Summary
Corticale netværk styres af en lille, men varieret sæt hæmmende interneuroner. Funktionel undersøgelse af interneuroner kræver derfor målrettet optagelse og stringent identifikation. Beskrevet her er en kombineret tilgang, der involverer hele-celle optagelser fra en enkelt eller synaptisk koblede par af neuroner med intracellulær mærkning, post-hoc morfologiske og immuncytokemisk analyse.
Abstract
GABAerge inhibitoriske interneuroner spiller en central rolle inden for neuronale kredsløb i hjernen. Interneuroner omfatter en lille delmængde af den neuronale befolkning (10-20%), men udviser en høj grad af fysiologiske, morfologiske og neurokemiske heterogenitet, hvilket afspejler deres forskellige funktioner. Derfor undersøgelse af interneuroner giver vigtige indsigt i tilrettelæggelsen principper og funktion af neuronale kredsløb. Det kræver imidlertid en integreret fysiologisk og neuroanatomiske tilgang til udvælgelse og identificering af de enkelte Interneuron typer. Whole-celle patch-clamp optagelse fra akutte hjerne skiver af transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner under initiativtagerne Interneuron-specifikke markører, giver en effektiv metode til at målrette og elektrofysiologisk karakterisere iboende og synaptiske egenskaber specifikke Interneuron typer. Kombineret med intracellulær farvestof mærkning, kan denne tilgang udvides med post-hoc-morphological og immuncytokemisk analyse, der gør det muligt systematisk identifikation af optagne neuroner. Disse metoder kan skræddersys til at passe en bred vifte af videnskabelige spørgsmål vedrørende funktionelle egenskaber af forskellige typer af corticale neuroner.
Introduction
Hippocampus neuronale kredsløb har længe været genstand for intens kontrol, både med hensyn til anatomi og fysiologi, på grund af deres afgørende rolle i indlæring og hukommelse samt rumlig navigation i både mennesker og gnavere. Ligeledes er fremtrædende, men simpelt laminar organisering af hippocampus gør denne region et yndet genstand for undersøgelser vedrørende strukturelle og funktionelle egenskaber af kortikale netværk.
Hippocampus kredsløb består af excitatoriske vigtigste celler (> 80%) og en mindre (10-20%), men meget forskelligartede kohorte af hæmmende interneuroner 1-3. Interneuroner frigive γ-aminosmørsyre (GABA) fra deres axonterminaler som virker ved hurtigt ionotropiske GABAA-receptorer (GABAA R'er) og langsomme metabotrope GABAB receptorer (GABAB Rs) 4. Disse inhibitoriske mekanismer modvægt excitation og regulere ophidselse af primære celler og dermedIR timing og mønster af decharge. Men GABA frigives fra interneuroner ikke kun fungerer på vigtigste celler, men også på interneuroner selv 5,6. Pre og postsynaptiske receptorer medierer feedback regulering og hæmmende gensidige interaktioner mellem de forskellige typer af interneuron. Disse hæmmende mekanismer i Interneuron netværk menes at være centrale for generering og udformningen af befolkningens aktivitet mønstre, navnlig svingninger på forskellige frekvenser 7.
Whole-celle patch-clamp optagelse er en veletableret metode til undersøgelse af iboende egenskaber og synaptiske interaktioner af neuroner. Men på grund af den høje mangfoldighed Interneuron typer undersøgelse af inhibitoriske interneuroner kræver streng identifikation af de optagede celler. Som hippocampus Interneuron typer er kendetegnet ved distinkte morfologiske træk og neurokemiske markør udtryk, kombineret anatomiske og immunocytokemisk examination kan være et middel til at bestemme præcis interneuron identitet 6,8,9.
I denne artikel beskriver vi en eksperimenterende tilgang, hvor hel-celle patch-clamp optagelser fra enkelte neuroner eller synaptisk koblede par er kombineret med intracellulær mærkning, efterfulgt af post-hoc morfologiske og immuncytokemiske analyse, der giver mulighed for karakterisering af langsom GABA B receptormedieret hæmmende effekt på identificerede interneuroner. Som et eksempel, har vi fokus på en større type interneuron, en delmængde af de såkaldte "basket celler" (BC), som innerverer Soma og proksimale dendritter sine postsynaptiske mål og er kendetegnet ved en "hurtig spiking" (FS) aflade mønster, en Axon tæt dækker cellen hovedlaget, og ekspression af calcium-bindende protein parvalbumin (PV) 10,11. Disse interneuroner vise store postsynaptiske hæmmende strømme, såvel som fremtrædende præsynaptisk modulering af deres synaptisk produktion som reaktion på GABA B R aktivering 12. Kombinationen af teknikker beskrevet her kan anvendes lige godt til at undersøge iboende eller synaptiske mekanismer i en række andre identificerede neuron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle procedurer og dyr vedligeholdelse blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, den tyske dyreværnsloven, Det Europæiske Råd i direktiv 86/609 / EØF om beskyttelse af dyr, og retningslinjer fra de lokale myndigheder (Berlin, T-0215/11 )
1. Fremstilling af akut-hippocampusskiver
- Tag en transgen rotte (17 til 24 dage gamle), der udtrykker fluorescerende Venus / YFP protein under vGAT promotor, hvilke etiketter de fleste kortikale hæmmende interneuroner 13. Halshugge rotten. Hurtigt dissekere hjernen (<40 sek) i semifrozen, carbogenated (95% O2 / 5% CO 2) saccharose-baserede kunstig cerebrospinalvæske (saccharose-ACSF, figur 1A).
