Summary
Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.
Abstract
Interneuronas GABAérgicas inhibitorias juegan un papel central dentro de los circuitos neuronales del cerebro. Las interneuronas representan un pequeño subconjunto de la población neuronal (10-20%), pero muestran un alto nivel de heterogeneidad fisiológica, morfológica, y neuroquímicos, que refleja la diversidad de sus funciones. Por lo tanto, la investigación de las interneuronas ofrece importantes conocimientos sobre los principios de organización y funcionamiento de los circuitos neuronales. Esto, sin embargo, requiere un enfoque fisiológico y neuroanatómico integrado para la selección e identificación de tipos de interneuronas individuales. De células enteras de grabación de cortes de cerebro agudos de animales transgénicos, que expresan proteínas fluorescentes bajo los promotores de marcadores-interneuron específica de patch-clamp, proporciona un método eficiente para apuntar y caracterizar propiedades intrínsecas y sinápticas de tipos específicos interneuron electrofisiológicamente. Combinado con tinte de etiquetado intracelular, este enfoque se puede ampliar con mo post-hocanálisis rphological y inmunocitoquímica, que permite la identificación sistemática de las neuronas registradas. Estos métodos se pueden adaptar para adaptarse a una amplia gama de cuestiones científicas sobre las propiedades funcionales de los diversos tipos de neuronas corticales.
Introduction
Circuitos neuronales del hipocampo han sido durante mucho tiempo objeto de un intenso escrutinio, con respecto tanto a la anatomía y la fisiología, debido a su papel esencial en el aprendizaje y la memoria, así como la navegación espacial en los seres humanos y roedores. Igualmente, la organización laminar prominente, pero simple del hipocampo hace de esta región un tema favorito de estudios sobre las propiedades estructurales y funcionales de las redes corticales.
Circuitos del hipocampo se componen de células excitatorias principales (> 80%) y una más pequeña (10-20%), pero muy diversa cohorte de interneuronas inhibidoras 1-3. Las interneuronas liberan ácido γ-aminobutírico (GABA) desde sus terminales de los axones que actúa en ionotrópicos rápido receptores GABA A (GABA A Rs) y los receptores de GABAB metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estos mecanismos inhibitorios se equilibran de excitación y regulan la excitabilidad de las células principales, y por lo tanto laIR temporización y el patrón de descarga. Sin embargo, liberado de interneuronas GABA actúa no sólo en las células principales, sino también en los propios 5,6 interneuronas. Receptores pre y postsinápticos median la regulación por retroalimentación y las interacciones mutuas inhibitorias entre los diversos tipos de interneuronas. Estos mecanismos inhibitorios en las redes de interneuronas se cree que son fundamentales para la generación y conformación de los patrones de actividad de la población, en particular las oscilaciones a diferentes frecuencias 7.
Grabación de patch-clamp de célula entera es un método bien establecido para el examen de las propiedades intrínsecas y las interacciones sinápticas de las neuronas. Sin embargo, debido a la gran diversidad de tipos de interneuronas, la investigación de las interneuronas inhibidoras requiere la identificación rigurosa de las células grabadas. Como los tipos de interneuronas del hipocampo se caracterizan por rasgos distintivos morfológicos y la expresión de marcadores neuroquímicos, anatómica combinada y inmunocitoquímica eXAMEN puede proporcionar un medio para determinar la identidad precisa 6,8,9 interneuron.
En el presente trabajo se describe un enfoque experimental en el que su conjunto de células patch-clamp grabaciones de las neuronas individuales o pares sinápticamente acoplados se combinan con el etiquetado intracelular, seguido de post-hoc de análisis morfológico y inmunocitoquímica, lo que permite la caracterización de lenta GABA B receptor mediada efectos inhibitorios en interneuronas identificados. A modo de ejemplo, nos centramos en uno de los principales tipos de interneuronas, un subconjunto de las llamadas "células cesto" (BC), que inerva el soma y dendritas proximales de sus metas post-sinápticas y se caracteriza por un "Rematar rápida" (FS) descargar patrón, un axón cubriendo densamente la capa de cuerpo de la célula, y la expresión de la proteína parvalbúmina de unión a calcio (PV) 10,11. Estas interneuronas muestran grandes corrientes postsinápticas inhibitorias, así como pre prominentemodulación sináptica de su producción sináptica, en respuesta a la activación de GABA B R 12. La combinación de las técnicas descritas aquí se puede aplicar igualmente bien para investigar los mecanismos intrínsecos o sinápticas en una variedad de otros tipos de neuronas identificadas.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos los procedimientos y de los animales de mantenimiento se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la Ley Alemana de Bienestar Animal, el Consejo Europeo de la Directiva 86/609 / CEE relativa a la protección de los animales, y las directrices de las autoridades locales (Berlín, T-0215/11 )
1 Preparación de rebanadas de hipocampo aguda-
- Tome una rata transgénica (17 a 24 días de edad), que expresa la proteína Venus / YFP fluorescente bajo el promotor VGAT, que las etiquetas de la mayoría de las interneuronas inhibitorias corticales 13. Decapita a la rata. Rápidamente diseccionar el cerebro (<40 seg) en semicongelado, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) fluido a base de sacarosa artificial cefalorraquídeo (sacarosa-ACSF, Figura 1A).
