Summary
Kortikala nätverk styrs av en liten, men mångfald av hämmande intern. Funktionell undersökning av intern kräver därför riktade inspelning och rigorös identifiering. Beskrivs här är en kombinerad strategi som omfattar hela-cell inspelningar från enkla eller synaptically kopplade par av nervceller med intracellulär märkning, post-hoc morfologisk och immunocytokemisk analys.
Abstract
GABAergic hämmande intern spelar en central roll inom neuronala kretsar i hjärnan. Intern utgör en liten delmängd av det neuronala befolkningen (10-20%), men visar en hög grad av fysiologiska, morfologiska och neurokemiska heterogenitet, vilket återspeglar deras olika funktioner. Därför undersökning av intern ger viktiga insikter i organisationsprinciper och funktion av neuronala kretsar. Detta kräver dock en integrerad fysiologiska och neuroanatomiska strategi för urval och identifiering av enskilda Interntyper. Hel-cell patch-clamp inspelning från akut hjärnan skivor av transgena djur, som uttrycker fluorescerande proteiner enligt initiativtagarna till Internspecifika markörer, ger en effektiv metod för att rikta och elektrofysiologiskt karakterisera inneboende och synaptiska egenskaper specifika Interntyper. I kombination med intracellulär färgämnes märkning, kan detta tillvägagångssätt utökas med post-hoc morphological och immunocytokemisk analys, som möjliggör systematisk identifiering av inspelade nervceller. Dessa metoder kan skräddarsys för att passa ett brett spektrum av vetenskapliga frågor rörande funktionella egenskaper hos olika typer av kortikala neuroner.
Introduction
Hippocampus neuronala kretsar har länge varit föremål för intensiv granskning, med avseende på både anatomi och fysiologi, på grund av deras viktiga roll i inlärning och minne samt spatial navigering i både människor och gnagare. Likaså den framstående, men enkel laminära organisation av hippocampus gör denna region en gynnad föremål för studier som behandlar strukturella och funktionella egenskaper hos kortikala nätverk.
Hippocampus kretsar består av excitatoriska huvudsakliga celler (> 80%) och en mindre (10-20%), men mycket skiftande kohort av hämmande intern 1-3. Interneuroner frigöra γ-aminosmörsyra (GABA) från sina axon-terminaler som fungerar vid snabb jonotropa GABA A-receptorer (GABA A Rs) och långsamma metabotropa GABA B-receptorer (GABAB skivor) 4. Dessa hämmande mekanismer motvikt excitation och reglera retbarhet av huvudceller, och således denir timing och mönster av ansvarsfrihet. Emellertid GABA frisätts från intemeuroner fungerar inte bara på huvud celler, utan också på de intemeuroner själva 5,6. Pre-och postsynaptiska receptorer förmedlar återkoppling reglering och hämmande ömsesidiga samspelet mellan de olika typerna av interneuronen. Dessa hämmande mekanismer Intern nätverk tros vara central för generering och formning av befolkningen aktivitetsmönster, särskilt svängningar vid olika frekvenser 7.
Hel-cell patch-clamp inspelning är en väletablerad metod för undersökning av inneboende egenskaper och synaptiska interaktioner av nervceller. Men på grund av den stora mångfalden av Interntyper, utredning av hämmande intern kräver rigorös identifiering av de registrerade cellerna. Som hippocampus Interntyper kännetecknas av distinkta morfologiska egenskaper och neurokemiska markör uttryck, kombinerat anatomiska och immunocytokemisk eENOMGÅNG kan vara ett sätt att avgöra exakt Internidentitets 6,8,9.
I föreliggande dokument beskriver vi en experimentell metod där hel-cell patch-clamp inspelningar från enskilda nervceller eller synaptically kopplade paren kombineras med intracellulära märkning, följt av post-hoc morfologiska och immuncytokemiska analyser, vilket möjliggör karakterisering av långsam GABA B receptormedierade hämmande effekter på enskilda intern. Som ett exempel, fokuserar vi på en viktig typ av Intern, en delmängd av de så kallade "korg celler" (BC), som innerverar de soma och proximala dendriter sina postsynaptiska mål och kännetecknas av ett "fast spetsning" (FS) ansvarsfrihet mönster, en axon tätt täcker cellkroppen lagret, och uttryck av kalciumbindande protein parvalbumin (PV) 10,11. Dessa intern visa stora postsynaptiska hämmande strömmar, samt framstående presynaptisk modulering av deras synaptiska utgång, som svar på GABA B R aktivering 12. Kombinationen av tekniker som beskrivs här kan användas lika bra för att undersöka inneboende eller synaptiska mekanismerna i en mängd andra identifierade neuron typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: Alla förfaranden och djur underhåll utfördes enligt institutionens riktlinjer, den tyska djurskyddslagen, Europeiska rådets direktiv 86/609 / EEG om skydd av djur och riktlinjer från lokala myndigheter (Berlin, T-0215/11 )
1 Beredning av akut-hippocampus Slices
- Ta en transgen råtta (17 till 24 dagar gamla), som uttrycker fluorescerande Venus / YFP protein under vGAT promotorn, vilka etiketter de flesta kortikala hämmande intern 13. Decapitate råtta. Snabbt dissekera hjärnan (<40 sek) i semifrozen, carbogenated (95% O2 / 5% CO2) sackaros-baserad artificiell cerebrospinalvätska (sackaros-ACSF, Figur 1A).