- Vurdere dissekeret rotte hjerne til Venus / YFP fluorescens med en 505 nm LED lampe og 515 emission filter monteret på et par briller.
- Fjern den forreste tredjedel af cortex og CerebEllum; derefter adskille halvkugler, alle med en skalpel. Fjern den dorsale overflade af cortex for at tilvejebringe en flad overflade at lime hjernen ned, som tidligere beskrevet 14.
- Skær tværgående skiver (300 um) af hippocampusformationen på en vibratom bør halvkugler være omgivet med semifrozen, carbogenated saccharose ACSF (figur 1B) 14. Fjern yderligere regioner rostralt cortex midthjernen og hjernestammen. Overfør hver skive til en neddykket bedrift kammer indeholdende saccharose-ACSF, der carbogenated og opvarmes til 35 * C.
- Lad skiverne til at inddrive ved 35 º C i 30 min fra tidspunktet for den sidste skive ind i opvarmet ACSF. Gør dette med henblik på at reaktivere metaboliske processer og letter genlukning af afskårne neuronale processer. Derefter overføre til stuetemperatur til opbevaring (figur 1C).
2. Fabrikation og fyldning af Recording pipetter
- Pull patch pipetter fra glaskapillarer, således at en pipette modstand på 2-4 MQ opnås, når den fyldes med filtreret (sprøjtefilter, porestørrelse: 0,2 um) intracellulære opløsning indeholdende 0,1% biocytin (til intracellulær mærkning). Hold intracellulære løsning afkølet på is for at forhindre nedbrydning af dens bestanddele.
- Fyld patch pipetter til identifikation af postsynaptiske strømme med en opløsning indeholdende en fysiologisk relevant lav Cl - koncentration (E R (Cl) = -61 mV, se løsning liste).
- For parret optagelser til at identificere de præsynaptiske receptor medierede responser, fylde patch pipetter med intracellulær løsning med lav Ca 2 + buffer kapacitet til at forhindre interferens med transmitterfrigivelse præsynaptisk, samt 4 gange højere Cl - koncentration (E R (Cl) = -20 mV) for at forbedre signal-støj af observerede IPSCs 5 tillader præcis vurdering af farmakologisk hhvonsiveness. Bemærk, at ændring Cl - koncentration kan ændre IPSC kinetik 15.
3. Hele Cell Patch-clamp Optagelse fra FS-Ins
- Carbogenate den ACSF og foder gennem perfusionssystemet til optagelsen kammer ved hjælp af en peristaltisk pumpe (som også fjerner ACSF fra optagelsen kammer gennem en sugeledning, figur 2A). Tænd alt udstyr om opsætningen i forberedelse til optagelse.
- Overfør en skive til optagelsen kammer og hold på plads med en platin ring trukket med enkelte fibre af silke. Placer skive, således at stratum (str). Pyramidale af CA1 løber lodret gennem synsfeltet, som giver adgang med 2 pipetter til både str. radiatum og str. Oriens samtidigt (figur 2C og 4A).
- Placer kammeret ind i setup og begynde perfusion af carbogenated og varmes (32-34 º C) indspilning ACSF ved en strømningshastighed på 5-10 ml / min.
- Vurdere skive kvalitet under IR-DIC optik på 40X objektivforstørrelse, og visualisere med et CCD-kamera vises på en skærm. Antag god skive kvalitet, hvis et stort antal runde, moderat kontrast CA1 pyramideformede celler (CA1-PC) kan ses i str. pyramidale på dybder på 20-30 um under en glat og let kraterfulde overflade (figur 2C). Dårlig kvalitet skiver indeholder et stort antal stærkt kontrast, indskrumpet eller opsvulmede celler, med en ujævn skive overflade.
- Identificer formodede FS interneuroner i epifluorescensbelysning som de udtrykker Venus / YFP (figur 2B), med store flerpolet somata i eller i nærheden str. pyramidale. Marker cellerne rimeligt dybt inde i skive (50-100 um, figur 2C) for bedre at kunne bevare deres morfologiske integritet.
- Monter elektrode i pipetten holderen på hovedtrin; derefter på apply en lav, positivt tryk (20-30 mbar) gennem røret linje. Sænk pipetten til overfladen af den skive, lidt forskudt til centrum af den valgte neuron.
- Opnå hel-celle optagelse konfiguration som beskrevet tidligere 14,16 og se også figur 2D og 2E:
- Målret mod en celle: Øg trykket til 70-80 mBar og hurtigt sænke pipetten gennem skive til lige over soma af den valgte celle (figur 2D, øverst).
- Approach cellen: Tryk på pipetten mod cellemembranen til at producere en "smilehul" på det (Figur 2D, øverst). Udfør dette trin hurtigt, for at forhindre biocytin mærkning af naboceller.
- Opret en giga-ohm tætning: Slip trykket og samtidig anvende en 20 mV spænding kommando til pipetten. En giga-ohm tætning (1-50 GQ, Figur 2D, bund og figur 2E midten) typicallieret udvikler sig hurtigt. Når forseglet, anvende den forventede hvilende membranpotentiale (typisk mellem -70 og -60 mV) som en spænding kommando.