- Evaluar el cerebro de rata diseccionado para la fluorescencia Venus / YFP con una lámpara de 505 nm y filtro de emisión de 515 LED, montado en un par de gafas.
- Retire la tercera frontal de la corteza y Cerebellum; a continuación, separar los hemisferios, todos con un bisturí. Retire la superficie dorsal de la corteza para proporcionar una superficie plana para pegar el cerebro hacia abajo, como se ha descrito previamente 14.
- Cortar rodajas transversales (300 m) de la formación del hipocampo en un vibratome, los hemisferios deben estar rodeados con semicongelado, carbogenated sacarosa-ACSF (Figura 1B) 14. Retire regiones adicionales de rostral corteza, mesencéfalo y el tronco cerebral. Transferir cada rebanada a una cámara de retención sumergida ACSF que contiene sacarosa, que se carbogenated y se calentó a 35 ° C.
- Deja las rebanadas de recuperar a 35 º C durante 30 minutos desde el momento de la última rebanada de entrar en la ACSF calentado. Haga esto con el fin de reactivar los procesos metabólicos y facilitar el resellado de los procesos neuronales cortadas. A continuación, traslado a la temperatura ambiente para el almacenamiento (Figura 1C).
2. Fabricación y Llenado de pipetas de registro
- Pupipetas de parche ll de capilares de vidrio, de modo que se consigue una resistencia de la pipeta de 2-4 mW cuando se llena con filtrado (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 micras) solución intracelular contenía 0,1% de biocitina (para el etiquetado intracelular). Mantenga la solución intracelular enfriado en hielo para evitar la degradación de sus componentes.
- Llenar pipetas de parche para la identificación de las corrientes postsinápticas con una solución que contiene un bajo Cl fisiológicamente relevante - concentración (E R (Cl) = -61 mV; véase la lista de solución).
- Para grabaciones pareadas para identificar las respuestas mediadas por el receptor presináptica, llenar pipetas de parche con solución intracelular con Ca 2 + de la capacidad tampón de baja para evitar la interferencia con la liberación del transmisor presinápticamente, así como 4 veces mayor concentración de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) para mejorar la relación señal-ruido de IPSCs observados 5 que permiten una evaluación precisa de resp farmacológicaonsiveness. Tenga en cuenta que el cambio de concentración de Cl - puede alterar la cinética de IPSC 15.
3. Whole Cell Patch-clamp grabación de FS-ins
- Carbogenate la ACSF y se alimentan a través del sistema de perfusión a la cámara de grabación, por medio de una bomba peristáltica (que también elimina ACSF de la cámara de registro a través de una línea de succión, la Figura 2A). Encienda todos los equipos de la configuración en la preparación para la grabación.
- Transferir una rebanada a la cámara de registro y mantenerlo en su lugar con un anillo de platino encadenan con fibras individuales de seda. Coloque la rebanada de modo que el estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente a través del campo de visión, permitiendo el acceso con 2 pipetas tanto a la str. radiatum y str. oriens simultáneamente (Figuras 2C y 4A).
- Coloque la cámara en la configuración e iniciar la perfusión de carbogenated y caliente (32-34 º C) Una grabaciónCSF a un caudal de 5-10 ml / min.
- Evaluar la calidad rebanada bajo la óptica DIC-IR a 40X aumento del objetivo, y visualizar con una cámara CCD se ve en una pantalla. Supongamos buena calidad rebanada si un gran número de células piramidales CA1, moderadamente contrastados redondos (CA1 PC) se puede ver en str. pyramidale a profundidades de 20-30 micras por debajo de una superficie lisa y ligeramente de cráteres (Figura 2C). Rebanadas de mala calidad contienen un gran número de muy contrastados, células reducidas o inflamadas, con una superficie de loncha desigual.
- Identificar FS putativos interneuronas bajo iluminación de epifluorescencia que las que expresan Venus / YFP (Figura 2B), con gran somata multipolar en o cerca de la str. pyramidale. Seleccione las celdas razonablemente profundo dentro de la rebanada (50-100 m, Figura 2C) con el fin de preservar mejor su integridad morfológica.
- Monte el electrodo de registro en el soporte de la pipeta en el cabezal de la platina; a continuación, la aplicaciónLY una presión positiva baja (20-30 mBar) a través de la línea de tubo. Bajar la pipeta a la superficie de la rodaja, ligeramente desplazada del centro de la neurona seleccionada.
- Obtener configuración de la grabación de células enteras como se describió previamente 14,16 y ver también las figuras 2D y 2E:
- Haz objetivo a una celda: Aumenta la presión a 70-80 mbar y bajar rápidamente la pipeta a través de la rebanada justo por encima del soma de la celda seleccionada (Figura 2D, arriba).
- Acércate a la célula: Pulse la pipeta contra la membrana de la célula para producir un "hoyuelo" en él (Figura 2D, arriba). Realice este paso con rapidez, a fin de evitar el etiquetado biocitina de las células vecinas.
- Crear un sello giga-ohm: Suelte la presión y al mismo tiempo aplicar un comando de 20 mV de tensión a la pipeta. Un sello de giga-ohm (1-50 GΩ; Figura 2D, abajo y la figura 2E medio) typicaliado se desarrolla rápidamente. Una vez sellados, aplicar el potencial de membrana en reposo esperado (típicamente entre -70 y -60 mV) como un comando de voltaje.