- Bedöm dissekerade råtthjärna för Venus / YFP fluorescens med en 505 nm LED-lampa och 515 emissionsfilter, monterat på ett par glasögon.
- Ta front tredjedel av hjärnbarken och CerebEllum; därefter separera halvkloten, alla med en skalpell. Avlägsna den dorsala ytan av cortex för att åstadkomma en plan yta för att limma ner hjärnan, såsom tidigare beskrivits 14.
- Skär tvärgående skivor (300 nm) i hippocampus formation på en vibratome bör halvkloten omges med semifrozen, carbogenated sackaros-ACSF (Figur 1B) 14. Ta bort ytterligare regioner i rostral cortex, mitthjärnan och hjärnstammen. Överför varje skiva till en nedsänkt anläggning kammare som innehåller sackaros-ACSF, som carbogenated och värms till 35 ° C.
- Låt skivorna för att återhämta sig vid 35 ° C i 30 minuter från det att den sista skiva som kommer in i uppvärmda ACSF. Gör detta för att återaktivera metaboliska processer och underlätta återförslutning av skurna neuronala processerna. Sedan överföra till rumstemperatur för lagring (Figur 1C).
2 Tillverkning och Påfyllning av Recording Pipettes
- Pull patch pipetter från glaskapillärer, så att en pipett resistans av 2-4 Mohm uppnås när den är fylld med filtrerat (sprutfilter, porstorlek: 0,2 | im) intracellulär lösning, som innehöll 0,1% biocytin (för intracellulär märkning). Håll den intracellulära lösningen kyldes på is för att förhindra nedbrytning av dess beståndsdelar.
- Fyll patch pipetter för identifiering av postsynaptiska strömmar med en lösning innehållande en fysiologiskt relevant låg Cl - koncentration (E R (Cl) = -61 mV; se lösning lista).
- För parade inspelningar att identifiera de presynaptiska receptormedierade svar, fyll patch pipetter med intracellulära lösning med låg Ca 2 + buffertkapacitet för att förhindra störningar med släpp sändare presynaptiskt, samt 4 gånger högre Cl - koncentration (E R (Cl) = -20 mV) för att förbättra signal-brus observerade iPSCs 5 möjliggör noggrann utvärdering av farmakologisk responsiveness. Observera att om du ändrar Cl - koncentrationen kan förändra IPSC kinetik 15.
3 Whole Cell Patch-clamp Inspelning från FS-Ins
- Carbogenate ACSF och foder genom perfusionssystemet till inspelningen kammaren, med hjälp av en peristaltisk pump (som också tar bort ACSF från registreringskammaren genom en sugledning, Figur 2A). Slå på all utrustning på setup i förberedelserna för inspelning.
- Överför en skiva till inspelningen kammaren och håll på plats med en platinaring uppträdda med enstaka fibrer av silke. Placera slice så att stratum (str.) Pyramidale av CA1 rinner vertikalt genom synfältet, ger tillgång med 2 pipetter till både str. radiatum och str. oriens samtidigt (figur 2C och 4A).
- Placera kammaren in i installationen och starta perfusion av carbogenated och värmde (32-34 ° C) inspelnings ACSF vid en flödeshastighet av 5-10 ml / min.
- Bedöm skiva kvalitet under IR-DIC optik vid 40X objektiv förstoring, och visualisera med en CCD-kamera visas på en display. Antag god slice kvalitet om ett stort antal runda, måttligt kontraste CA1 pyramidala celler (CA1 PC) kan ses i str. pyramidale på djup 20-30 um under ett smidigt och lätt cratered yta (figur 2C). Dålig kvalitet skivor innehålla ett stort antal starkt kontraste, krympta eller svullna celler, med en ojämn skiva yta.
- Identifiera förmodade FS intern i epifluorescence belysning som de uttrycker Venus / YFP (figur 2B), med stora multipolär somata i eller nära str. pyramidale. Markera cellerna någorlunda djupt inom segmentet (50-100 um, figur 2C) för att bättre bevara sin morfologiska integriteten.
- Montera inspelningen elektroden i pipetten hållaren på huvudsteg; därefter apply lågt, positivt tryck (20-30 mbar) genom röret linjen. Sänk pipett till ytan av den skiva, något förskjutna till centrum av den valda neuron.
- Skaffa hel-cell inspelning konfiguration som beskrivits tidigare 14,16 och se även figurerna 2D och 2E:
- Rikta en cell: Öka trycket till 70-80 mbar och snabbt sänka pipetten genom slice till strax ovanför soma om den markerade cellen (Figur 2D, överst).
- Närma cellen: Tryck pipetten mot cellmembranet för att producera en "grop" på det (figur 2D, överst). Utför detta steg snabbt, för att förhindra biocytin märkning av angränsande celler.