- Bryde gennem plastret: Når forseglet, sprænges membranen plaster med en kort impuls af undertryk; derved opnå helcelle-konfiguration (figur 2E, nederst).
- Kompensere hel-celle kapacitans og serie modstand (R S). Rs er normalt 5-20 MOhm og stabile i op til 120 min. Abandon celler hvis membranpotentiale (V M) på gennembrud er mere depolariseret end -50 mV; R S er indledningsvis større end 30 MOhm; eller R S ændres med mere end 20% i løbet af optagelsen.
- Identificer FS-Ins ved deres respons (i løbende klemme tilstand) til en familie af hyper at depolariserende strømpulser (-250 til +250 pA, figur 2F, øverst). FS-ins har relativt depolariseret V M (typisk -50 to -60 mV), kort membran tid-konstant (<20 ms) og svare til en 500 pA depolariserende strøm injektion med et tog af virkningspotentialer (APS) ved frekvenser> 100 Hz 11 (figur 2F, nederst), som er markant forskellige fra dem i CA1-pc'er (figur 2F, midten).
4. Ekstracellulært elektrisk stimulation til at fremkalde GABA B R-medierede responser
- At observere synaptisk fremkaldte reaktioner, skal du placere en ekstracellulær stimulering elektrode (en patch pipette fyldt med 2 M NaCl, Resistance: 0,1-0,3 MOhm) i skive på grænsen mellem str. radiatum og str. lacunosum-moleculare. Placer elektroden 200-300 um lateralt for soma at forhindre direkte elektrisk stimulering af cellen og minimere stimulation artefakter (figur 3A).
- Når stimulering elektrode er anbragt, opnå helcelle-registrering afden valgte celle og vurdere den fysiologiske fænotype i strøm-clamp modus som i afsnit 3.9 (figur 3B).
- Med neuron registreret i spænding-clamp (V M -65 mV) leverer elektrisk stimulation af præsynaptiske axoner ved 50 V (~ 500 uA effektiv stimulus) hver 20 sek, ved hjælp af en isoleret konstant spænding stimulator. Brug enkelt stimuli (100 mikrosekunder varighed, figur 3C, øverst) at observere GABA B R medierede IPSCs og indskydning med tog fra flere stimuli (ved 200 Hz) til at producere større senderen udgivelse.
- Bad anvendelse ionotrope glutamat-receptorantagonister (AMPA receptor: DNQX [10 pM] NMDA-receptor: d-AP5 [50 pM]) for at afsløre den isolerede monosynaptisk IPSC (figur 3C, midterste øvre). Yderligere isolere GABA B R-medieret IPSC med anvendelse af en GABA-A R blokker (gabazine [10 uM] Figur 3C midterste lejs).
- Bekræft resulterende langsomt udad strøm (figur 3C lavere, er udvidet) som værende GABA B R-medieret af den efterfølgende anvendelse af CGP-55845 [5 uM] (figur 3C lavere, ligget til grund i gråt)
5. parrede Optagelser af synaptisk Koblede FS-IN og CA1 pc'er
- Vurdere GABA B R-medieret præsynaptiske styring af hæmmende synaptisk transmission med samtidige optagelser, der udføres mellem synaptisk-koblet og pc par som beskrevet nedenfor.
- Først oprette en hel-celle optagelse af en præsynaptisk interneuron (som i afsnit 3), og bekræft FS fænotype (figur 4A).
- Derefter lappe en nærliggende CA1 PC (20-100 um afstand, figur 4A) og anvende kort suprathreshold depolariserende strømimpulserne (1 ms varighed, 1-5 nA amplitude) til den præsynaptiske IN (afholdt i løbende klemme tilstand) for at fremkalde ApS. Hvis en synaptisk connection er til stede, ApS i IN resultat i IPSCs i CA1 PC'en, der blev afholdt i spænding-clamp (kompensere R S til omkring 80%).
- Hvis det er nødvendigt, skal du udfylde en ny optagelse elektrode og optage fra yderligere CA1 pc'er indtil en forbindelse er fundet.
- Når en forbindelse er etableret, fremkalde par APs i den præsynaptiske FS-IN for at vurdere både den enhedsstat synaptiske respons og dynamisk adfærd. Brug en typisk parret-puls-protokollen af 2. depolariserende stimuli med 50 msek interval (figur 4B).
- Saml kontrol spor i baseline forhold. Derefter anvende selektive GABAB R agonist baclofen (10 uM) til perfusion ACSF og dermed aktivere GABAB R'er, efterfulgt af antagonisten CGP-55845 (5 uM), til fuldt ud at blokere receptor medierede virkninger. Saml ~ 50 spor under steady state for hvert medikament tilstand (figur 4B og C).
- Når optagelsen er færdig, forsegle det somatiske membran ved at danne en outside-ud patch: Langsomt trække pipetten fra cellen kroppen i V-klemme og som R S stiger, reducere V M til -40 mV. Gør dette for at lette dannelsen af den udvendige-out patch; derefter fjerne pipetten fra badet.