- Romper a través del parche: Una vez sellada, rompa el parche de membrana con un breve pulso de presión negativa; consiguiendo de esta manera la configuración de célula completa (Figura 2E, parte inferior).
- Compensar la capacitancia de célula entera y resistencia en serie (R S). R s es normalmente 5-20 mW y estable durante un máximo de 120 min. Abandonar las células si el potencial de membrana (V M) en caso de ruptura a través de más despolarizado que -50 mV; R S es inicialmente mayor que 30 mW; o cambios R S por más de 20% en el transcurso de la grabación.
- Identificar FS-ins por su respuesta (en el modo de corriente-clamp) para una familia de hiper a despolarizante pulsos de corriente (-250 a 250 pA, Figura 2F, arriba). FS-ins relativamente han despolarizado V M (normalmente -50 to -60 mV), la membrana corta constante de tiempo (<20 ms) y responder a un 500 pA despolarizante de inyección de corriente con un tren de potenciales de acción (AP) a frecuencias> 100 Hz 11 (Figura 2F, parte inferior), que son notablemente diferentes a las de CA1 PC (Figura 2F, medio).
4. extracelular estimulación eléctrica para evocar respuestas mediadas por R GABA B
- Para observar las respuestas evocadas sinápticamente, colocar un electrodo de estimulación extracelular (un parche pipeta llena de NaCl 2 M; Resistencia: 0,1-0,3 mW) en el corte en la frontera de str. radiatum y str. -lacunosum moleculare. Coloque el electrodo de 200-300 micras lateral a la soma para prevenir la estimulación eléctrica directa de la célula y minimizar los artefactos de estimulación (figura 3A).
- Una vez que el electrodo de estimulación se coloca, obtener la grabación de células enteras dela célula y elegido evaluar el fenotipo fisiológico en modo de corriente-clamp como en la sección 3.9 (Figura 3B).
- Con la neurona registrada en de fijación de voltaje (V M -65 mV), entregar la estimulación eléctrica de los axones presinápticos a 50 V (~ 500 μA estímulo eficaz) cada 20 segundos, utilizando un aislado estimulador de voltaje constante. Utilice solo los estímulos (100 microsegundos de duración, la figura 3C, la parte superior) para observar GABA B R IPSCs mediadas, y intercalar con los trenes de múltiples estímulos (a 200 Hz) para producir una mayor liberación del transmisor.
- Bath aplica ionotrópicos antagonistas de los receptores de glutamato (AMPA del receptor: DNQX [10 M]; receptor NMDA: d-AP5 [50 M]) para revelar el aislado monosináptico IPSC (Figura 3C, media alta). Además de aislar el IPSC mediada R GABA B con la aplicación de un bloqueador de GABA A R (gabazine [10 M]; Figura 3C l medioower).
- Confirmar la resultante lenta corriente de salida (Figura 3C inferior, expandido) como se GABA B R-mediada por la posterior aplicación de CGP-55845 [5 M] (Figura 3C inferior, sustentada en gris)
5. Emparejados Grabaciones de sinápticamente acoplados FS-IN y CA1 PCs
- Evaluar el control presináptica mediada por R GABA B de la transmisión sináptica inhibitoria con grabaciones simultáneas, realizadas entre sinápticamente acoplados pares IN y PC como se describe a continuación.
- En primer lugar, establecer una grabación de células enteras de un interneuron presináptica (como en la sección 3) y confirmar el fenotipo FS (Figura 4A).
- Entonces parchear un CA1 PC vecino (20-100 micras distancia, la figura 4A) y aplicar breve supraumbral despolarizante pulsos de corriente (1 ms de duración, 1-5 nA amplitud) a la presináptica IN (celebrada en modo de corriente-clamp) para obtener puntos de acceso. Si un co sinápticaConexion está presente, los puntos de acceso en el resultado IN en IPSCs en el PC CA1, que se celebró en el voltaje-clamp (compensar R S hasta aproximadamente el 80%).
- Si es necesario, llene un nuevo electrodo de registro y grabar desde otros PCs CA1 hasta que se encuentre una conexión.
- Una vez que se establece una conexión, provocar pares de puntos de acceso en el presináptica FS-IN para evaluar tanto la respuesta sináptica unitaria y comportamiento dinámico. Utilice un típico protocolo de dos pulsos de 2 estímulos despolarizantes con un intervalo de 50 ms (Figura 4B).
- Recoge los rastros de control en las condiciones de base. A continuación, aplicar los GABA B baclofeno R agonista selectivo (10 m) para la perfusión ACSF, activando así Rs GABA B, seguido por el antagonista CGP-55845 (5 M), para bloquear totalmente los efectos mediados por el receptor. Recoger ~ 50 trazas durante el estado estacionario de cada condición de medicamento (Figura 4B y C).
- Una vez que la grabación haya terminado, sellar la membrana somática formando una outside-cabo parche: Lentamente retirar la pipeta desde el cuerpo celular en V-abrazadera y como los R S aumenta, reducir el V M a -40 mV. Haga esto para facilitar la formación del parche fuera de salida; a continuación, extraiga la pipeta de la bañera.
6. Análisis de las propiedades electrofisiológicas
- NOTA: Una multitud de diferentes paquetes de software están disponibles para la adquisición de datos electrofisiológicos. Aquí, WinWCP, se utiliza un programa de Windows en el paquete gratuito Strathclyde Electrofisiología Software, que permite la grabación de hasta 16 canales de entrada analógica y la salida de 10 señales digitales.