- Skapa en giga-ohm tätning: Släpp trycket och samtidigt tillämpa en 20 mV spänningskommando till pipetten. En giga-ohm tätning (1-50 GΩ, figur 2D, botten och figur 2E mitten) typicallierad utvecklas snabbt. När förseglade, tillämpa den förväntade vilomembranpotentialen (vanligtvis mellan -70 och -60 mV) som en spänningskommando.
- Bryta igenom plåstret: När förseglade, spräcka membranet plåstret med en kort puls av undertryck; och därmed uppnå att hel-cellkonfiguration (figur 2E, botten).
- Kompensera helcell-kapacitans och motstånd serie (R S). R s är normalt 5-20 Mohm och stabil i upp till 120 minuter. Abandon celler om membranpotential (V M) på genombrott är depolariserade än -50 mV; RS är en början större än 30 Mohm; eller R S ändras med mer än 20% under loppet av inspelningen.
- Identifiera FS-ins från deras svar (i strömklämläge) till en familj av hyper- att depolariserande strömpulser (-250 till +250 pA, figur 2F, överst). FS-ins har relativt depolariseras V M (typiskt -50 to -60 mV), kort membrantidskonstanten (<20 ms) och svara på en 500 pA depolariserande ströminjektion med ett tåg av aktionspotentialer (APS) vid frekvenser> 100 Hz 11 (figur 2F, botten), vilka är markant skiljer sig från dem i CA1 datorer (Figur 2F, mitten).
4 Extracellulärt elektrisk stimulering att frammana GABA B R-medierade svar
- För att observera synaptically evoked potential, placera ett extracellulärt stimuleringselektrod (en patch pipett fylld med 2 M NaCl, Resistance: 0,1-0,3 Mohm) i segmentet vid gränsen till str. radiatum och str. lacunosum-moleculare. Placera elektroden 200-300 um lateralt till soma att förhindra direkt elektrisk stimulering av cellen och minimera stimuleringsartefakter (figur 3A).
- När stimuleringselektrod är placerad, erhålla helcells-inspelning avden valda cellen och bedöma den fysiologiska fenotyp i strömklämläge som i avsnitt 3.9 (figur 3B).
- Med neuron registreras i spänning-klämma (V M -65 mV), ger elektrisk stimulering av presynaptiska axoner vid 50 V (~ 500 iA effektiv stimulans) var 20 sekund, med hjälp av en isolerad konstantspännings stimulator. Använd enstaka stimuli (100 ^ sek varaktighet, figur 3C, överst) att observera GABA B R förmedlade iPSCs och omlott med tåg för flera stimuli (vid 200 Hz) för att producera större frisättning sändare.
- Badkar tillämpa jonotropa glutamatreceptorantagonister (AMPA receptor: DNQX [10 uM]; NMDA-receptorn: d-AP5 [50 fiM]) för att avslöja den isolerade monosynaptic IPSC (figur 3C, mellersta övre). Ytterligare isolera GABA B R-medierad IPSC med tillämpning av en GABA A R-blockerare (gabazine [10 ^ M]; figur 3C mitt lower).
- Bekräfta resulte långsamt utåt Ström (figur 3C lägre, expanderat) som att GABA B R-förmedlad av den senare tillämpningen av CGP-55.845 [5 iM] (Figur 3C lägre, varunder i grått)
5. parade Inspelningar av synaptically Kopplade FS-IN och CA1 datorer
- Bedöm GABA B R-medierad presynaptisk kontroll av hämmande synaptisk transmission med samtidiga inspelningar, som utförs mellan synaptically kopplade IN och PC paren som beskrivs nedan.
- Först skapa en hel-cell inspelning av en presynaptisk interneuronen (som i avsnitt 3) och bekräfta FS fenotypen (Figur 4A).
- Sedan patch en angränsande CA1 PC (20-100 um avstånd, figur 4A) och tillämpa korta suprathreshold depolariserande strömpulser (1 ms varaktighet, 1-5 nA amplitud) till presynaptiska IN (som hölls i strömklämläge) för att framkalla AP. Om en synaptisk coAnslutningar finns, AP i IN resultatet i iPSCs i CA1 PC, som hölls i spänning-klämma (kompenserar R S till ca 80%).
- Fyll vid behov en ny inspelning elektrod och spela in från ytterligare CA1 datorer tills en anslutning hittas.
- När en anslutning har upprättats, framkallar par AP i presynaptiska FS-IN för att bedöma både det enhetliga synaptiska respons och dynamiskt beteende. Använd en typisk parade pulsprotokoll 2 depolariserande stimuli med 50 ms intervall (Figur 4B).
- Samla kontroll spår i utgångsläget. Sedan gäller de selektiva GABAB-R agonist baklofen (10 ^ M) till perfusion ACSF, således aktiverande GABAB Rs, följt av antagonisten CGP-55845 (5 ^ M), att fullt blockera receptormedierad effekter. Samla ~ 50 spår under stabilt tillstånd för varje läkemedel tillstånd (figur 4B och C).
- När inspelningen är klar, försegla somatiska membranet genom att bilda en outside-out patch: Dra långsamt pipetten från cellkroppen i V-klämman och då R S ökar, minskar V M till -40 mV. Gör detta för att underlätta bildningen av den utanför-out patch; sedan ut pipetten ur badet.