6. Analyse af elektrofysiologiske egenskaber
- BEMÆRK: Et væld af forskellige software pakker er tilgængelige for erhvervelse af elektrofysiologiske data. Her WinWCP, et Windows-program i det frie Strathclyde Elektrofysiologi Software pakke anvendes, som tillader registrering af op til 16 analoge indgangskanaler og output af 10 digitale signaler.
- Lavpasfilter alle data 5-10 kHz og prøve ved 20 kHz.
- Analyser fysiologiske data med en off-line analyse suite.
BEMÆRK: Stimfit, et open source-software, der inkluderer en Python shell, der bruges i dette tilfælde; kan dog sagtens bruges andre alternativer i stedet.- Analyser passiv membran pgenskaber af indspillede neuroner, erhvervet i strømtang fra hvilende potentiale membran.
- Mål gennemsnitlige hvilende membranpotentiale fra baseline af indspillede svar fra begyndelsen af optagelsen.
- Beregn input modstand, ved hjælp af Ohms lov, fra spændingen reaktion på de mindste hyperpolarisering strømimpulser (≤ -50 PA). For at forbedre signal støjforhold, gennemsnitlige flere spor til. Bemærk: vores eksempler er typisk gennemsnit af 10-50 individuelle slagene.
- Vurdere den tilsyneladende membran tid konstant ved at montere en monoeksponentiel kurve til henfald af svarene på de mindste hyperpolarisering strømimpulser.
- Analyser handling potentiel bølgeform at bestemme tærskel, amplitude (tærskel til spids) og varighed (bredde målt i halv højde) fremkaldt af tærskelværdi depolariserende strømpulser.
- Analyser GABA B R medierede IPSCs fra spænding clamp optagelser. Filter spor off-line på500 Hz (gaussisk filter) og vurdere peak amplitude og latens af GABA B R medieret respons (i gennemsnit på mindst 10 spor).
- Detect virkningen af GABAB-R'er om inhiberende produktion af ins en ændring i amplitude af GABAA R-medierede IPSCs målt mellem top og forud for baseline. Beregn den gennemsnitlige amplitude fra ≥50 spor for kontrol periode, og steady-state af alle farmakologiske epoker.
7. Visualisering og Immuncytokemi af FS-Ins
- Efter optagelserne fastsætte skiver ved nedsænkning i 4% paraformaldehyd med 0,1 M fosfatbuffer (pH = 7,35) O / N ved 4 ° C.
- Hvis de nødvendige skiver kan overføres til PB og opbevares i op til ~ 1 uge før behandling.
- Vask skiver gavmildt i frisk PB og efterfølgende i 0,025 M PB med 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
- For at reducere ikke-specifik antistofbinding blokere skiverne for 1 time ved stuetemperatur i en opløsning indeholdende 10% normalt gedeserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (en detergent til permeabilisere membraner) og 0,05% NaN3, der består i PBS.
- At mærke til PV-ekspression, bruge en anti-PV monoklonalt muse-antistof fortyndet i en opløsning med 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN3 i PBS. Inkuber primære antistoffer i 2-3 dage ved 4 ° C 12. Skyl skiver grundigt i PBS.
- Påfør fluorescerende anti-muse-sekundære antistoffer (f.eks AlexaFluor-546.) Sammen med biotin-bindingsprotein streptavidin konjugeret til et fluorokrom (f.eks AlexaFluor-647); og inkuberes i en opløsning indeholdende 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN3, fortyndet i PBS og inkuberes O / N-ved 4 ° C.
- Liberalt skylle skiver 2-3x med PBS efterfulgt af 2-3 skylninger i PB. Monter skiver på objektglas. Brug en 300 um agar spacer for at forhindre skive kollapse. Cover-slip skiver med en Lysstofrørcent montering medium og tætning med søm-lak.
8. Billedbehandling og genopbygning af visualiseret FS-Ins
- Visualiser skiverne ved hjælp af en konfokal mikroskop med fluorochome reporter ophidset med passende laserlinje (diodelaser 635 nm for AlexaFluor-647, Helium-Neon 543 nm for AlexaFluor-546 mærkning af PV og Argon 488 eller 515 nm for Venus / YFP).
- Tag billeder på et passende Z-opløsning (typisk 0,5-1 um trin ved hjælp af en 20X objektiv) til fremstilling af en Z-stak af hele cellen. Flere stakke normalt kræves for at billedet hele cellen, som kan digitalt sys off-line ved hjælp FIJI / ImageJ software (figur 5A).
- Rekonstruere cellen fra den syet billedstak ved hjælp af en semi-automatisk sporing metode (Simpelt neurite Tracer plugin i Fiji / ImageJ softwarepakke 17, figur C).