- Filtro de paso bajo de todos los datos a 5-10 kHz y muestra a 20 kHz.
- Analizar los datos fisiológicos con un análisis conjunto off-line.
NOTA: Stimfit, un paquete de software de fuente abierta, que incluye un terminal de Python, se utiliza en este caso; sin embargo otras alternativas pueden ser utilizadas fácilmente en su lugar.- Analizar membrana pasiva propiedades de neuronas registradas, adquiridas en la pinza de corriente, de potencial de reposo de la membrana.
- Medir la media potencial de reposo de membrana de la línea de base de las respuestas registradas desde el comienzo de la grabación.
- Calcular la resistencia de entrada, utilizando la ley de Ohm, de la respuesta de tensión a los impulsos de corriente hiperpolarizantes más pequeños (≤ -50 Pa). Para mejorar la relación señal a ruido, múltiples trazas promedio. Nota: los ejemplos son típicamente promedios de 10 a 50 barridos individuales.
- Estimar el tiempo de membrana constante aparente ajustando una curva monoexponencial a la decadencia de las respuestas a los más pequeños pulsos de corriente de hiperpolarización.
- Analizar potencial de acción de forma de onda para determinar el umbral, la amplitud (umbral a pico) y la duración (anchura medida a media altura) provocada por nivel de umbral de despolarización impulsos de corriente.
- Analizar GABA B R IPSCs mediados de grabaciones de fijación de voltaje. Filtro traza fuera de línea en500 Hz (filtro Gaussiano) y evaluar la amplitud de pico y la latencia de la respuesta mediada por GABA B R (en los promedios de al menos 10 restos).
- Detectar el efecto de GABA B Rs en la salida inhibitorio de SIN como un cambio en la amplitud de pico de las IPSCs mediadas-R GABA A medidos entre el pico y la línea de base anterior. Calcular la amplitud media de ≥50 trazas para el período de control y el estado de equilibrio de todas las épocas farmacológicos.
7. Visualización e inmunocitoquímica de FS-Ins
- A raíz de las grabaciones, fijar las rebanadas por inmersión en paraformaldehído al 4% con 0,1 M tampón fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C.
- Si rebanadas necesarias pueden ser transferidos a PB y almacenarse hasta ~ 1 semana antes de procesar.
- Lavar abundantemente en rodajas PB fresco y posteriormente en 0.025 M PB con 0,9% de NaCl (PBS, pH = 7,35).
- Para reducir anticuerpo unión no específica, bloquear las rodajas de FOr 1 hora a RT en una solución que contiene 10% de suero normal de cabra (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un detergente para permeabilizar membranas) y 0,05% NaN 3, hecha en PBS.
- Para etiquetar para la expresión PV, utilizar un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PV diluido en una solución que contiene 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, en PBS. Incubar anticuerpos primarios durante 2-3 días a 4 ° C 12. Enjuague rebanadas a fondo en PBS.
- Aplicar anti-ratón secundaria de anticuerpos fluorescentes (por ejemplo Alexafluor-546.) Junto con la estreptavidina-proteína de unión a biotina, conjugado con un fluorocromo (por ejemplo, Alexafluor-647); y se incuban en una solución que contiene 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluido en PBS e incubar O / N a 4 ° C.
- Liberalmente enjuague rebanadas 2-3x con PBS seguidos por 2-3 enjuagues en PB. Montar las rebanadas en el portaobjetos de vidrio. Use un 300 micras agar espaciador para evitar el corte de colapsar. Rebanadas cubres con un fluomedio de montaje ciento y el sello con el clavo-barniz.
8. Imaging y Reconstrucción de Visualized FS-Ins
- Visualice las rebanadas utilizando un microscopio confocal de barrido, con el reportero fluorochome emocionados con la línea de láser adecuado (diodo láser 635 nm para Alexafluor-647; Helio-Neón 543 nm para Alexafluor-546 etiquetado para PV y Argon 488 o 515 nm para Venus / YFP).
- Tomar imágenes a una resolución apropiada Z-(típicamente 0,5-1 micras pasos, usando un objetivo 20X) para producir una pila Z de toda la célula. Múltiples pilas normalmente se requiere que toda la imagen de la célula, que puede ser cosida digitalmente fuera de línea utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
- Reconstruir la celda de la pila de imágenes unidas utilizando un método de seguimiento semi-automático (simple plugin de Neurite Tracer en paquete de software FIJI / ImageJ 17, Figura C).
- Por último, evaluar la PV-inmunoreactividad de la interneuron con una lente de objetivo de alta apertura numérica (60X silicio-inmersión, NA = 1,3). Hacer imágenes del soma, dendritas proximales y axón proximal, o, alternativamente, de terminales de los axones si lavado somática de PV es demasiado fuerte. Las células se consideran inmunorreactivas para PV si inmuno-etiquetado se ve para alinearse con las estructuras Biocitina marcado (Figura 5B).