6. Analys av elektrofysiologiska egenskaper
- OBS: En mängd olika mjukvarupaket finns tillgängliga för förvärv av elektrofysiologiska data. Här, WinWCP, ett Windows-program i den fria Strathclyde Elektro datorprogram används, vilket möjliggör inspelning av upp till 16 analoga ingångskanaler och produktion på 10 digitala signaler.
- Lågpassfilter all data vid 5-10 kHz och prov vid 20 kHz.
- Analysera fysiologiska data med en off-line analys svit.
OBS: Stimfit, en öppen källkod-paket som innehåller en Python skal, används i detta fall; emellertid andra alternativ kan lätt användas i stället.- Analysera passivt membran pEGENSKAPER av inspelade nervceller, som förvärvats i strömtång, från vila membranpotential.
- Mät den genomsnittliga vila membranpotentialen från baslinjen av inspelade svar från början av inspelningen.
- Beräkna ingångsmotstånd, med hjälp av Ohms lag, från spännings svar på de minsta hyperpolarizing strömpulser (≤ -50 Pa). För att förbättra signal-brusförhållande, genomsnittliga flera spår. OBS: våra exempel är typiskt genomsnitt av 10-50 enskilda svepen.
- Uppskatta den skenmembrantidskonstanten genom att montera en monoexponentiellt kurva till förfall av svaren på de minsta hyperpolarizing strömpulser.
- Analysera aktionspotentialens vågform för att bestämma tröskeln, amplitud (tröskel till topp) och varaktighet (bredd mätt vid halva höjden) som framkallas av tröskelnivån depolariserande strömpulser.
- Analysera GABA B R förmedlade iPSCs från spännings clamp inspelningar. Filter spårar off-line på500 Hz (Gaussian filter) och bedöma toppamplituden och latensen av GABA-B R förmedlad respons (i medeltal av minst 10 spår).
- Identifiera effekten av GABA B Rs på hämmande produktionen av INs som en förändring i topp amplitud av GABA A R-medierade iPSCs uppmätts mellan topp och före baslinjen. Beräkna medel amplituden från ≥50 spår för kontrollperioden och steady-state av alla farmakologiska epoker.
7 Visualisering och Immuncytokemi av FS-Ins
- Efter inspelningarna, fixera skivorna genom nedsänkning i 4% paraformaldehyd med 0,1 M fosfatbuffert (PB, pH = 7,35) O / N vid 4 ° C.
- Om nödvändiga skivor kan överföras till PB och lagras i upp till ~ 1 vecka innan bearbetning.
- Tvätta skivorna frikostigt i färskt PB och därefter i 0,025 M PB med 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
- För att reducera ospecifik antikroppsbindning, blockera skivor för 1 h vid RT i en lösning innehållande 10% normalt getserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (en detergent för att permeabilisera membran) och 0,05% NaN3, består i PBS.
- Att märka för PV uttryck, använda ett anti-PV monoklonal mus antikropp utspädd i en lösning som innehåller 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN3, i PBS. Inkubera primära antikroppar för 2-3 dagar vid 4 ° C 12. Skölj skivorna noggrant i PBS.
- Applicera fluorescerande anti-mus sekundära antikroppar (t.ex. Alexafluor-546.) Tillsammans med biotin-bindningsprotein-streptavidin, konjugerad till en fluorokrom (t ex, Alexafluor-647); och inkubera i en lösning innehållande 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN3, utspäddes i PBS och inkubera O / N vid 4 ° C.
- Frikostigt skölj skivor 2-3x med PBS följt av 2-3 sköljningar i PB. Montera skivor på glasskivor. Använd en 300 pm agar spacer att förhindra slice från att kollapsa. Cover-slip skivor med en fluorescent monteringsmedium och tätning med spik-lack.
8 Imaging och återuppbyggnad av Visualized FS-Ins
- Visualisera skivorna med hjälp av ett svep konfokalmikroskop med fluorochome reporter glada med lämplig laserlinjen (diodlaser 635 nm för Alexafluor-647; Helium-Neon 543 nm för Alexafluor-546 märkning för PV och Argon 488 eller 515 nm för Venus / YFP).
- Ta bilder vid en lämplig Z-upplösning (typiskt 0,5-1 ^ m steg, med användning av ett 20X objektiv) för framställning av en Z-stapel av hela cellen. Flera staplar krävs normalt att bilden hela cellen, vilket kan digitalt sydd off-line med hjälp FIJI / ImageJ programvara (Figur 5A).
- Rekonstruera cellen från hopsatta bilden stacken genom att använda en halvautomatisk spårning metod (Enkel Neurite Tracer plugin i FIJI / ImageJ programpaket 17, figur C).