- Endelig vurdere PV-immunoreaktivitet af interneuron med en høj numerisk blænde objektiv (60X silicium-fordybelse, NA = 1,3). Gør billeder af Soma, proksimale dendritter og proksimale Axon, eller alternativt af axonterminaler hvis somatisk udvaskning af PV er for stærk. Celler anses immunreaktiv til PV, hvis der ses immuno-mærkning at tilpasse med biocytin-mærkede strukturer (figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forudsat at skive kvalitet er mærkbart god optagelse fra både CA1 pc'er og FS-ins kan opnås med minimal besvær. Det transgene rotte linje udtrykker Venus / YFP under vGAT promotoren 13 ikke entydigt identificere FS-ins, eller endog BCS. Men optagelser fra INs i og omkring str. pyramidale, hvor tætheden af FS-ins er typisk høj 1, resulterer i en stor sandsynlighed for at vælge FS-ins (figur 2B). FS-ins kan skelnes ved deres karakteristiske fysiologiske egenskaber er forskellige fra dem af både CA1- pc'er og RS-ins. De har en forholdsvis depolariseret hvilende membranpotentiale (-58,9 ± 1,5 mV, 15 celler, versus -62,6 ± 1,1 mV i CA1 pc'er, 26 celler), lavt input modstand (92 ± 12 MOhm vs 103 ± 14 MOhm i pc'er) og hurtig tilsyneladende membran tidskonstant (15,4 ± 2,6 msek vs 22,0 ± 2,7 msek i pc'er), resulTing i hurtig spænding reaktion på hyperpolarisere strømpulser (Figur 2F). FS-Ins afladet meget korte virkningspotentialer (0,38 ± 0,01 ms) med relativt lav amplitude (82,8 ± 1,0 mV) efterfulgt af meget fremtrædende hurtigt afterhyperpolarization (gennemsnitlig amplitude 22,6 ± 2,9 mV). Som svar på stort depolariserende strømimpulser (250 Pa), FS-Ins fyret ved høje frekvenser (82 ± 10 Hz Rækkevidde: 34-128 Hz figur 2D, venstre).
For at vurdere GABA B R-medieret postsynaptiske strømninger i FS-ins blev farmakologisk isolerede synaptiske reaktioner fremkaldt af ekstracellulær stimulering af hæmmende fibre på str. radiatum / lacunosum-moleculare grænse. Figur 3 viser et eksempel på en FS-IN, hvor sekventiel blokade af bestanddelene af det sammensatte synaptisk reaktion isolerer monosynaptisk GABAB R-medieret langsom IPSC. Synaptiske reaktioner var eliciteret af enkelte stimuli eller tog på 3-5 stimuli (50 V intensitet, 0,1 ms varighed, leveret ved 200 Hz) til str. lacunosum-moleculare / radiatum grænse (figur 3A). Den oprindelige sammensatte reaktion herunder både excitatoriske og hæmmende komponenter (figur 3C, øverst) var stærkt reduceret med bad anvendelse af AMPA og NMDA-receptorantagonister (DNQX, 10 um og AP-5, 50 uM, henholdsvis figur 3C, midten). Den resterende monosynaptiske IPSC omfattede en tidlig hurtig indadgående strøm (en formodet indad CL - Mediated strøm på bedriften potentiale -65 mV, med en vending potentiale på ca -60 mV i disse eksperimenter) og en langsommere udadgående strøm (medieret af et formodet K + konduktans med en vending potentiel tæt på 100 mV). Anvendelse af selektive GABA A R antagonist gabazine (SR-95531, 10 uM) afskaffede hurtige IPSC, hvilket giver enisoleret langsom GABAB R-medieret IPSC (figur 3C, bund, sort spor); der blev observeret som respons på en enkelt stimulering, men mere tydeligt i reaktion på korte tog af stimuli. Dette svar blev bekræftet som en GABA-B R-aktiverede K + konduktans, som det blev blokeret af potent og selektiv antagonist CGP-55845 (CGP, 5 uM, figur 3C, bund, grå trace). FS BCS typisk vise stor amplitude GABAB R-medierede IPSCs, såsom vist i vores nylige publikation 12.
For at vurdere præsynaptiske regulering af FS-IN hæmmende effekt af GABA B-R'er blev parrede optagelser udføres fra synaptisk koblede FS-in og CA1 pc'er. Synaptic forbindelse mellem FS BCS og CA1 pc'er er relativt høj, som vist tidligere 1,3. I disse optagelser, som vist tidligere, kobling sandsynlighed er over 50% mellem nært beliggende celle par (≤50 um;
Når en optagelse var afsluttet, en uden-ud plaster held dannet blev udsnittene fikseret natten over og derefter behandlet til at visualisere og analysere morfologien af de optagede celler og bestemme deres neurokemiske markør indhold. 5A illustrerer morfologi af en repræsentant FS BC i en fremskrivning af kombinerede billedstakke opnået på en konfokal mikroskop. Cellens ekspression af PV blev bekræftet i immunocytokemisk mærkning, som gav et klart immuno-signal over cellen kroppen og proksimale dendritter i den registreres og biocytin-mærket celle (figur 5B). Tre-dimensionel rekonstruktion af cellen blev udført fra sys billedstakke hjælp af Simpel neurite Tracer plugin i Fiji-software (figur 5C) 17. Axon viste en høj tæthed af sikkerheder i og nær str. pyramidale med &# 8220; kurve "dannes omkring somata af CA1 pc'er (figur 5A, indsat), formodentlig identificere denne celle som en BC. Endvidere lokaliseringen af soma nær str. pyramidale og de radialt orienterede dendritter spænder alle lag af CA1 svarer godt til den typiske morfologiske træk FS BCS 10.
Sammenfattende i helcelle-optagelser opnået fra identificerede FS PV + BCS, har vi vist, at disse celler udtrykker stor amplitude GABAB R-medieret langsomme IPSCs og deres synaptiske output er også markant inhiberes ved aktivering af præsynaptiske GABAB Rs.