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Representative Results
A condición de que la calidad del corte es considerablemente buena, la grabación tanto de CA1 PC y FS-ins se puede conseguir con dificultad mínima. La línea de rata transgénica que expresa Venus / YFP bajo el promotor VGAT 13 no identifica inequívocamente FS-ins, o incluso chalecos. Sin embargo grabaciones del INS en los alrededores de str. pyramidale, donde la densidad de FS-ins es típicamente alta 1, da como resultado una alta probabilidad de seleccionar FS-ins (Figura 2B). FS-ins se pueden distinguir por sus propiedades fisiológicas características diferentes de las de los dos PCs CA1 y RS-ins. Tienen una membrana relativamente despolarizado potencial de reposo (-58,9 ± 1,5 mV, 15 celdas, frente a -62,6 ± 1,1 mV en CA1 PCs, 26 células), la baja resistencia de entrada (92 ± 12 vs 103 ± mW 14 mW en PCs) y rápido aparente constante de tiempo de membrana (15,4 ± 2,6 vs 22,0 ms ± 2,7 ms en PCs), resulTing en respuesta rápida voltaje a la hiperpolarización pulsos de corriente (Figura 2F). FS-ins descargada potenciales de acción muy breves (0,38 ± 0,01 ms) de amplitud relativamente baja (82,8 ± 1,0 mV) seguido muy prominente afterhyperpolarization rápido (media amplitud 22,6 ± 2,9 mV). En respuesta a pulsos de corriente grande de despolarización (250 Pa), FS-ins disparó a altas frecuencias (82 ± 10 Hz; rango: 34 a 128 Hz; Figura 2D, izquierda).
Para evaluar GABAB R mediada postsináptica corrientes en FS-ins, las respuestas sinápticas farmacológicamente aislados fueron provocados por la estimulación extracelular de fibras inhibitorias en el str. radiatum / lacunosum-moleculare frontera. Figura 3 muestra un ejemplo de un FS-IN, en la que el bloqueo secuencial de componentes de la respuesta sináptica aísla el compuesto monosináptico GABA B R-mediada lenta IPSC. Las respuestas sinápticas fueron elicitado por estímulos individuales o trenes de 3-5 estímulos (50 intensidad V, 0,1 ms de duración, entregado a 200 Hz) a la str. lacunosum-moleculare / frontera radiatum (Figura 3A). La respuesta inicial compuesto que incluye componentes tanto excitatorios e inhibitorios (Figura 3C, arriba) fue fuertemente reducida por aplicación del baño de los antagonistas de los receptores de AMPA y NMDA (DNQX, 10 M y AP-5, 50 M, respectivamente: Figura 3C, medio). El residual monosináptico IPSC comprendía una temprana rápida corriente de entrada (una hacia adentro Cl putativo - actual mediado en el potencial de mantenimiento -65 mV, con un potencial de inversión de aproximadamente -60 mV, en estos experimentos) y una lenta corriente hacia el exterior (mediada por una supuesta conductancia de K + con un potencial de inversión cerca de 100 mV). Aplicación del selectivo GABA A R antagonista gabazine (SR-95531, 10 M) abolió el ayuno IPSC, dejando unaaislado la mediada R lenta GABA B IPSC (Figura 3C, abajo, vestigios negro); que se observó en respuesta a la estimulación única, pero más claramente en respuesta a los trenes de estímulos cortos. Esta respuesta se confirmó como una conductancia de K + activados por R GABA B, ya que fue bloqueada por el antagonista potente y selectivo CGP-55845 (CGP, 5 M, Figura 3C, parte inferior, de trazo gris). FS BC suelen mostrar grandes IPSCs R mediada por GABA amplitud B, como se muestra en nuestra reciente publicación 12.
Para evaluar la regulación presináptica de FS-EN salida inhibitorio GABA B Rs, grabaciones pareadas se realizaron desde sinápticamente acoplados PCs FS-IN y CA1. Conectividad sináptica entre FS chalecos y PCs CA1 es relativamente alta, como se muestra previamente 1,3. En estas grabaciones, como se indica anteriormente, la probabilidad de acoplamiento es más del 50% entre los pares de células estrechamente ubicados (≤50 m;
Una vez que una grabación se había completado, un parche el exterior hacia fuera formado con éxito, las rodajas se fijaron durante la noche y posteriormente se procesan para visualizar y analizar la morfología de las células registradas y determinar su contenido de marcador neuroquímico. Figura 5A ilustra la morfología de un representante FS BC en una proyección de pilas de imágenes combinadas obtenidas en un microscopio confocal. La expresión de la célula de PV se confirmó en el etiquetado inmunocitoquímica que dio un inmuno-señal clara sobre el cuerpo celular y dendritas proximales del grabado y de células biocitina marcado (Figura 5B). Reconstrucción tridimensional de la célula se realizó a partir de pilas de imágenes cosidas mediante el simple plugin de Neurite Tracer en software FIJI (Figura 5C) 17. El axón mostró una alta densidad de colaterales en y cerca del str. pyramidale con y# 8220; cestas "formadas alrededor de la somata de CA1 PC (Figura 5A), inserción, supuestamente la identificación de esta célula como un BC. Además, la localización de la soma cerca de STR. pyramidale y las dendritas radialmente orientados que abarcan todas las capas de la CA1 se corresponden bien a la característica morfológica típica de FS BC 10.
En resumen, en registros de células completas obtenidos a partir identificado PV + BC FS, hemos demostrado que estas células expresan grandes GABA amplitud B IPSCs lentos R mediada y su producción sináptica también es marcadamente inhibida por la activación de Rs GABAB presinápticos.
Figura 1 Preparación de cortes de hipocampo agudos. (A) Un cerebro de rata recién diseccionado. Tenga en cuenta el hielo que rodea el cerebro, manteniendola temperatura de todo el cerebro cerca de 0 ° C. (B) de corte de 300 micras rodajas de hipocampo en un vibratome Leica VT1200s. Los hemisferios están alineados de manera que la superficie cortical se corta primero. Tenga en cuenta la gran cantidad de hielo fangoso que rodea los hemisferios y el carbogenation constante de la ACSF helada (flecha). (C) Después de cortar las rodajas de cerebro se mueven a calentado sacarosa-ACSF. Las rodajas fueron entregados y recortadas para eliminar el prosencéfalo y el mesencéfalo, dejando sólo el hipocampo y la corteza suprayacente.
Figura 2.-células enteras de grabación de patch-clamp de interneuronas. (A) La configuración de grabación alrededor de la cámara. Tenga en cuenta la entrada y salida están en lados opuestos de la cámara para conseguir una cerca de flujo laminar. También son visibles los recording electrodos, montados en los Headstages, y los electrodos de tierra de los dos lados, así como el objetivo de imagen de epifluorescencia de baja potencia de la señal / YFP VGAT-Venus en (40X, de inmersión en agua) en el medio. (B) la CA1 del hipocampo en una rebanada. (C) de formación de imágenes IR-DIC de la misma zona. Las flechas en B y C indican una interneuron positivo Venus / YFP en la capa de células del cuerpo. (D) de alta potencia de las imágenes-IR DIC del soma de la neurona se indica en el panel B, con un parche pipeta acercarse formando el hoyuelo en la superficie (arriba) y, posteriormente, la celda en la configuración de célula completa (parte inferior). (E) Ilustración esquemática de las principales etapas de establecer un conjunto de células grabación de patch-clamp (lado izquierdo) con las respuestas de dibujos animados a un voltaje de prueba -Pulse el control de la resistencia en la punta de pipeta (lado derecho). Fila superior: la pipeta en el baño fuera de la celda; Media superior: formación Dimple, acompañado de unreducción en la amplitud de pulso, lo que indica un aumento moderado de la resistencia. Medio bajo: la formación del sello Giga-ohm. Tenga en cuenta que la amplitud del pulso de corriente se reduce dramáticamente. Sólo las corrientes capacitivas rápidos son visibles al principio y al final del pulso antes de que se compensa la capacitancia de la pipeta. En pocas palabras: la configuración de grabación Plenario de células se logra mediante la ruptura a través del parche de membrana bajo la punta de la pipeta. Tenga en cuenta que los grandes pero relativamente lentas corrientes capacitivas al principio y al final del pulso antes de la compensación de resistencia en serie se aplica. (F) trazas representante de un FS-IN (arriba) y CA1 PC (parte inferior), provocados por una familia de hiper - a pulsos de corriente de despolarización (protocolo se muestra más arriba). Tenga en cuenta la muy alta frecuencia de descarga de la FS-EN en comparación con el despido mucho más lento del PC CA1. Las inserciones de la derecha: La comparación de la forma de onda de AP desde el PC CA1 (arriba) y el FS-EN (abajo, en color gris, superpuesta a la AP PC en negro), lo que ilustra la diferenc en la forma de onda de la AP y el AHP.
Figura 3. disección farmacológica de la respuesta sináptica compuesto, aislando IPSCs R mediada por GABA B lentas en un FS-IN. (A) Imagen IR-DIC de la rebanada en la cámara de grabación, con el electrodo de registro (Patch) situado en el borde de la str. oriens (Ori.) y pyramidale (Pyr.) y el electrodo de simulación (Stim) en la frontera de la str. radiatum (. Rad) y lacunosum-moleculare (LM) (B) A la izquierda:. Ilustración esquemática de la configuración de la grabación. Derecha: Superpuesta respuestas de tensión en el FS-EN provocados por una familia de hiper a despolarizar inyecciones actuales (C) vestigios representativos grabados de la FS-EN en respuesta a la estimulación extracelular.. Arriba: El compuestorespuesta sináptica produce en ACSF normal, provocada por un único estímulo (intensidad de 50 V, 0,1 ms de duración). Medio superior: Aislado monosináptico IPSC después de la aplicación del baño de DNQX (10 M) y d-AP-5 (50 M). Media baja: Los IPSCs monosynaptic rápidas se bloquea después de la adición de gabazine (10 M) al baño. Abajo: Un tren de 5 estímulos (a 200 Hz) revela una GABAB lento R mediada IPSC (trazo negro), que está bloqueado por la posterior aplicación de CGP (5 M) al baño (trazo gris superpuesto).
Figura 4 Análisis de modulación presináptica de la transmisión sináptica inhibitoria en un emparejado grabación de un FS-IN y CA1 PC par acoplado. (A) Panel izquierdo: imagen IR-DIC de los dos pipetas de registro, el de la izquierda parcheado en el FS-EN en la frontera de la < em> str. oriens (Ori.) y pyramidale (Pyr.) y el derecho parcheado en un PC CA1 más cerca del str. radiatum (Rad.). Panel derecho:. Un esquema de la configuración de la grabación, con respuestas de tensión representativos de la FS-IN (izquierda) y CA1 PC (a la derecha) a una familia de pulsos de corriente (B) trazas representativas que muestran los puntos de acceso provocados en los presináptica FS-EN (arriba) y la corta latencia IPSC unitaria en el PC CA1 (abajo) en condiciones de control (trazas a la izquierda), después de la aplicación del baño de baclofeno (10 m, centro), y la posterior aplicación de los CGP (5 M, derecha) . Tenga en cuenta que el baclofeno reducen la amplitud IPSC por ~ 50%, mientras que CGP resultó en una recuperación casi completa de la amplitud de IPSC. Rastros de control se muestran subyacidas. (C) Tiempo de supuesto complot de la amplitud IPSC muestra el efecto del baclofeno y CGP. IPSCs se registraron a intervalos de 10 seg.
Figura 5. visualización, la reconstrucción y la identificación inmunocitoquímica de un FS-BC biocitina marcado grabado. (A) Una proyección de pilas de cosido de imágenes de un FS-EN fotografiado con un objetivo 20X en un microscopio confocal. El somata se encuentra en la frontera de la str. radiatum (Rad.) y pyramidale (Pyr.) de la zona CA1, las dendritas corren radialmente y se extienden a todas las capas, mientras que la mayoría de axón se encuentra en y alrededor de la capa de cuerpo celular; como típico para BCS. Barra de escala: 100 m. Inserción, arriba a la derecha: alta proyección de aumento de un 20 capas, mostrando cestas típicas de los axones que forman alrededor putativo somata PC CA1 (asteriscos naranjas). Barra de escala:. 10 m (B) El cuerpo biocitina lleno de células de la IN (pseudocolor blanco, panel inferior, flecha) muestra inmunorreactividad para PV (en el panel superior del verde). Escalabar:. 20 micras (C) Proyección de la reconstrucción en 3 dimensiones de la célula. El soma y dendritas están en negro y el axón de color rojo. Capas de CA1 son delineados en azul. Abreviaturas: Ori, str. oriens; LM, str. -lacunosum moleculare. Barra de escala: 100 m.
| Nombre | Composición (mM) | Uso | Notas |
| Sacarosa-ACSF | 87 NaCl, 2,5 KCl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucosa, sacarosa 75, 7 MgCl2, 0,5 CaCl 2, 1 Na-piruvato, 1 Na-ascorbato | Preparación y almacenamiento de rodajas de cerebro | pH = 7,4; osmolaridad = ~ 350 mOsm |
| ACSF Grabación | 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucosa, 1 de MgCl | Grabación de cortes de cerebro | pH = 7,4; osmolaridad = 310-315 mOsm |
| Solución intracelular (1) | 125 K-gluconato, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfocreatina y 0,1% biocitina | Llenado electrodos de grabaciones GABAB IPSC | pH = 7,4; osmolaridad = 295-305 mOsm |
| Solución intracelular (2) | 105 K-gluconato, 40 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfocreatina y 0,1% biocitina | Llenado de electrodos para las grabaciones pareadas | pH = 7,4; osmolaridad = 295-305 mOsm |
| Tampón fosfato (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Enjuague rodajas fijas | pH = 7,4 |
| Salina tamponada con fosfato (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, NaCl 154 mM (0,9% w / v) | Enjuague rodajas fijas y de anticuerpos de incubación | pH = 7,4 |
| Fijador Paraformaldehído | 4% w / v paraformaldehído, 0,1 mM PB | La fijación de rodajas de cerebro | pH = 7,4 |
Tabla lista 1. Soluciones.
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Discussion
Se describe un método que combina técnicas electrofisiológicas y neuroanatómicas para caracterizar funcionalmente neuronas morphologically- y neuroquímicamente identificados in vitro; en particular, los diversos tipos de INS inhibitorias corticales. Los aspectos clave del procedimiento son: (1) pre-selección de INS potenciales; (2) el registro intracelular y la visualización de las neuronas; y, finalmente, (3) el análisis morfológico y inmunocitoquímica de IEE registrados. Aunque este estudio se ha ocupado de PV-ins en particular, el protocolo descrito puede ser utilizado para grabaciones similares de cualquier interneuron u otros tipos neuronales, con la alteración mínima.
El número relativamente bajo de las interneuronas corticales en áreas hace que la selección aleatoria y la grabación de estas células altamente ineficientes. Localización divergente y rasgos morfológicos han permitido a los investigadores distinguir y registrar rutinariamente de algunos tipos de interneuronas. Sin embargo, en rodajas, la identificación de interneurons en y cerca de las capas de células del cuerpo sigue siendo difícil, como con FS-ins. El advenimiento de líneas de ratones transgénicos, que expresan las proteínas fluorescentes en las poblaciones de interneuronas específicos ofrece una solución elegante que hace pre-selección y grabación de estas neuronas mucho más eficientes 2. Ahora muchas líneas transgénicas, en su mayoría ratones, pero también cada vez más ratas 13 están disponibles, lo que facilita la investigación de las interneuronas. Al utilizar líneas transgénicas, sin embargo, es esencial para establecer el grado y la especificidad de la expresión del indicador.
Calidad de etiquetado y la morfología celular, así como el registro electrofisiológico, dependerá fundamentalmente de rebanadas de alta calidad, viables; para el que el cerebro necesita para ser diseccionado rápidamente (lo ideal es de 20-40 seg), manejado con mucho cuidado y continuamente refrigerada. Encontramos que el uso de sacarosa-ACSF, por lo que la concentración de sodio en general y por lo tanto la excitabilidad de las neuronas se reduce, dramaticamente mejora la calidad de la rebanadas y interneuron supervivencia 18. Sin embargo, cabe destacar que muchos investigadores han hecho uso de ACSF grabación estándar para la preparación rebanada, con gran efecto 10,11,15. Integridad morfológica depende en gran medida del ángulo en el que se cortan rebanadas de 13; que varía según la región y el tipo de células. Sin embargo, muchos interneuronas se pueden grabar de forma fiable a partir de cortes transversales, coronales o sagitales. Para minimizar aún más la ruptura de las dendritas y los axones, las células más profundas en el tejido deben ser dirigidos, aunque sacrificar la calidad y la fiabilidad de la formación del sello giga-ohm-IR DIC. Bajo estas circunstancias grabaciones de ambas células piramidales de CA1 y FS-ins se puede obtener de forma fiable.
Etiquetado y visualización de las neuronas se consigue siguiendo una sesión de grabación típica dura 30 minutos o más. Si grabaciones duran menos de 30 min, es necesario para permitir este tiempo antes de la fijación para permitir biocytin se difunda en dendrítica distal y los procesos axonales, lo que garantiza un llenado completo y la visualización de este modo post-hoc de las células.
En las grabaciones de células enteras, el mantenimiento de resistencias bajas y estables de la serie es imprescindible para la medición fisiológica precisa de las propiedades intrínsecas y sinápticas, así como el etiquetado exhaustivo de las neuronas. Sin embargo electrodos de baja resistencia permiten una rápida diálisis del citoplasma con la solución intracelular contenida dentro de la pipeta. Que complementa la solución intracelular con ATP, GTP y fosfocreatina duda ayuda a mantener los suministros de energía y calidad de la grabación. Sin embargo, la diálisis de neuroquímicos y proteínas puede conducir a la disminución de las respuestas, la reducción de la plasticidad y 19 también puede dificultar la identificación neuroquímico. Por ejemplo PV se lava constantemente fuera de las neuronas en el transcurso de los experimentos más largos. Por lo tanto, el examen de los procesos axonales distales dendríticas o puede ser obligado a dété rmine inmunorreactividad de la neurona registrada. En los casos en que tales diálisis es una preocupación, grabaciones utilizando la configuración de parche perforado-pueden ser utilizados para preservar el medio ambiente intracelular 20, sin embargo, el parche debe ser roto en el extremo de las grabaciones o la neurona posteriormente "repatched" en la configuración de célula completa para permitir el llenado biocitina.
Investigación farmacológica de neuronas registradas es un método útil para evaluar la importancia funcional de los mecanismos neuromoduladores divergentes en la configuración de la actividad intrínseca y sináptica del INS. En los métodos descritos anteriormente, el aislamiento farmacológico y grabaciones emparejados se utilizan para evaluar los efectos de correos y GABA B presináptica mediada R, respectivamente; sin embargo se puede modificar fácilmente la combinación de agonistas y antagonistas de receptores para evaluar el papel de familias de receptores alternativos, por ejemplo el sistema cannabinoide 21.
"> Histológico y el procesamiento inmunocitoquímica de células grabadas es altamente fiable, una vez que se establecen protocolos. Inmunocitoquímica El protocolo aquí descrito se ha ajustado con respecto a la combinación de anticuerpos utilizado, el espesor de la rebanada y el requisito de identificar el contenido neuroquímico. Utilizamos suero normal de cabra como todos los anticuerpos secundarios utilizados son criados en cabra. Como alternativas, también es posible utilizar albúmina de suero bovino (BSA) o leche en polvo como agentes de bloqueo. Cabe señalar que este protocolo utiliza tampón fosfato salino (PBS) para la incubación de anticuerpos, Sin embargo, alternativamente, se podría simplemente utilizar PB 0,1 M en lugar de PBS. Uso de una relativamente alta concentración de detergente (0,3% Triton X-100), no disminuye la antigenicidad aparente, al tiempo que permite la penetración de los anticuerpos en la primera capa de superficie de 100 m de la rodaja , donde se registran las neuronas rutinariamente. Si se registran células más profundas, o las rodajas son más gruesas, es aconsejable resectisobre las rebanadas, usando un criostato o una vibratome, y realizar la inmunomarcación en los (40-70 micras) secciones delgadas. Para 300 m rodajas, una larga incubación de los anticuerpos (a 4 ° C para preservar la integridad estructural de las rodajas) produce resultados inmunocitoquímicos altamente fiables.Identificación de las neuronas se basa en la información combinada obtenida en la grabación, el post-hoc morfológica y el análisis inmunocitoquímico. En el hipocampo, debido a la organización laminar estricta, distribución axonal es un buen indicador de los objetivos postsinápticos de interneuronas. Axón o dendritas Severed, sin embargo, puede hacer que la identificación difícil o imposible. Además, sigue siendo cierta ambigüedad, por ejemplo en la diferenciación de PV + BCS y interneuronas axo-axónico, debido a la similitud en la localización axonal en general. Una identificación definitiva definitiva requeriría análisis con microscopio electrónico de objetivos postsinápticos 1,3 or más disección inmuno 22.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Ina Wolter por su excelente asistencia técnica. VGAT-Venus ratas transgénicas fueron generadas por los Dres. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi y Y. Kawaguchi en el Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, Okazaki, Japón, usando pCS2-Venus proporcionada por el Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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