- Slutligen bedömer PV-immunreaktivitet av interneuron med en hög numerisk apertur objektiv (60X kisel-immersion, NA = 1,3). Gör bilder av soma, proximala dendriter och proximala axon, alternativt av axon terminaler om somatisk washout av PV är för stark. Celler anses immun för PV, om immun märkningen ses för att anpassa de biocytin märkta strukturer (Figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förutsatt att slice kvalitet är märkbart bra, inspelning från både CA1 datorer och FS-ins kan uppnås med minsta svårighet. Den transgena råtta som uttrycker Venus / YFP under vGAT promotorn 13 inte entydigt identifierar FS-ins, eller faktiskt kand. Men inspelningar från INs i och runt str. pyramidale, där tätheten av FS-Ins är höga 1, resulterar i en hög sannolikhet för att välja FS-ins (Figur 2B). FS-ins kan särskiljas genom sina karakteristiska fysiologiska egenskaper som skiljer sig från både CA1 datorer och RS-ins. De har en relativt depolariseras vilomembranpotentialen (-58,9 ± 1,5 mV, 15 celler, jämfört med -62,6 ± 1,1 mV i CA1 datorer, 26-celler), låg resistans ingång (92 ± 12 Mohm vs 103 ± 14 Mohm i datorer) och snabb skenbar membrantidskonstant (15,4 ± 2,6 ms vs 22.0 ± 2,7 msek hos datorer), resulting i snabb spännings svar på hyperpolarisering strömpulser (Figur 2F). FS-INS urladdat mycket korta aktionspotentialer (0,38 ± 0,01 msek) med relativt låg amplitud (82,8 ± 1,0 mV), följt av mycket framstående snabba afterhyperpolarization (genomsnittlig amplitud 22,6 ± 2,9 mV). Som svar på stora depolariserande strömpulser (250 Pa), FS-Ins sköt vid höga frekvenser (82 ± 10 Hz Räckvidd: 34-128 Hz, figur 2D, vänster).
För att bedöma GABA B-R-medierad postsynaptiska strömmar i FS-ins, var farmakologiskt isolerade synaptiska svar framkallade av extracellulär stimulering av hämmande fibrer på str. radiatum / lacunosum-moleculare kant. Figur 3 visar ett exempel på en FS-IN, i vilket sekventiella blockad av komponenter av föreningen synaptiska respons isolerar monosynaptiska GABA B R-förmedlad långsam IPSC. Synaptic svaren var eliciteras av enskilda stimuli eller tåg på 3-5 stimuli (50 V intensitet, 0,1 ms varaktighet, levereras vid 200 Hz) till str. lacunosum-moleculare / radiatum gränsen (Figur 3A). Den ursprungliga föreningen svar inklusive både retande och hämmande komponenter (figur 3C, överst) var starkt minskat med bad tillämpning av AMPA och NMDA-receptorantagonister (DNQX, 10 ^ M och AP-5, 50 ^ M respektive: figur 3C, mitten). Rest monosynaptic IPSC omfattade en tidig snabbt inåt ström (en förmodad inåt Cl - medierad ström vid hållpotentialen -65 mV, med en återföring potential på ca -60 mV, i dessa experiment) och en långsammare utåt ström (förmedlad av en förmodad K + konduktans med en återföring potential nära 100 mV). Tillämpning av selektiva GABA A R antagonist gabazine (SR-95531, 10 ^ M) avskaffades den snabba IPSC, som lämnar enisolerade den långsamma GABA B R-medierad IPSC (figur 3C, botten, svart spår); som observerades som svar på en enda stimulans, men tydligare svar på korta tåg av stimuli. Detta bekräftades som en GABA B R-aktiverade K + konduktans, som blockerades av potent och selektiv antagonist CGP-55.845 (CGP, 5 ^ M, figur 3C, botten, grå spår). FS kand visar vanligtvis stora amplitud GABA B-R-medie iPSCs, såsom visas i vår senaste publikation 12.
För att bedöma presynaptiska reglering av FS-IN hämmande produktionen med GABA B-Rs, var parade inspelningar utförs från synaptically kopplade FS-IN och CA1 datorer. Synaptic anslutning mellan FS kand och CA1 datorer är relativt hög, som visas tidigare 1,3. I dessa inspelningar, som visas tidigare, är kopplings sannolikhet över 50% mellan närbelägna cell par (≤50 pm;
När en inspelning hade slutförts, en utanför-out patch framgångsrikt bildas, var skivorna fasta över natten och därefter behandlas för att visualisera och analysera morfologi inspelade cellerna och bestämma deras neurokemisk markör innehåll. Figur 5A illustrerar morfologin av en företrädare FS BC i en projektion av kombinerade bildstaplar som erhållits på ett konfokalmikroskop. Cellens uttryck av PV bekräftades i immunocytokemisk märkning som gav en tydlig immun signalen över cellkroppen och proximala dendriter av det inspelade och biocytin märkt cell (Figur 5B). Tredimensionell rekonstruktion av cellen utfördes från sydda bildstaplar med Enkel Neurite Tracer plugin i FIJI programvara (figur 5C) 17. Axonet visade en hög densitet av säkerheter och nära str. pyramidale med &# 8220; korgar "som bildas runt somata av CA1 datorer (Figur 5A, inlägg), förmodat identifiera denna cell som en BC. Vidare lokalisering av soma nära att strä. pyramidale och radiellt orienterade dendriter spänner alla lager av CA1 motsvarar väl den typiska morfologiska kännetecken för FS kand 10.