Figur 1. Forberedelse af akutte hippocampusskiver. (A) en frisk dissekeret rottehjerne. Bemærk isen omgiver hjernen, vedligeholdelsetemperaturen af hele hjernen i nærheden af 0 ° C. (B) Skæring af 300 um hippocampale skiver på et Leica VT1200s vibratom. De halvkugler er justeret, således at den kortikale overflade skæres først. Bemærk den store mængde af sjappet is omgiver halvkugler og konstant carbogenation af iskolde ACSF (pil). (C) Efter at skære hjerneskiver flyttes til opvarmet saccharose-ACSF. Skiverne blev vendt og trimmet til at fjerne forhjernen og midthjernen, så kun hippocampus og overliggende cortex.
Figur 2. Hel-celle patch-clamp optagelse fra interneuroner. (A) Optagelsen konfigurationen omkring kammeret. Bemærk tilgang og afgang er på modstående sider af kammeret for at opnå en tæt på laminar strømning. Også synlige er RECORDIng elektroder, monteret på headstages, og jordelektroder på de to sider, samt målsætningen (40X, vand-vand) i midten. (B) Energibesparende epifluorescerende billede af vGAT-Venus / YFP signal i CA1 i hippocampus i et udsnit. (C) IR-DIC-billeddannelse af det samme område. Pilene i B og C angiver en Venus / YFP positiv interneuron i cellen kroppen lag. (D) High-power IR-DIC billeder af soma af neuron angivet i panel B, med en nærmer patch pipette danner smilehul på overflade (øverst) og efterfølgende cellen i hel-celle konfiguration (nederst). (E) Skematisk illustration af de vigtigste trin i oprettelse af en hel-celle patch-clamp optagelse (venstre side) med tegneserie svar på en test spænding -pulse overvåge modstanden ved pipettespidsen (højre side). Øverste række: Pipette i badet væk fra cellen; Øvre middelklasse: Dimple dannelse, ledsaget af enreduktion i pulsamplitude, hvilket indikerer en moderat stigning i resistens. Lavere middelklasse: Giga-ohm tætning dannelse. Bemærk, at den aktuelle pulsamplitude drastisk reduceret. Kun de hurtige kapacitive strømme er synlige ved begyndelsen og slutningen af pulsen inden pipette kapacitans kompenseres. Nederst: Whole-celle optagelse konfiguration opnås ved at bryde gennem membranen patch under pipettespidsen. Bemærk, at de store, men relativt langsomme kapacitive strømme i begyndelsen og slutningen af pulsen før serie modstand kompensation bliver anvendt. (F) Repræsentative spor af en FS-IND (øverst) og CA1 PC (nederst), fremkaldt af en familie af hyper - at depolariserende strømpulser (protokol vist ovenfor). Bemærk frekvensen udledning af FS-IN meget højt i forhold til den meget langsommere affyring af CA1 pc. Mellemværker til højre: Sammenligning af AP bølgeform fra CA1 PC (øverst) og FS-IN (nederst, i grå, overlejres på pc'en AP i sort), der illustrerer difference i bølgeformen af AP og AHP.
Figur 3. Farmakologisk dissektion af forbindelsen synaptisk respons isolering langsomme GABAB R-medieret IPSCs i en FS-IN. (A) IR-DIC billede af skive i optagelsen kammer, med optagelsen elektrode (plaster) placeret ved grænsen til str. Oriens (Ori.) og pyramidale (Pyr.) og simulering elektrode (Stim) ved grænsen til str. radiatum (. Rad) og lacunosum-moleculare (LM) (B) Venstre:. Skematisk illustration af optagelsen konfiguration. Højre: Indlagt spænding reaktioner i FS-IN fremkaldt af en familie af hyper at depolariserende nuværende injektioner (C) Repræsentative spor optaget fra FS-IN reaktion på ekstracellulær stimulering.. Top: Forbindelsensynaptisk respons produceret i normal ACSF fremkaldt af en enkelt stimulus (50 V-intensitet, 0,1 ms varighed). Middle øvre: Isoleret monosynaptiske IPSC efter bad anvendelse af DNQX (10 uM) og d-AP-5 (50 uM). Midt lavere: De hurtige monosynaptisk IPSCs blokeres efter tilsætning af gabazine (10 uM) til badet. Nederst: Et tog af 5 stimuli (ved 200 Hz) afslører en langsom GABA B R medieret IPSC (sort trace), som er blokeret af efterfølgende påføring af CGP (5 uM) til badet (overlejret grå trace).
Figur 4. Analyse af præsynaptiske modulation af hæmmende synaptisk transmission i en parret optagelse fra en koblet FS-IN og CA1 PC par. (A) Venstre panel: IR-DIC billede af de to optagelser pipetter, den venstre lappet på FS-IN ved grænsen til < em> Str. Oriens (Ori). og pyramidale (Pyr.) og retten lappet på en CA1-pc tættere på str. radiatum (Rad.). Højre panel:. En skematisk af optagelsen konfiguration med repræsentative spænding svar fra FS-IN (venstre) og CA1 PC (til højre) til en familie af strømpulser (B) Repræsentative spor, der viser de AP'er fremkaldt i de præsynaptiske FS-IN (øverst) og den korte ventetid enhedsstat IPSC i CA1- PC (nederst) under kontrol betingelser (spor på venstre), efter bad anvendelsen af baclofen (10 um, midten), og den efterfølgende anvendelse af CGP (5 uM, højre) . Bemærk, at baclofen reducerede IPSC amplituden med ~ 50%, mens CGP resulterede i en næsten fuld tilbagebetaling af IPSC amplitude. Kontrolforanstaltninger spor er vist underlain. (C) Tidsforløb plot af IPSC amplitude viser virkningen af baclofen og CGP. IPSCs blev registreret ved 10 sec intervaller.
