La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.
Grâce à un équilibre délicat entre la quiescence et la prolifération, auto-renouvellement et de la production de la descendance différenciée, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de maintenir le chiffre d'affaires de toutes les lignées de cellules sanguines matures. La coordination des signaux complexes qui entraînent des destins HSC spécifiques repose sur l'interaction entre les CSH et le microenvironnement complexe de la moelle osseuse, qui est encore mal comprise [1-2].
Nous décrivons par la combinaison d'un porte-échantillon nouvellement mis au point pour le positionnement des animaux stable avec confocal à plusieurs étapes et à deux photons dans des techniques d'imagerie in vivo, il est possible d'obtenir des empilements de 3D à haute résolution contenant des HSPCs et leurs créneaux environnantes et de les suivre dans le temps par multi-point imagerie time-lapse. Imagerie haute définition permet la détection ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques marqués (HSPCs) résidant dans la moelle osseuse. En outre, plusieurs points time-lapse imagerie 3D, obtained avec les paramètres d'acquisition plus rapides, fournit des informations précises sur le mouvement CSPS et les interactions réciproques entre HSPCs et les cellules du stroma.
Suivi de HSPCs par rapport à la GFP de cellules ostéoblastiques positif est représenté comme un exemple d'application de cette méthode. Cette technique peut être utilisée pour suivre toute hématopoïétiques ou cellules stromales étiquetés de manière appropriée des intérêts dans l'espace de la moelle osseuse de la calotte crânienne de la souris.
Malgré niches de cellules souches ayant été reconnus depuis des décennies 3 et bien caractérisés dans de nombreux tissus tels que le bulbe olfactif, la fibre musculaire, follicule pileux renflement ou CNS zone sous-ventriculaire 4-7, les interactions entre les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et microenvironnement de la moelle osseuse ( BM) sont encore mal comprise en raison de la difficulté d'observer directement les cellules individuelles à travers l'os ainsi que la nature extrêmement fluide du tissu lui-même. Il a été démontré, à travers un certain nombre d'études fonctionnelles sur la base de l'ablation ou la surexpression de gènes spécifiques que ce soit dans les CSH ou les cellules stromales de la micro lui-même, un réseau complexe de différents types de cellules et des signaux de régulation est responsable de la régulation de l'équilibre délicat entre quiescence , la prolifération, l'expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques 1-2. La diaphonie entre les CSH et leurs niches peut être compris en profondeur que par l'observation directe. C'est achievable grâce à l'élaboration de protocoles d'imagerie de pointe, alliant la technologie disponible non seulement en termes de microscopie, mais aussi des solutions de support d'échantillons et de logiciel d'acquisition.
La résolution de la cellule à l'unité d'imagerie en temps réel des cellules transplantées souches hématopoïétiques et progénitrices (hspC) dans le compartiment BM des calvaria de souris os a montré que HSPCs de greffant localiser à proximité des vaisseaux SDF-1 et VCAM-1-positives 8-9 et que les cellules plus immatures se trouvent à l'intérieur de 15 – 20 microns à partir de cellules GFP-positives ostéoblastiques (lignée de souris transgénique Col2.3-GFP, dans laquelle le collagène 1α promoteur ostéoblastique restriction dirige l'expression de la GFP), tandis que leur progéniture sont plus distale 10. Des observations similaires ont été obtenus à partir d'os de fémur disséqués et fracturées 11 et à partir d'os tibeal amincies 12. Imagerie de la moelle osseuse crânienne reste l'approche la moins invasive pour obtenir une visualisation directe des HSPCs dans emicroenvironnement natif leu.
Avec toute l'imagerie de l'échantillon en direct il ya un besoin inhérent à maintenir l'échantillon aussi immobile que possible pour éviter les artefacts inutiles en raison de mouvement de l'échantillon. La respiration provoque des mouvements oscillatoires de la tête de la souris, qui doivent être évités lors de l'imagerie crânienne moelle osseuse. Titulaires stéréotaxiques classiques, utilisés par exemple pour l'imagerie cérébrale et l'électrophysiologie, ne sont pas adaptés pour l'imagerie de la calotte crânienne, car ils empêchent les os frontaux. À partir d'un support de la souris utilisé pour minimiser la détresse durant imagerie et d'électrophysiologie études vivantes 13, un support 2 de composant a été développé, avec un petit morceau fixé à la tête de la souris pour créer une fenêtre d'imagerie connecté à un grand bras assurant le maintien stable avec un plaque de base lourde qui assure fermement dans la platine du microscope. Sécurisation de la pièce sur le crâne de la souris de la tête permet une respiration libre tout en immobilisant la tête en place et éliminer de manière adéquate movements en raison de la respiration. A 'de verrouillage et de clé «mécanisme reliant la pièce de tête sur le corps de support permet à la taille de la fenêtre à être réduite au minimum ainsi que la plus grande précision de positionnement, ce qui simplifie donc l'intervention chirurgicale, et l'ajustement de la plaque de base dans l'étape permet un alignement précis sur le microscope. Pour suivre avec précision les cellules mobiles, un protocole laps de temps multi-point a été conçu pour permettre le suivi des cellules au fil du temps avec des intervalles de 5 min entre les points de temps. CSH ici, avez marqués sont injectés dans col2.3GFP osteoblasitc journaliste souris 10,14 et imagés environ 20 heures plus tard. Le titulaire de la souris qui a été conçu et les paramètres d'imagerie nécessaires à l'exécution rapide multi-point imagerie time-lapse de la même région sur une période de plusieurs heures sont décrites en détail.
Qu'est-ce qui a été accompli?
Le protocole utilise l'imagerie multidimensionnelle time-lapse de suivre la migration des FACS purifié, ex vivo étiquetés, HSPCs transplantées chez la souris crânienne moelle osseuse. Identification des cellules transplantées simples ont été réalisés et ceux-ci ont été suivis pendant des périodes prolongées (h) avec une grande précision. La respiration des artefacts de mouvement induits ont été minimisés et les cellules ont été reimaged plusieurs reprises sur une période prolongée plats.
Quelles sont les orientations futures?
Développement de la technique pourrait progresser vers des expériences de récupération pour permettre l'imagerie sur plusieurs jours, au cours d'une semaine ou plus et l'utilisation d'anesthésiques gazeux tels que l'isoflurane pour raccourcir et simplifier le processus de récupération de la souris (Remarque: des expériences de récupération doit impérativement conditions de chirurgie stériles et l'administration d'analgésiques approprié). Developpement d'une plus grande palette de couleurs de colorants in vivo ainsi que l'étiquetage génétique efficace des cellules hématopoïétiques facilitera également les expériences multi-étiquetage, permettront de mieux comprendre les interactions cellule-cellule au sein de la moelle osseuse et autoriser des expériences plus complexes à l'avenir. En outre, l'étiquetage simultanée de plusieurs structures de la moelle osseuse et les composants du stroma fournira un tableau plus complet des événements qui se déroulent dans des niches CSPS. la stabilité de l'image des films en accéléré pourrait être améliorée pré-acquisition en stabilisant le microscope autre ainsi que de minimiser les gradients de température dans l'échantillon et postacquisition en utilisant des algorithmes d'enregistrement de l'image.
Limitations:
La technique décrite présente certaines limitations. La survie des souris après l'administration d'anesthésiques injectables est imprévisible et il est très facile de complications de l'expérience en fonction de la réponse individuelle de l'anesthésique. Généralement, plus une session d'imagerie, le plus difficile est pour la souris pour récupérer de l'anesthésie et il est donc important de planifier soigneusement si la souris doit être récupéré, ce qui limite la durée idéale de la déchéance imagerie en temps. L'utilisation d'anesthésiques injectables limite la durée de chaque séance d'imagerie peut durer. Alors qu'il est possible de prolonger l'anesthésie par réadministrer une dose plus faible d'anesthésique, il est difficile effectuer cette précision et un surdosage de la souris est une des causes les plus fréquentes de la fin prématurée de l'imagerie in vivo. anesthésie au gaz est moins toxique et permet de plus d'une session de formation d'image initiale, mais une récupération rapide de la souris après> 2 heures de temps d'administration de l'isoflurane est rarement couronnées de succès. Une autre limitation de la technique est la résolution limitée des images qui peuvent être obtenus au cours de plusieurs points imagerie time-lapse, en raison de la nécessité d'acquérir rapidement des images. Ceci, couplé avec la dérive ou champ focal saute (disqueussed ci-dessus), peut faire le suivi des cellules difficile.