Sammanfattningsvis i helcells-upptagningar erhållna från identifierade FS PV + kand, har vi visat att dessa celler uttrycker stora amplitud GABAB R-förmedlad långsam iPSCs och deras synaptisk utgång är också markant hämmas genom aktiveringen av presynaptiska GABAB Rs.
Figur 1 Framställning av akuta hippocampus skivor. (A) En färskt dissekerat rått-hjärna. Notera isen som omger hjärnan, bibehållatemperaturen av hela hjärnan nära 0 ° C. (B) Kapning av 300 um hippocampus skivor på en Leica VT1200s vibratome. De hemisfärerna är inriktade så att den kortikala ytan skärs först. Notera den stora mängden av slask is omger hemisfärer och den konstanta carbogenation av den isiga ACSF (pil). (C) Efter skärning hjärnan skivor förflyttas till värmas sackaros-ACSF. Skivorna vändes över och putsas för att avlägsna framhjärnan och mellanhjärnan, vilket innebär att endast hippocampus och överliggande cortex.
Figur 2 Hel-cell patch-clamp inspelning från intern. (A) konfiguration Inspelningen runt kammaren. Notera inflödet och utflödet är på motsatta sidor av kammaren för att uppnå en nära laminärt flöde. Synlig är också RECORDIng elektroder, monterade på headstages och jordelektroderna på båda sidor, samt målet (40X, vatten-immersion) i mitten. (B) Low-power epifluorescent bild av vGAT-Venus / YFP signal i CA1 av hippocampus i en skiva. (C) IR-DIC avbildning av samma område. Pilarna i B och C visar en Venus / YFP positiva interneuronen i cellkroppen lagret. (D) med hög effekt IR-DIC bilder av soma av neuron som anges i fält B, med en annalkande fläckpipetten bildar fördjupningen på yta (överst) och, därefter, cellen i konfigurationen för helcells-(botten). (E) Schematisk illustration av de viktigaste stegen i upprättande av en hel-cell patch-clamp inspelning (vänster sida) med tecknade svar på en testspänning -pulse övervaka resistansen vid pipettspetsen (höger sida). Övre raden: pipett i badet från cellen; Övre mitten: Dimple formation, tillsammans med enminskning av den pulsamplitud, vilket indikerar en måttlig ökning i resistans. Nedre mitten: Giga-ohm tätningsbildning. Observera att nuvarande pulsamplituden reduceras dramatiskt. Endast de snabba kapacitiva strömmar är synliga i början och slutet av pulsen innan pipetten kapacitans kompenseras. Botten: Hela-cell inspelning konfiguration uppnås genom att bryta genom membranet plåstret under pipettspetsen. Observera att de stora men relativt långsamma kapacitiva strömmar i början och slutet av pulsen innan seriemotstånd ersättningar tillämpas. (F) Representativa spår av en FS-IN (överst) och CA1 PC (botten), som framkallas av en familj av hyper - att depolariserande strömpulser (protokoll visas ovan). Notera ansvarsfrihet mycket hög frekvens av FS-IN jämfört med den mycket långsammare bränning av CA1 PC. Inläggningar på höger: Jämförelse av AP vågformen från CA1 PC (överst) och FS-IN (botten, i grått, överlagras på datorn AP i svart), som illustrerar difference i vågformen av AP och AHP.
Figur 3 Farmakologisk dissektion av föreningen synaptiska svaret, isolera långsam GABA B-R-medierad iPSCs i en FS-IN. (A) IR-DIC bild av skiva i inspelningen kammaren, med inspelningen elektroden (Patch) placeras vid gränsen till str. Oriens (Ori.) och pyramidale (Pyr.) och simuleringen elektroden (Stim) vid gränsen till str. radiatum (. Rad) och lacunosum-moleculare (LM) (B) Vänster:. Schematisk illustration av konfigurationen inspelningen. Höger: Inspeglad spänningssvar i FS-IN som framkallas av en familj av hyper- att depolariserande nuvarande injektioner (C) Representativa spår inspelade från FS-IN som svar på extracellulär stimulering.. Överst: Föreningensynaptiska respons produceras i normal ACSF som framkallas av en enda stimulus (50 V intensitet, 0,1 ms varaktighet). Middle övre: Isolerad monosynaptic IPSC efter badet tillämpning av DNQX (10 M) och d-AP-5 (50 M). Middle lägre: De snabba monosynaptic iPSCs är blockerad efter tillägg av gabazine (10 M) till badet. Nederst: Ett tåg av 5 stimuli (vid 200 Hz) avslöjar en långsam GABA B R förmedlad IPSC (svarta spår), som blockeras av senare tillämpning av CGP (5 M) till badet (lagrade grå spår).
Figur 4 Analys av presynaptisk modulering av hämmande synaptisk överföring i en parad inspelning från en kopplad FS-IN och CA1 PC paret. (A) Vänster panel: IR-DIC bild av de två inspelningspipetter, den vänstra lappat på FS-IN vid gränsen för < em> str. Oriens (Ori.) och pyramidale (Pyr.) och rätt lappat till en CA1 PC närmare str. radiatum (Rad.). Höger panel:. En schematisk konfiguration inspelningen med representativa spänning svar från FS-IN (vänster) och CA1 PC (höger) till en familj av strömpulser (B) Representativa spår som visar AP framkallade i presynaptiska FS-IN (överst) och den kort latens enhetlig IPSC i CA1 PC (botten) under kontroll förhållanden (spår till vänster), efter badet tillämpning av baklofen (10 ^ M, mitten), och efterföljande tillämpning av CGP (5 ^ M, höger) . Observera att baklofen reducerade IPSC amplitud med ~ 50%, medan CGP resulterade i en nästan full återhämtning av IPSC amplitud. Kontroll spår är visade underlain. (C) Tidsförloppet plot av IPSC amplitud visar effekten av baklofen och CGP. IPSCs registrerades vid 10 sek intervall.
Figur 5 Visualisering, återuppbyggnad och immuncytokemiska identifiering av en biocytin märkt inspelade FS-BC. (A) En projektion av sydda högar av bilder av en FS-IN avbildas med en 20X objektiv på en konfokalmikroskop. Den somata ligger vid gränsen till str. radiatum (Rad.) och pyramidale (Pyr.) av CA1-området, dendriterna körda radiellt och spänner över alla skikten, medan majoriteten av axonet hittas i och runt cellkroppen skiktet; som typiskt för kand. Skala bar: 100 nm. Inset, överst till höger: hög förstoring projektion av en 20 lager, som visar typiska korgar av axon bildar runt förmodade CA1 PC somata (Orange asterisker). Skala bar:. 10 mikrometer (B) biocytin fyllda cell kropp IN (vita pseudocolour, nedre panelen, pil) visar immunoreaktivitet för PV (i grönt, övre panelen). Skalabar:. 20 ^ m (C) Projicering av den 3-dimensionella rekonstruktion av cellen. Den soma och dendriter är i svart och axonet rödfärgade. Lager av CA1 avgränsas i blått. Förkortningar: Ori, str. oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Skala bar: 100 nm.
| Namn | Sammansättning (mM) | Använd | Anmärkningar |
| Sackaros-ACSF | 87 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCOs 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glukos, 75 sackaros, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2, 1 Na-pyruvat, 1 Na-askorbat | Beredning och lagring av hjärnan skivor | pH = 7,4; osmolaritet = ~ 350 mOsm |
| Inspelning ACSF | 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCOs 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glukos, 1 MgCl | Inspelning från hjärnan skivor | pH = 7,4; osmolaritet = 310-315 mOsm |
| Intracellulär lösning (1) | 125 K-glukonat, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin och 0,1% biocytin | Fyllning elektroder av GABAB IPSC inspelningar | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Intracellulär lösning (2) | 105 K-glukonat, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin och 0,1% biocytin | Fyllning elektroder för parade inspelningar | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Fosfatbuffert (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Sköljning fasta skivor | pH = 7,4 |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCI (0,9% vikt / volym) | Sköljning fasta skivor och antikropps inkubation | pH = 7,4 |
| Paraformaldehyd fixativ | 4% vikt / volym Paraformaldehyd, 0,1 mM PB | Fixering av hjärnan skivor | pH = 7,4 |
Tabell 1. Lösningar lista.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metod som kombinerar elektrofysiologiska och neuroanatomiska tekniker för att funktionellt karakterisera morphologically- och neurokemiskt identifierade nervceller in vitro; särskilt de olika typerna av kortikala hämmande ins. Viktiga aspekter av förfarandet är: (1) förval av potentiella INs; (2) intracellulära inspelning och neuron visualisering; och slutligen (3) morfologiska och immunocytokemisk analys av inspelade ins. Även om denna studie har riktat PV-ins i synnerhet, kan den beskrivna protokoll användas för liknande inspelningar från någon interneuronen eller andra neuronala typer, med minimal förändring.
Det relativt låga antalet intern i kortikala områden gör slumpmässiga urval och inspelning från dessa celler mycket ineffektiva. Avvikande lokalisering och morfologiska egenskaper har gjort det möjligt för forskare att urskilja och rutinmässigt spela in från vissa Interntyper. Men i skivor, identifiering av praktikanteurons i och i närheten av cellkroppen lagren är fortfarande svårt, till exempel med FS-ins. Tillkomsten av transgena mus linjer, som uttrycker de fluorescerande proteiner i specifika Intern populationer erbjuder en elegant lösning som gör förval och registrering av dessa neuroner mycket effektivare 2. Nu många transgena linjer, mest möss, men i allt högre grad även råttor 13 finns tillgängliga, underlätta utredningen av intern. Vid användning av transgena linjer, är det dock viktigt att fastställa omfattningen och specificiteten hos reportern uttryck.