Figur 5. Visualisering, genopbygning og immuncytokemisk identifikation af en biocytin-mærket indspillede FS-BC. (A) En fremskrivning af sys stakke af billeder af en FS-IN afbildet med en 20X objektiv på et konfokalt mikroskop. Den somata er placeret på grænsen af str. radiatum (Rad). og pyramidale (Pyr.) i CA1-området, dendritter løber radialt og dækker alle lag, mens de fleste Axon findes i og omkring cellen hovedlaget; som typisk for BCS. Målestok: 100 um. Indsat, øverst til højre: høj forstørrelse fremskrivning af en 20 lag, der viser typiske kurve af Axon danner omkring formodede CA1 PC Somata (Orange asterisker). Målestokken:. 10 um (B) biocytin fyldt celle krop IN (hvid pseudocolour, nederste panel, pil) viser immunoreaktivitet for PV (i grøn, øverste panel). Scalebar:. 20 um (C) projektion af 3-dimensionelle rekonstruktion af cellen. Soma og dendritter er i sort og Axon farvet rød. Lag af CA1, er afgrænset i blåt. Forkortelser: Ori, str. Oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Målestok: 100 um.
| Navn | Sammensætning (mM) | Brug | Bemærkninger |
| Saccharose-ACSF | 87 NaCI, 2,5 KCI, 25 NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucose, 75 sucrose, 7 MgCI2, 0,5 CaCl2, 1 Na-pyruvat, 1 Na-ascorbat | Tilberedning og opbevaring af hjerneskiver | pH = 7,4; osmolaritet = ~ 350 mOsm |
| Optagelse ACSF | 125 NaCI, 2,5 KCI, 25 NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucose, 1 MgCI | Optagelse fra hjerneskiver | pH = 7,4; osmolaritet = 310-315 mOsm |
| Intracellulær opløsning (1) | 125 K-gluconat, 10 KCI, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-phosphocreatin og 0,1% biocytin | Påfyldning elektroder af GABAB IPSC optagelser | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Intracellulær opløsning (2) | 105 K-gluconat, 40 KCI, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-phosphocreatin og 0,1% biocytin | Påfyldning elektroder til parrede optagelser | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Fosfatbuffer () | 100 mM NaH 2 PO4 | Skylning faste skiver | pH = 7,4 |
| Phosphatbufret saltvand (PBS) | 25 mM NaH 2PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCI (0,9% w / v) | Skylning faste skiver og antistof inkubation | pH = 7,4 |
| Paraformaldehyd fiksativ | 4% w / v paraformaldehyd, 0,1 mM PB | Fiksering af hjerneskiver | pH = 7,4 |
Tabel 1. Opløsninger listen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode, som kombinerer elektrofysiologiske og neuroanatomiske teknikker til at funktionelt karakterisere morphologically- og neurochemically identificerede neuroner in vitro; især de forskellige typer af kortikale hæmmende ins. Vigtige aspekter af proceduren er: (1) forudgående udvælgelse af potentielle INs; (2) intracellulære optagelse og neuron visualisering; og endelig (3) morfologisk og immuncytokemisk analyse af optagne ins. Selv om denne undersøgelse har behandlet PV-Ins i særdeleshed, kan den beskrevne protokol anvendes til lignende optagelser fra enhver interneuron eller andre neuronale typer med minimal ændring.
Det forholdsvis lave antal interneuroner i kortikale områder gør tilfældig udvælgelse og optagelse fra disse celler yderst ineffektive. Divergerende lokalisering og morfologiske træk har gjort det muligt for forskerne at skelne og rutinemæssigt optage fra nogle Interneuron typer. Men i skiver, identifikation af praktikanteurons i og nær cellelegemet lag fortsat vanskelig, såsom med FS-ins. Fremkomsten af transgene mus linjer, der udtrykker de fluorescerende proteiner i specifikke Interneuron populationer tilbyder en elegant løsning, som gør præ-udvælgelse og registrering af disse neuroner langt mere effektive 2. Nu er mange transgene linjer, hovedsagelig mus, men i stigende grad også rotter 13 er til rådighed, lette efterforskningen af interneuroner. Ved brug af transgene linier, er det imidlertid vigtigt at fastslå omfanget og specificitet reporter udtryk.