Comparaison avec d'autres méthodes:
HSPCs sont habituellement marqués avec le colorant lipophile DiD, mais DIR et DiI colorants sont des alternatives équivalentes et d'autres colorants cellulaires peuvent être utilisés aussi longtemps que suffisamment de lumière, tel que révisé en [16]. Même si avec DID a été démontré marquage ex vivo de cellules de ne pas affecter le fonctionnement à long terme de cellules souches hématopoïétiques, il a la limitation qui n'a (ou tout autre colorant chimique) est dilué sur la division cellulaire. Etant donné que les CSH se multiplient pendant les premiers jours suivant la transplantation, le rapport signal sur bruit de ces cellules se détériore rapidement. Marquage endogène de cellules au moyen d'une manipulation génétique et l'expression de protéines fluorescentes est une méthode alternative viable, tant que les protéines fluorescentes sont exprimés à des niveaux suffisamment élevés pour produire le signal détectable à travers l'os du crâne. Il existe un certain nombre d'alternatives techniques disponibles pour effectuer l'imagerie de HSPCs dans l'espace de la moelle osseuse, chacun avec leurs propres avantages et les limites. L'insertion de dispositifs d'imagerie à base de fibres optiques autorisé pour l'imagerie de la reconstitution de la moelle osseuse dans les os longs [8], tandis que l'imagerie confocale après une exposition chirurgicale du tibia et l'amincissement de l'émail de l'os avec un foret chirurgical [12] a produit des images détaillées de HSPCs demeurant à les zones périphériques des os longs. Cependant, ces méthodes sont beaucoup plus invasive que celle décrite ici et ne permettent donc pas de répéter les séances d'imagerie portant sur la même zone de la moelle osseuse dans la même souris. En outre, il est possible que ces techniques peuvent affecter les cellules observées donné la réponse inévitable à d'importants dégâts dans les tissus environnants. HSPCs ont été imagées pour de courtes périodes de temps par des lamelles placées sur excisées, fractures du fémur [11], mais l'impact de cette préparation dure du tissu sur HSPCs n'est pas CLEAr et de la technique a été utilisée uniquement pour obtenir simples observations ponctuelles de temps. Os fixes ont été coupés en sections de série, taché, et les images obtenues reconstruit dans un modèle 3D, offrant une excellente résolution en 3D, surtout quand moulages vasculaires sont utilisés [17], et plus récemment à balayage laser cytométrie (CTAS) a été utilisée pour obtenir quantitative mesures sur HSPCs in situ, mis en évidence par une coloration immunologique [18], mais sont incapables de fournir toute information temporelle sur le comportement des cellules. Les techniques décrites dans cette nouvelle technique fournissent une combinaison d'une bonne résolution en 3D, l'échantillonnage temporel suffisant pour le suivi des cellules en 4D et ils sont relativement non-invasive, par conséquent, offre une approche idéale pour réaliser un suivi à long terme de HSPCs interagir avec la moelle osseuse microenvironnement.
The authors have nothing to disclose.
L'imagerie a été effectuée sur un Leica SP5 microscope confocal verticale situé dans le centre de FILM de l'Imperial College de Londres, dirigé par le Dr Martin Spitaler.
Le porte-échantillon et le casque a été fait en collaboration avec le département de génie chimique de l'Imperial College de Londres, avec les conseils de Samuel Jones et le Dr Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz et personnel de la SCS à l'Imperial College ont contribué pour leur aide et des conseils sur l'élevage de la souris. Mark Scott est financé par le programme au et FILM, Olufolake Akinduro par CRUK et Cristina Lo Celso par CRUK, KKLF, BBSRC et PSFH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |