mellom HSCs og intrikate mikromiljøet i benmargen, som fortsatt er dårlig forstått [1-2].
Vi beskriver hvordan ved å kombinere en nyutviklet prøveholder for stabil posisjonering dyr med flertrinns konfokal og to-foton in vivo bildeteknikker, er det mulig å oppnå høy oppløsning inneholdende 3D-stabler HSPCs og deres omkring nisjer og for å overvåke dem over tid gjennom multi-point time-lapse imaging. Høydefinisjons bilde kan oppdage ex vivo merket blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) bosatt i benmargen. Videre, multi-point time-lapse 3D avbildning, obtained med raskere anskaffelses innstillinger, gir nøyaktig informasjon om HSPC bevegelse og de gjensidige interaksjoner mellom HSPCs og Stroma celler.
Sporing av HSPCs i forhold til GFP osteoblastiske positive celler er vist som et eksempel på anvendelse av denne fremgangsmåte. Denne teknikken kan benyttes til å spore enhver hensiktsmessig merket hematopoietisk eller stromal celler av interesse innenfor musa calvarium benmargsrommet.
Til tross for stamcelle nisjer å ha blitt anerkjent i flere tiår tre og godt preget i mange vev som luktelappen, muskelfiber, hårsekken kul eller CNS subventricular sone 4-7, samspillet mellom blodkreft stamceller (HSCS) og mikromiljøet i benmargen ( BM) er fremdeles dårlig forstått på grunn av vanskeligheten med å direkte observere enkeltceller gjennom benet samt ekstremt flytende natur av selve vevet. Det har vist seg, gjennom en rekke funksjonelle studier basert på ablating eller overekspresjon av spesifikke gener i enten HSCs eller stromale celler i mikromiljøet i seg selv, som en intrikat nettverk av forskjellige celletyper og-regulerende signaler er ansvarlig for å regulere en delikat balanse mellom quiescence , spredning, utvidelse og differensiering av HSCs 1-2. Crosstalk mellom HSCs og sine nisjer kan forstås i dybden bare gjennom direkte observasjon. Dette er achievable takket være utviklingen av avanserte bildebehandlings protokoller, som kombinerer den tilgjengelige teknologien ikke bare i form av mikroskopi, men også av prøveholder løsninger og av anskaffelses programvare.
Enkelt celle oppløsning direkte avbildning av transplanterte blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) i BM rommet av muse calvaria bein viste at engrafting HSPCs lokalisere seg i nærheten av SDF-1 og VCAM-1-positive fartøy 8-9 og at mer umodne celler finnes innenfor 15 – 20 mikron fra GFP-positive osteoblastiske celler (Col2.3-GFP transgen muselinje, der osteoblastbegrenset kollagen 1α promoter driver GFP uttrykk) mens deres avkom er mer distal 10. Lignende observasjoner ble innhentet fra dissekert og brukket femur bein 11 og fra tynnet tibeal bein 12. Avbildning av calvarial benmarg fortsatt den minst invasiv tilnærming for å oppnå direkte visualisering av HSPCs innen thEIR innfødte mikromiljøet.
Med noen live prøven bildebehandling det er en iboende behov for å holde prøven så stille som mulig for å unngå unødvendige gjenstander på grunn av prøven bevegelse. Breathing forårsaker oscillasjon bevegelser av musen hodet, som må unngås når bildebehandling calvarial benmarg. Konvensjonelle stereotaktisk holdere, som brukes for eksempel for avbildning av hjernen og elektrofysiologi, er ikke egnet for calvarium bildebehandling fordi de hindrer frontpartiet bein. Start fra en mus holderen brukes for å minimalisere ubehag i løpet av levende bilde-og elektrofysiologiske studier 13, ble en 2-komponent holderen utviklet, med et lite stykke festet til hodet av musen for å skape en avbildning vindu som er koblet til et større arm sikrer stødig grep med en tung basisplate som sikrer godt inn i mikroskopet stadium. Sikring hodet stykke til skallen på musen tillater fri puste samtidig immobilisere hodet på plass og tilstrekkelig eliminere movements grunn puste. A 'lås-og nøkkel "mekanisme som forbinder hodestykket til holderlegemet gjør at størrelsen av vinduet å bli minimalisert, så vel som økt nøyaktighet i posisjoneringen, og derfor forenkle operasjonen, og tilpasning av bunnplaten inn i scenen gir mulighet for nøyaktig innretting på mikroskopet. For å nøyaktig overvåke bevegelige celler, ble en flerpunkts tidsforløp protokoll utformet til å tillate sporing av celler over tid med 5 minutters intervaller mellom tidspunktene. Her, gjorde merket HSCs som injiseres i col2.3GFP osteoblasitc reporter mus 10,14 og avbildes ca 20 timer senere. Musen holderen som ble utviklet, og de bildedannende innstillinger som er nødvendige for å utføre rask flerpunkts time-lapse avbildning av de samme områdene over en periode på flere timer, er beskrevet i detalj.
Hva ble oppnådd?
Protokollen bruker time-lapse multi-dimensjonal avbildning å overvåke migrasjon av FACS renset, ex vivo merket, transplanterte HSPCs i mus calvarial benmarg. Merking av enkelt transplanterte cellene er oppnådd, og disse har vært overvåket over lengre perioder (t) med høy nøyaktighet. Puste indusert bevegelse gjenstander har blitt minimert og celler har gjentatte ganger blitt reimaged over lengre tid-kurset.
Hva er fremtidige retninger?