Kvaliteten af cellulær mærkning og morfologi, samt elektrofysiologiske optagelse, kritisk afhængige af levedygtige, høje skiver kvalitet; for hvilke der skal hurtigt dissekeret (ideelt 20-40 sek), håndteres meget forsigtigt og kontinuerligt kølet hjernen. Vi finder, at anvendelse af saccharose-ACSF, hvorved den samlede natrium-koncentration og således excitabilitet af neuroner er reduceret, dramatisk forbedrer kvaliteten af det udsnit og interneuron overlevelse 18. Dog skal det fremhæves, at mange forskere har gjort brug af standard optagelse ACSF til skive forberedelse, med stor effekt 10,11,15. Morfologisk integritet er meget afhængig af den vinkel, hvor skiver skæres 13; som varierer fra region til region og celletype. Dog kan mange interneuroner opgøres pålideligt fra tværgående, koronale eller sagittale skiver. For yderligere at minimere løsrivelse af dendritter og axon, celler dybere i vævet bør målrettede, men at ofre IR-DIC kvaliteten og pålideligheden af giga-ohm tætning dannelse. Under disse omstændigheder optagelser fra både CA1 pyramideformede celler og FS-ins kan pålideligt opnås.
Mærkning og visualisering af neuroner opnås efter en typisk optagelse session varer 30 minutter eller længere. Hvis optagelser vare mindre end 30 minutter, er det nødvendigt at tillade denne gang før fiksering at aktivere biocytin at diffundere ind distale dendritiske og axonale processer, der sikrer fuldstændig fyldning og dermed post-hoc visualisering af celler.
I hel-celle optagelser, er bydende nødvendigt at nøjagtig fysiologiske målinger af synaptiske og iboende egenskaber, samt grundig mærkning af neuroner fastholde en lav og stabil serie modstande. Men lavresistente elektroder tillade hurtig dialyse af cytoplasma med den intracellulære opløsning indeholdt i pipetten. Supplering af intracellulære løsning med ATP, GTP og phosphocreatin sikkert hjælper til at opretholde energiforsyningen og optagekvalitet. Dog kan dialyse af neurochemicals og proteiner føre til mindre reaktioner, nedsat plasticitet 19 og kan også hæmme neurokemiske identifikation. For eksempel PV konsekvent vaskes ud af neuroner i løbet af længere eksperimenter. Derfor kan det være nødvendigt undersøgelse af distale dendritiske eller aksonale processer til Dete rmine immunreaktivitet af det optagede neuron. I sådanne tilfælde, hvor en sådan Dialyse er en bekymring, optagelser med perforeret-patch konfiguration kan udnyttes til at bevare det intracellulære miljø 20, men patchen skal brydes i slutningen af optagelser eller neuron efterfølgende "repatched" i hel-celle konfiguration at tillade biocytin påfyldning.
Farmakologisk undersøgelse af indspillede neuroner er en nyttig metode til at vurdere den funktionelle betydning af divergerende neuromodulatory mekanismer i udformningen af den iboende og synaptisk aktivitet ins. I de ovenfor beskrevne metoder, er farmakologisk isolation og parrede optagelser anvendes til at vurdere post-og præsynaptisk GABAB R-medierede virkninger, henholdsvis; dog kan man let modificere kombinationen af receptoragonister og antagonister til at vurdere rollen af alternative receptor familier, f.eks cannabinoid systemet 21.
"> Histologisk og immuncytokemiske behandling af optagede celler er yderst pålidelig, når protokoller er etableret. Den immuncytokemi protokollen beskrevet her er blevet indstillet med hensyn til kombinationen af antistoffer anvendes, snittykkelse og kravet om at identificere det neurokemiske indhold. Vi udnytter normalt gedeserum som alle sekundære anvendte antistoffer er rejst i ged. Som alternativ er det også muligt at anvende bovint serumalbumin (BSA) eller mælkepulver som blokeringsmidler. Det skal bemærkes, at denne protokol anvender phosphatpufret saltvand (PBS) for antistof inkubering men alternativt kunne blot bruge 0,1 M PB i stedet for PBS. hjælp af en relativt høj koncentration af detergent (0,3% Triton X-100), ikke formindsker tilsyneladende antigenicitet, samtidig med at indtrængning af antistoffer i de første 100 um overfladelag af skive , hvor neuroner rutinemæssigt registreres. Hvis dybere celler registreres, eller skiverne er tykkere, er det tilrådeligt at resectipå skiverne ved hjælp af en kryostat eller en vibratom og udføre immunmærkning på de tynde (40-70 um) sektioner. For 300 um skiver, en lang inkubation af antistofferne (til ved 4 * C bevare den strukturelle integritet af skiver) producerer meget pålidelige immunocytokemiske resultater.Identifikation af neuroner afhængig af kombinerede oplysninger indhentet i optagelsen, det post-hoc morfologisk og immunocytokemiske analyse. I hippocampus, på grund af strenge laminare organisation, axonal fordeling er en god indikator for den postsynaptiske mål for interneuroner. Severed Axon eller dendritter kan dog gøre det vanskeligt at identificere eller umulig. Desuden er en vis tvetydighed, for eksempel i at differentiere PV + BCS og AXO-axonic interneuroner, på grund af ligheden i den samlede axonal lokalisering. En endelig definitiv identifikation ville kræve elektronmikroskopisk analyse af postsynaptiske mål 1,3 or yderligere immuncytokemiske dissektion 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Ina Wolter for hendes fremragende teknisk bistand. VGAT-Venus transgene rotter blev genereret af Drs. Y. Yanagawa M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i nationale institut for Fysiologiske Sciences, Okazaki, Japan, ved hjælp pCS2-Venus leveret af Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
