Summary
线虫已成为研究宿主-病原体相互作用的新遗传模型。在这里，我们描述了一个协议，感染C。线虫与鼠伤寒沙门氏菌加上双链RNA干扰干扰技术研究宿主基因在抵御沙门氏菌感染的作用。
Abstract
在过去的十年中，C.线虫已经成为一个无脊椎生物，研究宿主和病原体之间的相互作用，包括对革兰阴性菌鼠伤寒沙门氏菌的宿主防御。沙门氏菌建立持续性感染C.肠道线虫和结果在受感染动物的过早死亡。许多免疫机制C.已经确定对线虫对沙门氏菌感染捍卫。吞噬，进化上保守的溶酶体降解途径，已经示出，以限制沙门氏菌复制在C线虫和哺乳动物。这里，一个协议描述来感染C.线虫与鼠伤寒沙门氏菌 ，其中蠕虫暴露在沙门氏菌在有限的时间，类似沙门氏菌感染的人类。 沙门氏菌感染显著缩短C的寿命线虫</ em>的。使用必需的自噬基因BEC-1作为一个例子，我们结合这种感染的方法与C线虫 RNAi的喂养方法，并表明该协议可以用于检查C的功能线虫的宿主基因在抵御沙门氏菌感染。由于C。线虫全基因组的RNAi文库的情况下，该协议使得它可以全面筛查C。线虫基因，对沙门氏菌等肠道致病菌保护利用全基因组的RNAi文库。
Introduction
自由生活的土壤线虫是用于研究许多生物学问题的简单和基因听话的模式生物。C.线虫显性存在自我施肥雌雄同体。雄性自发地由X染色体的过程中配子1,2非分离产生。在丰富的食物，C的存在线虫通过四个幼虫到成虫不断发展。温度也影响C。线虫的发展;更快的发展在较高温度下观察。在实验室中，C.线虫是培养在20℃下在琼脂平板上的标准温度与晶种菌大肠杆菌 （菌株OP50）作为食物1,2。
在过去的十年中，C.线虫已经成为一个无脊椎生物，研究宿主-病原体相互作用3-5。在自然界中，C.线虫吃细菌的养分吨源1,2。它的正常细菌实验室食品，OP50，可以很容易地被其他病原体检查C之间的相互作用线虫和任何选定的病原体。在这些条件下，肠道是感染的主要部位。事实上，广泛的细菌病原体已经显示出致死性感染C.线虫 3-5。
对革兰阴性菌沙门氏菌是一种胃肠道病原体引起人类食源性疾病的全球6,7。C.线虫是一种很好的模式主机沙门氏菌为这种细菌复制和呈现持续肠道感染8-10。C。线虫已经被用于识别新的和先前已知的沙门氏菌毒力因子11。有趣的是，C。线虫的免疫系统成功地限制了沙门氏菌复制。据此前报道，Inhib所自噬基因银行足球比赛呈现在C增加沙门氏菌复制线虫 ，导致受感染蠕虫10的过早死亡。巨自噬（本文中被称为自噬）是一个涉及亚细胞膜的重排螯合细胞质和细胞器运送到溶酶体降解12动态过程。自噬作用已有报道，以限制沙门氏菌复制在C线虫和哺乳动物10,13。
该三线虫基因组测序的第一个多细胞真核生物的基因组;它是响应于RNAi的治疗14-16。此外，RNA干扰可以被有效地通过使蠕虫摄取含有靶基因，被称为RNA干扰喂食16,17的双链RNA的细菌给药。已经生成的全基因组RNAi筛选16,18全基因组RNAi的喂养库。在本文中， 沙门氏菌感染亲母育酚结合的RNAi喂养，让测试C。感兴趣的线虫基因的防止沙门氏菌感染的能力。
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Protocol
1，XLD（木糖赖氨酸去氧胆酸盐）琼脂平板
XLD琼脂是沙门氏菌，这似乎是在XLD琼脂平板上菌落黑色选择性生长培养基。然而，如果有污染的担忧，一个普通的LB板可以被取代。
- 称取5毫升去离子水5.5克XLD琼脂和重悬。
- 调匀，直到所有的琼脂是湿的。添加95毫升去离子水，直到所有肿块消失，介质完全悬浮。
- 熬中期至完全溶解（不要高压灭菌）。
- 冷却介质在室温至50℃。
- 倒25毫升琼脂中的每个95×15毫米（直径×高度）板（用封口膜密封板可以储存在4℃可保存1个月）。
2，线虫生长培养基（NGM）的RNAi喂养板
C.编制线虫 NGM板先前已描述19，这里的过程简要描述以添加抗生素氨苄青霉素和RNAi的化学诱导物异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）到NGM媒体，使RNAi的馈送板。
- 将3克氯化钠和2.5克细菌蛋白胨于1升去离子水。
- 添加17克细菌用琼脂到媒体。
- 高压灭菌的培养基45分钟，并在水浴中冷却介质到50°C。
- 添加下列溶液：1毫升胆固醇（5毫克/毫升的95％乙醇），将1ml的1M的CaCl 2，加入1ml 1M的MgSO 4干燥，和25ml的1M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）。拌匀。
- 加入1 ml 1M的IPTG和500μl的氨苄青霉素（100 mg / ml的无菌水）。
- 摇匀瓶内的溶液倒入60×15毫米（直径×高度）培养皿用吸管援助和25ml血清移液管下面的无菌程序。用12ml琼脂填满每块板。板可被储存在4℃下长达1个月。
必需的自噬基因BEC-1作为一个例子，研究宿主基因在抵御沙门氏菌感染的功能。实验步骤示于图1和表1。协议制备的RNAi治疗的动物进行感染如下，括号中给出各实验步骤的日子。
- 接种BEC-1 RNAi的喂养和放置-80℃冷冻的细菌片状变成补充100毫克/毫升氨苄青霉素（ 第1天 ）2毫升LB培养基介质控制空载体L4440的RNAi喂养细菌。在整个实验过程中重复此步骤，每周一次有新鲜的RNAi细菌。保存文化在4℃的冰箱时，不使用。
- 种子上的RNAi板百毫升过夜RNAi的细菌培养。准备三BEC-1 RNA干扰和三个控制空v埃克特的RNAi板。培养板在37℃培养过夜（ 第2天 ）。
- 从37℃培养箱中取出的RNAi板，让他们冷却至室温，在板凳上。拿起吃得饱L4野生型N2雌雄同体和他们转移到BEC-1 RNA干扰和控制空载体的RNAi板。将每盘三虫，一式三份板。在同一天，如在步骤3.2（3日 ）中所述制备的RNAi板。
- 孵育的RNAi板的蠕虫在20℃培养箱中培养36〜40小时，传输蠕虫在步骤3.3准备新鲜相应的RNAi板。蠕虫被转移后，将培养板在20℃培养箱中培养64小时（4天 ）。
4，准备为沙门氏菌感染
- 连胜沙门氏菌 -80℃冷冻股票于1 XLD琼脂平板上孵育板在37℃过夜（5天
- 选择一个良好的孤立的黑色沙门氏菌的殖民地，振荡培养过夜（ 第6天 ），其接种于2毫升LB培养基，于37℃。
- 种子80毫升沙门氏菌 1 C.过夜培养线虫 60×15毫米（直径x高度）NGM琼脂平板上并在总准备6片。培养板在室温下搅拌6小时。细菌培养应该干的，并形成对板（7天 ）草坪。
5，传染的RNAi治疗的蠕虫沙门氏菌
- 转让BEC-1的RNAi治疗和控制空载体的RNAi治疗L4 N2雌雄同体（设立在步骤3中的蠕虫后代） 沙门氏菌板。将每板40蠕虫的3片为每个组。孵育虫板在20℃下48小时（7天 ）。
- 准备一组新鲜的RNAi板如步骤3.1和3.2（7天及说明
- 48小时后感染，转移沙门氏菌感染蠕虫在步骤5.2准备相应的RNAi板和孵化在20℃（9日 ）。
6，存活分析
- 每日分数蠕虫的生存，并在产蛋时间蠕虫转移到新鲜对应RNAi板。准备一套新的RNAi板之前，每个蠕虫传输如步骤3.1和3.2中所述。触摸蠕虫身体（头部，中部和尾部）轻轻地用一个终端扁平铂丝。蠕虫的得分为死了，如果该蠕虫体内也没有动静观察。
- 分数蠕虫每日或隔日的生存，并每周两次传送蠕虫新鲜对应RNAi板后，蠕虫停止产卵。
- 毕竟虫死，汇集来自一式三份板作为一个数据集的生存数据。每组输入的生存数据到相应的统计软件，如格拉夫派得PRISM生成生存曲线，并进行Kaplan-Meier生存分析。整个实验被重复至少一次，以确认结论。
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Representative Results
在20°C时，野生型N2蠕虫的寿命中位数为17天（ 图2A和表2）。 沙门氏菌感染显著降低N2蠕虫的寿命中位数天至10.5天（P = 0.0002，log-rank检验）（ 图2A ）。
如果C。线虫基因在抵御沙门氏菌感染中起重要作用，据预测，其抑制将传授易患沙门氏菌感染。事实上，相对于沙门氏菌感染控制的RNAi治疗N2动物的沙门氏菌感染BEC-1 RNA干扰治疗的N2蠕虫的寿命中位数为10.5天减少至9天（P <0.0001，log-rank检验）（ 图图2B和表2）。最大寿命是由14天显着缩短（24天增至10天， 图2B和表2）。此外， 为C-1 RNA干扰对未感染沙门氏菌 （P = 0.2593，log-rank检验）（ 图2C和表2），N2蠕虫的寿命无明显影响，说明沙门氏菌感染，不BEC-1 RNA干扰治疗，降低沙门氏菌感染BEC-1的RNAi治疗蠕虫的寿命。此外，BEC-1是在C中必需基因线虫抵御沙门氏菌感染。
图1流程图的实验程序。
图2。抑制BEC-1基因的RNAi赋予SUSceptibility 沙门氏菌感染C。线虫 。用下面的2天接触到鼠伤寒沙门氏菌或致病性大肠杆菌在20℃要么控制空载体的RNAi或BEC-1基因的RNAi治疗的野生型N2动物交流）生存曲线，请点击这里查看更大的版本这个数字。
表1。 沙门氏菌感染协议的时间表。
表2的统计分析白灰图2中的数据。
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Discussion
线虫是一种简单的遗传模型有机体，吃细菌的营养源。因此，很容易与肠道病原体替代它的正常细菌的食物来调查C之间的相互作用线虫和所选择的病原体。在此协议被描述为沙门氏菌感染和C结合线虫喂食的RNAi治疗研究宿主基因在抵御沙门氏菌感染的作用。曾患协议公开C.线虫蠕虫致病菌他们的一生20时，包括沙门氏菌 。在本协议中， 沙门氏菌感染蠕虫在两天的时间。在此之后，蠕虫不再暴露于沙门氏菌 。这沙门氏菌感染显著降低C的寿命线虫野生型动物。因此， 沙门氏菌入侵里面复制的蠕虫，并杀死动物10 沙门氏菌模仿人类沙门氏菌感染，这将有助于揭示有用的信息，以了解沙门氏菌引起的感染人类食源性疾病的这短短的时期。此外，该协议结合沙门氏菌感染的RNAi的馈送处理，使得有可能以测试可能参与对沙门氏菌感染的宿主防御任何候选基因，尤其是当基因的突变体都无法使用。自噬基因BEC-1已知的能参与防御沙门氏菌感染是用来作为一个例子，在本研究中。BEC-1突变是致死的21，这样可以防止测试其在抵御沙门氏菌感染的成年人的作用。使用当前的协议，它表明，通过RNAi抑制BEC-1的产生易感性的沙门氏菌感染中C。线虫 。在本研究中，N2野生型蠕虫FED与L4440的细菌也有类似的寿命为动物OP50喂养。动物开始死亡约6天，最大寿命约为4周。感染沙门氏菌 N2蠕虫住上几天短。相比之下，感染沙门氏菌BEC-1 RNA干扰治疗的死虫对照动物相比，大约快了两倍，虽然开始日期动物在两组死了，是只有几天相隔（ 图2）。整个实验持续约1个月。
在这个协议中，需要的RNAi的喂养和沙门氏菌制备的协调，使得RNAi的治疗L4阶段雌雄同体受到沙门氏菌感染。在作者的实验室中使用的协议的典型时限表1所述。RNAi的喂养细菌准备每周和细菌培养储存在4℃时不使用。值得注意的是，在第7天，在感染开始60;小时后沙门氏菌过夜培养放在NGM板。在这6小时内，RNA干扰治疗L4 N2雌雄同体是从相应的BEC-1挑选和控制空载体的RNAi板。非感染蠕虫作为对照，以确定是否感染沙门氏菌感染缩短蠕虫的寿命，如果BEC-1的RNAi疗法对蠕虫的寿命没有任何影响。
目前，存活C的感染后线虫通常用于测量所述病原体的毒力3-5。然而，RNAi技术抑制某些C的线虫基因导致减少的寿命。因此，应解释数据时要小心。当这种情况发生，不同浓度的RNAi诱导剂，IPTG的条件，可以进行测试，以确定所希望的浓度只影响宿主对所述病原体的感染而对动物的寿命的影响。据此前报道<SUP>如图10所示，1 nM的IPTG浓度成功地用于研究自噬在C中IGF信号传导介导的病原体抗性中的作用线虫 。
鉴于C。线虫基因组已被测序和C。线虫的RNAi喂养库已经生成16,18，可以修改所描述的协议来执行的全基因组RNAi筛选鉴定参与抵御沙门氏菌感染所有的宿主基因。而是采用了中位存活测定沙门氏菌的毒性例如，最大生存被使用。此外，感染蠕虫病毒可以通过补充板与氟脱氧尿苷，DNA合成抑制剂进行消毒。因此，转让感染蠕虫是不必要的，只要食物供给，以防止蠕虫饥饿。这些改进将减少工作量用于高通量筛选极大。这种类型的大规模的研究可能sHED灯在了解沙门氏菌感染的人体反应在C尽可能多的生物途径线虫是进化上保守的人。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢博士戴安娜Baronas洛厄尔的手稿的批判性阅读。这项工作得到了科学种子格兰特的FAU查尔斯·E·施密特学院，并从埃利森医学基金会的老化奖学金KJ支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
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