Kvaliteten på cellulär märkning och morfologi, samt elektrofysiologiska inspelning, att vara beroende av livskraftiga, högkvalitativa skivor; som hjärnan behöver snabbt dissekeras (helst 20-40 sek), hanteras mycket noggrant och kontinuerligt kylda. Vi finner att användningen av sackaros-ACSF, varvid den totala natriumkoncentrationen och därmed retbarhet av nervceller minskar, dramatiskt förbättrar kvaliteten på skivorna och Intern överlevnad 18. Det bör dock framhållas att många forskare har använt sig av standardinspelnings ACSF för skiva beredning, med stor framgång 10,11,15. Morfologisk integritet beror mycket på den vinkel som skivor skärs 13; som varierar beroende på region och celltyp. Men många intern tillförlitligt spelas in från tvärgående, koronala eller sagittal skivor. För att ytterligare minimera avgångs av dendriter och axon, celler djupare i vävnaden bör riktade, om än att offra IR-DIC kvalitet och tillförlitlighet i giga-ohm tätningsbildning. Under dessa omständigheter inspelningar från båda CA1 pyramidala celler och FS-ins tillförlitligt kan erhållas.
Märkning och visualisering av nervceller uppnås efter en typisk inspelning som varar 30 minuter eller längre. Om inspelningar varar mindre än 30 min, är det nödvändigt att låta denna tid före fixering aktivera biocytin att diffundera in distala dendritiska och axonal processer, som garanterar fullständig fyllning och således post-hoc visualisering av celler.
I hel-cell inspelningar, är absolut nödvändigt att exakt fysiologiska mätningar av synaptiska och inneboende egenskaper, samt noggrann märkning av nervceller bibehålla låga och stabila seriemotstånd. Dock låg motståndselektroder tillåter snabb dialys av cytoplasman med den intracellulära lösningen som finns i pipetten. Komplettering av intracellulära lösningen med ATP, GTP och fosfokreatin hjälper verkligen att upprätthålla energiförsörjningen och inspelningskvalitet. Däremot kan dialys av neurokemikalier och protein leda till minskad svar, minskad plasticitet 19 och kan även hämma neurokemiska identifiering. Exempelvis PV är konsekvent tvättas ut av nervceller under loppet av längre experiment. Därför kan undersökning av distala dendritiska eller axonal processer åläggas att Dete rmine immunoreaktivitet av den inspelade neuron. I sådana fall där sådan dialys är ett bekymmer, inspelningar med perforerade-patch konfiguration kan utnyttjas för att bevara den intracellulära miljön 20, men plåstret måste brytas i slutet av inspelningar eller neuron senare "repatched" i konfigurationen för hel-cell att tillåta biocytin fyllning.
Farmakologisk undersökning av inspelade nervceller är en användbar metod för att bedöma den funktionella betydelsen av olika neuromodulatory mekanismer i att forma den inneboende och synaptisk aktivitet ins. I de ovan beskrivna metoderna, är farmakologisk isolering och parade inspelningar används för att bedöma placera och presynaptisk GABA B R-förmedlade effekter, respektive; emellertid kan ett lätt modifiera kombinationen av receptoragonister och antagonister för att bedöma rollen av alternativa receptorfamiljer, exempelvis den cannabinoid systemet 21.
"> Histologisk och immunocytokemisk bearbetning av inspelade celler är mycket tillförlitlig, när protokollen är etablerade. Den immuncytokemi protokoll som beskrivs här har avstämd med avseende på kombinationen av antikroppar används, skivtjocklek och kravet på att identifiera den neurokemiska innehåll. Vi använder normalt getserum som alla sekundära antikroppar som används är upphöjda i get. Som alternativ är det också möjligt att använda bovint serumalbumin (BSA) eller mjölkpulver som blockerande medel. Det bör noteras att detta protokoll använder fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för antikroppen inkubation emellertid alternativt en helt enkelt kunna använda 0,1 M PB i stället för PBS. Med hjälp av en relativt hög koncentration av detergent (0,3% Triton X-100), inte minskar uppenbar antigenicitet, samtidigt som man tillåter penetration av antikroppar in i den första 100 | im ytskikt skiva , där nervceller rutinmässigt registreras. Om djupare celler registreras eller skivorna är tjockare, är det lämpligt att resectipå skivorna, med hjälp av en kryostat eller vibratome, och utför immunomärkning på de tunna (40-70 mikrometer) sektioner. Till 300 | im skivor, en lång inkubation av antikropparna (till vid 4 ° C bevara den strukturella integriteten av skivorna) producerar mycket tillförlitliga immunocytokemiska resultaten.Identifiering av nervceller bygger på den kombinerade information som erhållits i inspelningen, den post-hoc morfologiska och immunocytokemiska analysen. I hippocampus, på grund av den stränga laminära organisation är axonal fördelning en bra indikator på de postsynaptiska mål för intern. Severed axon eller dendriter kan emellertid göra identifiering svår eller omöjlig. Vidare kvarstår en viss tvetydighet, exempelvis i differentierings PV + kand och axo-axonic intemeuroner, på grund av likheten i det totala axonal lokalisering. En slutlig definitiv identifiering skulle kräva elektronmikroskopanalys av postsynaptiska mål 1,3 or ytterligare immunocytokemisk dissektion 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ina Wolter för hennes utmärkta tekniskt stöd. VGAT-Venus transgena råttor genereras av Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi och Y. Kawaguchi i Institutet för Fysiologiska Vetenskaper, Okazaki, Japan, med hjälp pCS2-Venus från dr A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