Utviklingen av teknikken kunne utvikle seg mot gjenvinning av eksperimenter for å muliggjøre avbildning på flere dager, i løpet av en uke eller mer, og bruken av gassbedøvelsesmidler slik som isofluran å forkorte og forenkle gjenopprettingsprosess for musen (Merk: recovery eksperimenter krever strengt sterile kirurgi forhold og forvaltning av aktuelle analgetika). Development av en større fargepalett av in vivo fargestoffer samt effektive genetisk merking av blodkreft cellene vil også legge til rette for multi-merking eksperimenter, gi mer innsikt i celle-celle interaksjoner i benmargen og tillate mer kompliserte eksperimenter i fremtiden. I tillegg vil samtidig merking av flere benmargs strukturer og Stroma komponenter gi et mer fullstendig bilde av hendelsene som finner sted i HSPC nisjer. Bilde stabiliteten av time-lapse filmer kan forbedres ved å stabil preacquisition mikroskopet videre, så vel som å minimalisere temperaturgradienter i prøven og postacquisition ved hjelp av bilderegistrerings algoritmer.
Begrensninger:
Teknikken som beskrives viser noen begrensninger. Survival of mus etter administrasjon av injiserbare bedøvelse er uforutsigbar, og det er veldig enkelt å oppleve komplikasjoner avhengig av individuell respons påbedøvelse. Vanligvis, jo lenger en avbildning sesjon, er det vanskeligere for musen å gjenopprette fra anestesi og det er derfor viktig å planlegge nøye om musen vil bli realisert, ideelt å begrense varigheten av tid forfalle imaging. Bruken av injiserbare anestetika begrenser brukstiden for hver avbildningssesjon kan vare. Mens det er mulig å forlenge anestesi ved readministering en mindre dose av bedøvelsesmiddel, er det vanskelig å utføre denne nøyaktig og dosering musen er en av de hyppigste årsaker til for tidlig avslutning av in vivo avbilding. Gass anestesi er mindre toksisk og gir en lengre innledende avbildningssesjon, men hurtig gjenvinning av musen etter> 2 timer lang behandling med isofluran er sjeldent vellykket. En annen begrensning av teknikken er det begrensede oppløsning av bildene som kan oppnås ved multi-point time-lapse avbildning, på grunn av nødvendigheten av å skaffe bilder hurtig. Dette, kombinert med fokus drift eller felt hopper (plateussed ovenfor), kan gjøre sporing av celler vanskelig.
Sammenligning med alternative metoder:
HSPCs er vanligvis merket med lipofile fargestoff gjorde, men Dir og Dii fargestoffer er likeverdige alternativer og andre cellefargestoffer kan brukes så lenge tilstrekkelig lys, som anmeldt i [16]. Selv om ex vivo merking av celler med gjorde har vist seg å ikke påvirke langtids funksjon av HSCs, har den begrensning at gjorde (eller andre kjemiske fargestoff) fortynnes ved celledeling. Siden HSCs sprer løpet av de første dager etter transplantasjon, forringes hurtig signal-til-støy-forholdet for disse cellene. Endogen merking av celler ved hjelp av genetisk manipulering og ekspresjon av fluorescerende proteiner er et levedyktig alternativ metode, så lenge som de fluorescerende proteiner er uttrykt ved tilstrekkelig høyt nivå til å generere signal påvises gjennom skallebenet. Det finnes en rekke alternative techniques tilgjengelig for å utføre avbildning av HSPCs i benmarg plass, hver med sine egne fordeler og begrensninger. Innsetting av fiberoptiske-baserte bildebehandlingsenheter tillatt for avbildning av benmarg tilberedning i lange bein [8], mens confocal bildebehandling etter kirurgisk eksponering av tibia og tynning av bein emalje med en kirurgisk drill [12] produsert detaljerte bilder av HSPCs bosatt i de perifere områdene av lange bein. Disse metodene er imidlertid langt mer omfattende enn det som er beskrevet her, og derfor ikke tillater å gjenta bilde sesjoner med fokus på samme benmargen område innenfor samme musen. Videre er det mulig at disse teknikkene kan påvirke cellene observert gitt den uunngåelige reaksjon omfattende skader i det omgivende vev. HSPCs har blitt avbildet i korte perioder gjennom dekkglass plassert over skåret, oppsprukne lårben [11], er ikke Clea men virkningen av dette tøffe utarbeidelse av vevet på HSPCsr og teknikk ble anvendt for å skaffe en unik enkelt tidspunktobservasjoner. Faste bein har vært delt inn i seriesnitt, farget, og de innhentede bildene bygd om til en 3D-modell, gir utmerket 3D oppløsning, spesielt når vaskulære kaster brukes [17], og nylig Laser Scanning cytometri (LaSC) har blitt brukt til å skaffe kvantitative måler ca HSPCs i situ, markert med farging [18], men er ikke i stand til å gi noen tidsmessig informasjon om celler atferd. Teknikkene som beskrives i denne nye teknikken gir en kombinasjon av god oppløsning i 3D, tilstrekkelig midlertidig prøvetaking for overvåking av celler i 4D og de er relativt ikke-invasiv, derfor tilbyr en ideell tilnærming for å oppnå langsiktig overvåking av HSPCs samspill med benmargen mikromiljøet.
The authors have nothing to disclose.
Imaging ble utført på en oppreist Leica SP5 konfokal mikroskop ligger innenfor FILM innretningen av Imperial College London, ledet av Dr. Martin Spitaler.
Den prøveholder og hovedstillingen ble gjort i samarbeid med Chemical Engineering avdeling Imperial College London, med råd fra Samuel Jones og Dr. Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz og CBS ansatte ved Imperial College var instrumental for deres hjelp og råd om mus driften. Mark Scott er finansiert av HFSP og film, Olufolake Akinduro av CRUK og Cristina Lo Celso av CRUK, KKLF, BBSRC og HFSP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |