Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Published: September 30, 2014 doi: 10.3791/51706
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Integrative Neuroanatomy, NeuroCure Cluster of Excellence, Charité Universitätmedizin

Summary

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Abstract

GABAergische remmende interneuronen spelen een centrale rol in neuronale circuits van de hersenen. Interneuronen omvatten een klein deel van de neuronale populatie (10-20%), maar vertonen een hoge mate van fysiologische, morfologische en neurochemische heterogeniteit, als gevolg van hun verschillende functies. Daarom is onderzoek naar interneuronen biedt belangrijke inzichten in de organisatie principes en de functie van neuronale circuits. Dit vereist echter een geïntegreerde fysiologische en neuroanatomisch benadering voor de selectie en identificatie van individuele types interneuron. Whole-cell patch-clamp opnamen van acute hersenen plakjes van transgene dieren, de uiting van fluorescerende eiwitten onder de initiatiefnemers van interneuron-specifieke markers, biedt een efficiënte methode te richten en elektrofysiologisch karakteriseren intrinsieke en synaptische eigenschappen van specifieke soorten interneuron. Gecombineerd met intracellulaire kleurstof etikettering, kan deze aanpak worden uitgebreid met post-hoc-morphological en immunocytochemische analyse, waardoor de systematische identificatie van de geregistreerde neuronen. Deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan een breed scala van wetenschappelijke vragen betreffende functionele eigenschappen van diverse soorten corticale neuronen te passen.

Introduction

Hippocampale neuronale circuits zijn al lange tijd het onderwerp van intensief onderzoek, zowel met betrekking tot de anatomie en fysiologie, als gevolg van hun essentiële rol bij leren en geheugen en ruimtelijke navigatie in zowel mensen als knaagdieren. Ook de prominente, maar eenvoudige laminaire organisatie van de hippocampus maakt deze regio een geliefd onderwerp van onderzoeken naar structurele en functionele eigenschappen van de corticale netwerken.

Hippocampale circuits bestaan ​​uit prikkelende OG cellen (> 80%) en een kleinere (10-20%), maar zeer divers cohort van remmende interneuronen 1-3. Interneuronen laat γ-aminoboterzuur (GABA) vanaf het axon terminals die optreedt bij hoge ionotrope GABA A-receptoren (GABA A ±) en langzame metabotrope GABA B-receptoren (GABA B Rs) 4. Deze remmende mechanismen compenseren excitatie en reguleren van de prikkelbaarheid voornaamste cellen, en dus deir timing en het patroon van de lozing. Echter, GABA model van interneuronen werkt niet alleen OG cellen, maar ook van de interneuronen zelf 5,6. Pre-en postsynaptische receptoren bemiddelen feedback regulatie en remmende onderlinge interacties tussen de verschillende soorten interneuron. Deze remmende mechanismen in interneuron netwerken worden verondersteld centraal in de opwekking en de vormgeving van de bevolking activiteitspatronen, met name oscillaties om bij verschillende frequenties 7.

Whole-cell patch-clamp opname is een bekende methode voor het onderzoek van de intrinsieke eigenschappen en synaptische interacties van neuronen. Vanwege de grote diversiteit van interneuronen, onderzoek remmende interneuronen vereist strikte identificatie van de opgenomen cellen. Zoals hippocampus types interneuron worden gekenmerkt door duidelijke morfologische kenmerken en neurochemische markerexpressie, gecombineerd anatomische en immunocytochemische eNALYSE kan een middel zijn om precieze interneuron identiteit 6,8,9 te bepalen.

In dit artikel beschrijven we een experimentele benadering waarin whole-cell patch-clamp opnamen van enkelvoudige neuronen of synaptisch-gekoppelde paren gecombineerd met intracellulaire labeling, gevolgd door post-hoc morfologische en immunocytochemische analyse, waardoor de karakterisering van langzame GABA B receptor gemedieerde remmende effecten in geïdentificeerd interneuronen. Als voorbeeld, richten we ons op een groot type interneuron, een deelverzameling van de zogenaamde "basket cellen" (BC), die de soma en proximale dendrieten van de postsynaptische targets innerveert en wordt gekenmerkt door een "snelle spiking" (FS) sproeipatroon, een axon dicht die het cellichaam laag en expressie van de calcium bindend eiwit parvalbumin (PV) 10,11. Deze interneuronen tonen grote remmende postsynaptische stromingen, alsmede prominente presynaptische modulatie van hun synaptische productie, in reactie op GABA B R activering 12. De combinatie van technieken die hier beschreven kan evengoed worden toegepast op intrinsieke of synaptische mechanismen in een verscheidenheid van andere types geïdentificeerde neuron onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethische Verklaring: Alle procedures en dierlijke onderhoud werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, de Duitse wet op de dierenbescherming, de Europese Richtlijn 86/609 / EEG van de Raad betreffende de bescherming van dieren, en de richtlijnen van de lokale autoriteiten (Berlijn, T-0215/11 )

1 Voorbereiding van de Acute-hippocampus Slices

  1. Neem een transgeen rat (17 tot 24 dagen oud), de uiting van de fluorescerende Venus / YFP eiwit onder de vGAT promotor, die de meerderheid van de corticale remmende interneuronen 13 etiketten. Onthoofden de rat. Snel ontleden de hersenen (<40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) sucrose gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF sucrose-figuur 1A).
  2. Beoordeel de ontleed hersenen van de rat voor Venus / YFP fluorescentie met een 505 nm LED-lamp en 515 emissie filter, gemonteerd op een bril.
  3. Verwijder het voorste derde van de cortex en Cerebellum; Vervolgens scheiden de hemisferen, allemaal met een scalpel. Verwijder het dorsale oppervlak van de cortex naar een vlakke ondergrond om de hersenen te lijmen bieden, zoals eerder beschreven 14.
  4. Snijd dwarse plakjes (300 micrometer) van de hippocampus formatie op een vibratome, moet de hemisferen worden omringd met semifrozen, carbogenated sucrose-ACSF (Figuur 1B) 14. Verwijder de extra gebieden van rostrale cortex, middenhersenen en hersenstam. Transfer elk plakje een ondergedompelde bedrijf kamer met sucrose-ACSF, die wordt carbogenated en opgewarmd tot 35 ° C.
  5. Laat de plakjes te herstellen bij 35 ° C gedurende 30 minuten vanaf het tijdstip van de laatste snede die het verwarmd ACSF. Doe dit met het oog op de metabole processen te reactiveren en het opnieuw afdichten van gesneden neuronale processen te faciliteren. Vervolgens transfer naar kamertemperatuur opslag (Figuur 1C).

2 Fabrication en vullen van opname Pipettes

  1. Pull patch pipetten van glazen capillairen, zodat een pipet weerstand van 2-4 MQ wordt bereikt wanneer gevuld met gefilterd (spuitfilter, poriegrootte: 0,2 urn) intracellulaire oplossing die 0,1% biocytine (voor intracellulaire labeling). Houd de intracellulaire oplossing gekoeld op ijs om afbraak van de bestanddelen te voorkomen.
  2. Vul patch pipetten voor de identificatie van postsynaptische stroom met een oplossing die een fysiologisch relevant lage Cl - concentratie (E R (Cl) = -61 mV zie oplossing lijst).
  3. Voor opnamen gekoppeld aan de presynaptische receptor gemedieerde responsen te identificeren, vul patch pipetten met intracellulaire oplossing met lage Ca2 + buffercapaciteit om interferentie met generatoraanspreektemperatuur presynaptisch voorkomen, alsmede 4-voudig hogere Cl - concentratie (E R (Cl) = -20 mV) aan signaal-ruis waargenomen IPSCs 5 waardoor nauwkeurige vaststelling van de farmacologische resp verbeterenonsiveness. Merk op dat het veranderen van Cl - concentratie IPSC kinetiek 15 kan veranderen.

3 Whole Cell Patch-clamp-opname van FS-ins

  1. Carbogenate de ACSF en diervoeders via het perfusie systeem de opname kamer door middel van een peristaltische pomp (die ook verwijderd ACSF van de opname kamer via een zuigleiding figuur 2A). Zet alle apparatuur op de setup in de voorbereiding op de opname.
  2. Transfer een stukje aan de opname kamer en op zijn plaats houden met een platina ring bespannen met enkele vezels van zijde. Plaats het segment waardoor het stratum (str.) Van CA1 pyramidale loopt verticaal door het gezichtsveld toegang geven met 2 pipetten zowel de str. radiatum en str. oriens gelijktijdig (Figuren 2C en 4A).
  3. Plaats de kamer in de setup en beginnen perfusie van carbogenated en verwarmd (32-34 ° C) het opnemen van eenCSF met een stroomsnelheid van 5-10 ml / min.
  4. Beoordelen slice kwaliteit onder IR-DIC optiek bij 40X objectieve vergroting, en visualiseren met een CCD-camera weergegeven op een display. Veronderstel goede slice kwaliteit als een groot aantal ronde, matig contrast CA1 pyramidale cellen (CA1 PC) is te zien in str. pyramidale op een diepte van 20-30 micrometer onder een glad en licht bekraterd oppervlak (figuur 2C). Slechte kwaliteit schijfjes bevatten grote aantallen hoog contrast, gekrompen of gezwollen cellen, met een oneffen oppervlak slice.
  5. Identificeer vermoedelijke FS interneuronen onder epifluorescentie verlichting als die tot expressie Venus / YFP (figuur 2B), met grote multipolaire somata in of nabij het ​​str. pyramidale. Selecteer cellen redelijk diep in de slice (50-100 urn, figuur 2C) om hun morfologische integriteit beter behouden.
  6. Monteer de registratie-elektrode in de pipet houder op de headstage; dan apply een lage positieve druk (20-30 mbar) door de buis lijn. Laat de pipet om het oppervlak van het deel, enigszins af naar het midden van de geselecteerde neuron.
  7. Verkrijgen whole-cell opname configuratie zoals eerder beschreven 14,16 en zie ook de figuren 2D en 2E:
    1. Richten zich op een cel: Verhoog de ​​druk tot 70-80 mBar en snel te doen dalen de pipet door het schijfje tot net boven de soma van de geselecteerde cel (figuur 2D, boven).
    2. Benader de cel: Druk op de pipet tegen de celmembraan het produceren van een 'kuiltje' op het (figuur 2D, boven). Voer deze stap snel, teneinde biocytine etikettering van naburige cellen te voorkomen.
    3. Maak een zegel giga-ohm: Laat de druk en gelijktijdig toepassen van een 20 mV spanning commando om de pipet. Een zegel giga-ohm (1-50 GQ Figuur 2D, bodem en figuur 2E midden) typicbondgenoot ontwikkelt zich snel. Eenmaal afgesloten, de verwachte rust membraanpotentiaal (typisch tussen -70 en -60 mV) toegepast als een spanning opdracht.
    4. Doorbreken van de patch: Eenmaal afgesloten, scheuren het membraan patch met een korte puls van negatieve druk; waardoor het whole-cell configuratie (figuur 2E, onder) bereiken.
  8. Compenseren whole-cell capaciteit en serie weerstand (R S). Rs is gewoonlijk 5-20 MQ en stabiel tot 120 minuten. Abandon cellen als membraan potentiaal (V M) op doorbraak is meer gedepolariseerde dan -50 mV; R S aanvankelijk groter dan 30 MQ; of R S wijziging van meer dan 20% in de loop van de opname.
  9. Identificeer FS-ins door hun reactie (in de huidige-clamp-modus) tot een familie van hyper naar stroompulsen depolariserende (-250 tot +250 pA, figuur 2F, boven). FS-ins zijn relatief gedepolariseerd V M (meestal -50 to -60 mV), korte membraan tijd-constante (<20 ms) en te reageren op een 500 Pa depolariserende stroom injectie met een trein van actiepotentialen (AP's) bij frequenties> 100 Hz 11 (figuur 2F, bodem), die duidelijk zijn verschillen van die in CA1 pc's (figuur 2F, midden).

4 extracellulaire elektrische stimulatie aan GABA B R-gemedieerde reacties Evoke

  1. Om synaptically reacties van de consument in acht te nemen, plaatst u een extracellulaire stimulatie-elektrode (een patch pipet gevuld met 2 M NaCl; Resistance: 0,1-0,3 MQ) in de slice op de grens van str. radiatum en str. lacunosum-moleculare. Plaats de elektrode 200-300 urn lateraal van de soma directe elektrische stimulering van de cel voorkomen en minimaliseren stimulatie artefacten (Figuur 3A).
  2. Nadat de stimulatie-elektrode is gepositioneerd verkrijgen whole-cell registratie vande gekozen cel en beoordeelt de fysiologische fenotype in de huidige-clamp-modus als in paragraaf 3.9 (figuur 3B).
  3. Met de neuron opgenomen in voltage-clamp (V M -65 mV), leveren elektrische stimulatie van presynaptische axonen bij 50 V (~ 500 uA effectieve stimulus) elke 20 seconden, met een geïsoleerd constante spanning stimulator. Gebruik enkele stimuli (100 msec duur, figuur 3C, boven) om GABA B R gemedieerde IPSCs observeren, en elkaar mogen treinen van verschillende stimuli (bij 200 Hz) tot een grotere afgifte van transmitter produceren.
  4. Bad gelden ionotropic glutamaatreceptorantagonisten (AMPA receptor: DNQX [10 uM]; NMDA receptor: d-AP5 [50 uM]) om de geïsoleerde monosynaptic IPSC (Figuur 3C, midden boven) te onthullen. Verder isoleren het GABA B-R gemedieerde IPSC met toepassing van een GABA A R blokker (gabazine [10 uM] Figuur 3C middle lower).
  5. Bevestig de resulterende langzaam naar buiten stroom (Figuur 3C lager, uitgebreid) als zijnde GABA B R-gemedieerd door de latere toepassing van CGP-55845 [5 uM] (Figuur 3C lager, underlain in grijs)

5 Gekoppelde Opnamen van synaptically Coupled FS-IN en CA1 pc

  1. Beoordelen GABA B-R gemedieerde presynaptische controle remmende synaptische transmissie met gelijktijdige opnames, uitgevoerd tussen synaptisch-gekoppelde IN en PC paren zoals hieronder beschreven.
  2. Eerste, de oprichting van een whole-cell opname van een presynaptische interneuron (zoals beschreven in hoofdstuk 3) en bevestig de FS fenotype (Figuur 4A).
  3. Patch dan een naburige CA1 PC (20-100 micrometer afstand, figuur 4A) en korte bovendrempelige depolariserende stroom pulsen (1 msec duur, 1-5 nA amplitude) aan de presynaptische IN (gehouden in de huidige-clamp-modus) om AP's te lokken passen. Als een synaptisch coAansluitingen aanwezig, AP in de IN resultaat in IPSCs in het CA1 PC, gehouden in voltage-clamp (compenseren R S tot ongeveer 80%).
  4. Vul zonodig een nieuwe registratie-elektrode en opnemen van verdere CA1 computers tot een verbinding is gevonden.
  5. Zodra een verbinding is gemaakt, wekken paren AP in de presynaptische FS-IN zowel de unitaire synaptische respons en dynamisch rijgedrag. Gebruik een typisch gepaarde-pulse-protocol van 2 depolariserende stimuli met een 50 msec interval (Figuur 4B).
  6. Verzamel controle sporen in uitgangssituatie. Breng daarna de selectieve GABA B R agonist baclofen (10 uM) aan het perfuseren ACSF, waardoor GABA B Rs, gevolgd door de antagonist CGP-55.845 (5 uM) activeren van de receptor gemedieerde effecten volledig blokkeren. Verzamel ~ 50 sporen tijdens steady state toestand van elk geneesmiddel (Figuur 4B en C).
  7. Nadat de opname is voltooid, sluit de somatische membraan door het vormen van een buitee-out patch: Zuig langzaam de pipet uit de cel lichaam in V-klem en als de R S toeneemt, verminderen de V M tot -40 mV. Doe dit tot de vorming van de outside-out patch te vergemakkelijken; verwijder vervolgens de pipet uit het bad.

6 Analyse van de elektrofysiologische eigenschappen

  1. OPMERKING: Een veelheid van verschillende software pakketten zijn beschikbaar voor de aankoop van elektrofysiologische gegevens. Hier, WinWCP, een Windows-programma in de vrije Strathclyde Electrofysiologie software pakket wordt gebruikt, die de opname van maximaal 16 analoge ingangen en uitgangen van de 10 digitale signalen mogelijk maakt.
  2. Laagdoorlaatfilter alle data: 5-10 kHz en monster bij 20 kHz.
  3. Analyseer fysiologische gegevens met een off-line analyse suite.
    OPMERKING: Stimfit, een open source softwarepakket dat een Python shell wordt gebruikt in dit geval omvat; maar andere alternatieven kunnen gemakkelijk worden gebruikt.
    1. Analyseer passief membraan pigenschappen van opgenomen neuronen, verworven in stroomtang, van rust membraanpotentiaal.
    2. Meet de gemiddelde rust membraanpotentiaal van de basislijn van opgenomen antwoorden van het begin van de opname.
    3. Bereken ingangsweerstand, met de wet van Ohm, van de spanning reactie op de kleinste hyperpolarizing stroompulsen (≤ -50 pA). Om signaal-ruisverhouding, average meerdere sporen verbeteren. Let op: onze voorbeelden zijn meestal gemiddelden van 10-50 individuele veegt.
  4. Schat de schijnbare membraantijdsconstante door het aanbrengen van een mono-exponentiële curve aan het verval van de reacties op de kleinste hyperpolarizing stroompulsen.
  5. Analyseer actiepotentiaal golfvorm drempel, amplitude (drempel tot piek) en duur (breedte gemeten op halve hoogte) opgewekt door drempelwaarde depolariserende stroom pulsen te bepalen.
  6. Analyseer GABA B R gemedieerde IPSCs van voltage clamp opnames. Filter sporen off-line op500 Hz (Gaussian filter) en beoordeelt de piek amplitude en latentie van de GABA B R gemedieerde respons (in gemiddelden van ten minste 10 sporen).
  7. Detecteer effect van GABA B Rs op de remmende uitgang van INs als een verandering in de piek amplitude van de GABA A-R gemedieerde IPSCs gemeten tussen piek en voorafgaande baseline. Bereken de gemiddelde amplitude van ≥50 sporen voor de controleperiode en de steady-state van alle farmacologische tijdperken.

7 Visualisatie en Immunocytochemie van FS-Ins

  1. Na de opnamen bevestigen de plakjes door onderdompeling in 4% paraformaldehyde met 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH = 7.35) O / N bij 4 ° C.
  2. Eventueel segmenten kunnen worden overgedragen PB en bewaard tot ~ 1 week voor verwerking.
  3. Wash segmenten vrijelijk in vers PB vervolgens in 0.025 M PB met 0,9% NaCl (PBS, pH = 7.35).
  4. Aan niet-specifiek antilichaam binding verminderen, blokkeren de plakjes for 1 uur bij kamertemperatuur in een oplossing die 10% normaal geit serum (NGS), 0,3% Triton-X100 (een detergens membranen doorlaatbaar) en 0,05% NaN3, opgemaakt in PBS.
  5. Om label voor PV expressie, gebruik een anti-PV monoklonaal muizenantilichaam verdund in een oplossing die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN3 in PBS. Incubeer primaire antilichamen gedurende 2-3 dagen bij 4 ° C 12. Spoel plakjes grondig in PBS.
  6. Breng fluorescent anti-muis secundaire antilichamen (bijvoorbeeld Alexafluor-546.) Samen met de biotine-bindingseiwit streptavidine geconjugeerd aan een fluorochroom (bijvoorbeeld Alexafluor-647); en incuberen in een oplossing die 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN3, verdund in PBS en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
  7. Royaal spoelen plakjes 2-3x met PBS, gevolgd door 2-3 spoelt in PB. Monteer de plakjes op glasplaatjes. Gebruik maken van een 300 micrometer agar spacer om te voorkomen dat de slice instorten. Cover-slip plakjes met een fluoresmontage cent medium en afdichting met nagellak.

8 Imaging en Reconstructie van Visualized FS-Ins

  1. Visualiseer de plakjes met behulp van een scanning confocale microscoop, met de fluorochome verslaggever enthousiast met de juiste laser lijn (diodelaser 635 nm voor Alexafluor-647; Helium-Neon 543 nm voor Alexafluor-546 etikettering voor PV en Argon 488 of 515 nm voor Venus / YFP).
  2. Neem beelden op een geschikte Z-resolutie (gewoonlijk 0,5-1 urn stappen, met een 20X objectief) een Z-stack van de gehele cel produceren. Meerdere stapels zijn normaliter nodig is om het de hele cel, die digitaal kunnen worden gestikt off-line gebruik van FIJI / ImageJ software (Figuur 5A).
  3. Reconstrueren de cel van de samengevoegde foto stack met een semi-automatische tracing methode (Gewone neurieten Tracer plugin in Fiji / ImageJ softwarepakket 17, figuur C).
  4. Tot slot beoordeelt de PV-immunoreactiviteit van de interneuron met een hoge numerieke apertuur objectief (60X silicium-immersie, NA = 1.3). Maak foto's van de soma, proximale dendrieten en proximale axonen, of als alternatief van axon terminals als somatische wash-out van de PV is te sterk. Cellen worden immuunreactieve voor PV beschouwd als immuno-etikettering wordt gezien om af te stemmen met de-biocytine gelabelde structuren (figuur 5B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Op voorwaarde dat stukje kwaliteit is aanzienlijk goed, het opnemen van zowel CA1 pc's en FS-ins kunnen worden bereikt met een minimum aan moeite. De transgene rat lijn uiten Venus / YFP onder de vGAT promotor 13 niet ondubbelzinnig te identificeren FS-ins, of zelfs graad. Echter opnamen van IN's in en rond str. pyramidale, waar de dichtheid van de FS-ins is doorgaans hoog 1, resulteert in een hoge waarschijnlijkheid van FS-ins (Figuur 2B) te selecteren. FS-ins kunnen worden onderscheiden door hun karakteristieke fysiologische eigenschappen verschillen van die van zowel CA1 pc's en RS-ins. Ze hebben een relatief gedepolariseerd rust membraanpotentiaal (-58,9 ± 1,5 mV, 15 cellen versus -62,6 ± 1,1 mV in CA1 PC 26 cellen), lage ingangsweerstand (92 ± 12 MQ versus 103 ± 14 MQ in PCs) en snel duidelijk membraan tijd constant (15,4 ± 2,6 msec versus 22,0 ± 2,7 msec bij PC's), Resulting in snelle spanning reactie op de huidige pulsen (Figuur 2F) hyperpolariserende. FS-ins ontladen zeer korte actiepotentialen (0,38 ± 0,01 msec) van de relatief lage amplitude (82,8 ± 1,0 mV), gevolgd door een zeer prominente snel afterhyperpolarization (gemiddelde amplitude 22,6 ± 2,9 mV). In reactie op de grote depolariserende stroom pulsen (250 Pa), FS-ins ontslagen bij hoge frequenties (82 ± 10 Hz; Bereik: 34-128 Hz; Figuur 2D, links).

Om GABA B-R gemedieerde postsynaptische stromingen in FS-ins te beoordelen, werden farmacologisch geïsoleerde synaptische respons uitgelokt door extracellulaire stimulatie van remmende vezels aan de str. radiatum / lacunosum-moleculare grens. Figuur 3 toont een voorbeeld van een FS-IN, waarbij opeenvolgende blokkade van bestanddelen van het samengestelde synaptische respons isoleert de monosynaptic GABA B-R gemedieerde traag IPSC. Synaptische reacties waren elidoor enkele stimuli of treinen van 3-5 stimuli (50 V intensiteit, 0,1 msec duur, afgeleverd bij 200 Hz) om de str aangehaald. lacunosum-moleculare / radiatum grens (Figuur 3A). De eerste verbinding reactie met inbegrip van zowel prikkelende en remmende componenten (Figuur 3C, boven) werd sterk verminderd door bad toepassing van AMPA en NMDA-receptor-antagonisten (DNQX, 10 uM en AP-5, 50 uM, respectievelijk: Figuur 3C, midden). De resterende monosynaptic IPSC omvatte een vroege snel naar binnen lopende (een vermeende innerlijke Cl - Mediated stroom bij het ​​houden van potentieel -65 mV, met een omkering potentieel van ongeveer -60 mV, in deze experimenten) en een langzamer naar buiten stroom (gemedieerd door een vermeend K + geleidbaarheid met een omkeringspotentiaal dicht bij 100 mV). Toepassing van de selectieve GABA A R antagonist gabazine (SR-95531, 10 uM) schafte de snelle IPSC, waardoor er eengeïsoleerd langzame GABA B-R gemedieerde IPSC (figuur 3C, bodem, zwart spoor); die werd waargenomen in reactie op enkele stimulatie, maar duidelijker in reactie op korte trein van stimuli. Deze respons werd bevestigd als een GABA B-R geactiveerde K + geleidbaarheid, zoals werd geblokkeerd door de krachtige en selectieve antagonist CGP-55.845 (CGP, 5 uM, figuur 3C, bodem, grijs trace). FS graad vertonen doorgaans grote amplitude GABA B-R gemedieerde IPSCs, zoals aangegeven in onze recente publicatie 12.

Om presynaptische regulatie van FS-IN remmende vermogen van GABA B Rs, gepaarde opnames werden uitgevoerd vanaf synaptically gekoppelde FS-IN en CA1 pc's te beoordelen. Synaptische verbindingen tussen FS graad en CA1 pc's is relatief hoog, zoals eerder 1,3 getoond. In deze opnames, zoals eerder aangegeven, de koppeling kans is meer dan 50% tussen de voet gelegen cel paren (≤50 micrometer; 5. Echter sterk afhankelijk van het interneuron onderzochte type. Connectiviteit werd getest met ofwel een lange depolariserende stroominjectie (100 msec, ≥ 500 pA) of een trein van korte pulsen depolariserende (1 msec, 1-5 nA tot 10 pulsen bij 20 Hz) opwekken van een AP elk. AP's in de presynaptische interneuronen ontlokte snel GABA A R-gemedieerde IPSCs met korte latency, snelle opkomst en verval in synaptically gekoppelde pc's. In combinatie-pulsen (2 pulsen bij 20 Hz) werden toegepast, de synaps toonde korte termijn depressie (gepaarde-pulse-ratio <1) 1. In het voorbeeld getoond cel, bath toepassing van de GABA B R agonist baclofen (2-10 uM) leidde tot een aanzienlijke vermindering van de amplitude van de eerste IPSC (Figuren 4B en 4C). Latere bad toepassing van de antagonist CGP-55845 steevast resulteerde in een herstel van de IPSC (5 van de 5 cellen 12 </ Sup>; figuren 4B en 4C).

Als een opname was voltooid, een outside-out patch succes gevormd de plakjes werden vastgesteld nacht en vervolgens verwerkt te visualiseren en analyseren van de morfologie van de cellen opgenomen en kwantificeren neurochemische merker inhoud. Figuur 5A illustreert de morfologie van een vertegenwoordiger FS BC in een projectie Gecombineerd afbeeldingsstapels verkregen met een confocale microscoop. Expressie van PV De cel werd bevestigd in immunocytochemische labeling die een duidelijk immuno-signaal over het cellichaam en dendrieten van proximale gaf de opgenomen en biocytine gemerkte cellen (Figuur 5B). Driedimensionale reconstructie van de cel werd uitgevoerd vanaf gestikt beeld stapels met behulp van de Simple neurieten Tracer plugin in FIJI software (Figuur 5C) 17. Het axon toonde een hoge dichtheid van zekerheden in en nabij het ​​str. pyramidale met &# 8220; manden "gevormd rond de somata van CA1 pc's (Figuur 5A, inzet), vermoedelijk het identificeren van deze cel als een BC. Bovendien, de lokalisatie van de soma nabij str. pyramidale en radiaal georiënteerde dendrieten verspreid over alle lagen van de CA1 komen goed overeen met de typische morfologische eigenschap van FS trimjackets 10.

Samengevat, in whole-cell opnames verkregen geïdentificeerd FS PV + BC's hebben we aangetoond dat deze cellen tot expressie grote amplitude GABA B-R gemedieerde traag IPSCs en hun synaptische uitgang ook aanzienlijk geremd door de activatie van presynaptische GABA B Rs.

Figuur 1
Figuur 1 Voorbereiding van acute hippocampus plakjes. (A) Een vers ontleed hersenen rat. Opmerking ijs rond de hersenen, handhavingde temperatuur van de gehele hersenen dichtbij 0 ° C. (B) snijden van 300 urn hippocampale plakken op een Leica VT1200 vibratome. De hersenhelften worden uitgelijnd dat het corticale oppervlak eerst wordt gesneden. Let op de grote hoeveelheid slushy ijs rond de hemisferen en de constante carbogenation van de ijzige ACSF (pijl). (C) na het afsnijden van de hersenen plakjes worden verplaatst naar opgewarmd sucrose-ACSF. De schijfjes werden omgedraaid en bijgesneden om de voorhersenen en de middenhersenen te verwijderen, waardoor alleen de hippocampus en de bovenliggende cortex.

Figuur 2
Figuur 2 Whole-cell patch-clamp-opname van interneuronen. (A) De opname configuratie rond de kamer. Let op de instroom en uitstroom zijn op tegenover elkaar liggende zijden van de kamer naar een dicht bij laminaire stroming te bereiken. Ook zichtbaar zijn de recording elektroden, gemonteerd op de headstages en de massa-elektroden aan beide zijden, en de doelstelling Low-power epifluorescerende beeld van de vGAT-Venus / YFP signaal (40X, water-onderdompeling) in het midden. (B) het CA1 van de hippocampus in een plak. (C) IR-DIC imaging van hetzelfde gebied. De pijlen in B en C geven een Venus / YFP positieve interneuronen in het cellichaam laag. (D) High-power IR-DIC beelden van de soma van de in paneel B neuron, met een naderende patch pipet die het kuiltje op de oppervlak (boven) en vervolgens de cel in de whole-cell configuratie (onder). (E) Schematische weergave van de belangrijkste fasen van de oprichting van een whole-cell patch-clamp-opname (links) met cartoon antwoorden op een testspanning -Pulse bewaken van de weerstand op de pipetpunt (rechts). Bovenste rij: pipet in het bad weg van de cel; Boven midden: Dimple vorming, vergezeld van eenverlaging van de pulsamplitude, hetgeen een matige stijging in weerstand. Lagere middenklasse: Giga-ohm afdichting formatie. Merk op dat de huidige pulsamplitude drastisch wordt verminderd. Slechts de snelle capacitieve stromen zichtbaar aan het begin en einde van de puls voordat pipet capaciteit wordt gecompenseerd. Bottom: Whole-cell opname configuratie wordt bereikt door het doorbreken van het membraan patch onder de pipet tip. Merk op dat de grote maar relatief traag capacitieve stromen aan het begin en einde van de puls voor serieweerstand compensatie wordt toegepast. (F) Representatieve sporen van een FS-IN (top) en CA1 PC (onder), opgewekt door een familie van hyper - tot depolariserende stroompulsen (protocol hierboven afgebeeld). Let op de zeer hoge frequentie ontlading van de FS-IN in vergelijking met de veel langzamere afvuren van de CA1 PC. Bijvoegsels rechts: Vergelijking van het AP golfvorm van de CA1 PC (boven) en de FS-IN (bottom, grijs, bedekt op de PC AP zwart), illustreert de difference in de golfvorm van de AP en AHP.

Figuur 3
Figuur 3 Farmacologische dissectie van de verbinding synaptische respons, het isoleren van slow GABA B-R gemedieerde IPSCs in een FS-IN. (A) IR-DIC beeld van het schijfje in de opname kamer, met de registratie-elektrode (Patch) geplaatst aan de rand van de str. Oriens (Ori.) en pyramidale (Pyr.) en de simulatie-elektrode (Stim) aan de grens van de str. radiatum (. Rad) en lacunosum-moleculare (LM) (B) Links:. Schematische weergave van de opname-configuratie. Rechts: Gesuperponeerd spanning reacties in de FS-IN uitgelokt door een familie van hyper naar huidige injecties depolariserende (C) Vertegenwoordiger sporen opgenomen van de FS-IN in reactie op extracellulaire stimulatie.. Top: De verbindingsynaptische respons verkregen in normale ACSF opgewekt door een stimulus (50 V intensiteit, 0,1 msec). Midden boven: Isolated monosynaptic IPSC na bad toepassing van DNQX (10 uM) en d-AP-5 (50 uM). Middle onderste: De snelle monosynaptic IPSCs geblokkeerd na toevoeging van gabazine (10 uM) aan het bad. Onder: Een trein van 5 stimuli (bij 200 Hz) blijkt dat er een langzame GABA B R gemedieerde IPSC (zwart trace), die wordt geblokkeerd door verdere toepassing van CGP (5 uM) aan het bad (bovenop grijze spoor).

Figuur 4
Figuur 4 Analyse van presynaptische modulatie van remmende synaptische transmissie in een gepaarde opneemt van een gekoppeld FS-IN en CA1 PC pair. (A) Links paneel: IR-DIC beeld van de twee opname pipetten, de linker gepatched op de FS-IN aan de grens van de < em> str. Oriens (Ori.) en pyramidale (Pyr.) en rechts gepatcht op een CA1 PC dichter bij het ​​str. radiatum (Rad.). Rechter paneel:. Een schematische weergave van de opname-configuratie, met representatieve spanning reacties van de FS-IN (links) en CA1 PC (rechts) tot een familie van stroompulsen (B) Vertegenwoordiger sporen met de AP's ontlokte in de presynaptische FS-IN (boven) en de korte wachttijd unitaire IPSC in de CA1 PC (onder) onder controle condities (sporen aan de linkerkant), na bad toepassing van baclofen (10 uM, midden), en vervolgens de toepassing van CGP (5 uM, rechts) . Merk op dat baclofen verminderde de IPSC amplitude van ~ 50%, terwijl CGP resulteerde in een bijna volledig herstel van de IPSC amplitude. Controle sporen zijn weergegeven underlain. (C) Tijdsverloop grafiek van de IPSC amplitude toont het effect van baclofen en CGP. IPSCs werden opgenomen in 10 sec intervallen.

s "> Figuur 5
Figuur 5 Visualisatie, wederopbouw en immunocytochemische identificatie van een-biocytine label opgenomen FS-BC. (A) Een projectie van gestikt stapels van beelden van een FS-IN afgebeeld met een 20X objectief op een confocale microscoop. De somata is gelegen aan de rand van de str. radiatum (Rad.) en pyramidale (Pyr.) van het CA1 gebied, de dendrieten werking radiaal en omvatten alle lagen, terwijl de meerderheid van axon wordt gevonden in en rond het cellichaam laag; zo typisch voor de graad. Schaal bar: 100 micrometer. Inzet rechtsboven: een sterke vergroting projectie van een 20 lagen, met typische manden van axon vorming rond vermeende CA1 PC somata (oranje sterretjes). Schaal bar. 10 urn (B) Het biocytine gevulde cellichaam van de IN (witte pseudocolour, onderste paneel pijl) toont immunoreactiviteit voor PV (groen, bovenste paneel). Schaalbar:. 20 urn (C) projectie van de 3-dimensionale reconstructie van de cel. De soma en dendrieten zijn in het zwart en het axon rood gekleurd. Lagen van CA1 wordt afgebakend in het blauw. Afkortingen: Ori, str. oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Schaal bar: 100 micrometer.

Naam Samenstelling (mM) Gebruik Aantekeningen
Sucrose-ACSF 87 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH 2PO 4, 25 glucose, 75 sucrose, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2, 1 Na-pyruvaat, 1 Na-ascorbaat Bereiding en de opslag van de hersenen plakjes pH = 7,4; osmolariteit = ~ 350 mOsm
Opnemen ACSF 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH 2PO 4, 25 glucose, 1 MgCl CaCl2, 1 Na-pyruvaat, 1 Na-ascorbaat Opnemen van hersenplakjes pH = 7,4; osmolariteit = 310-315 mOsm
Intracellulaire oplossing (1) 125 K-gluconaat, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-creatinefosfaat en 0,1% biocytine Het vullen van elektroden van GABAB IPSC opnames pH = 7,4; osmolariteit = 295-305 mOsm
Intracellulaire oplossing (2) 105 K-gluconaat, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-creatinefosfaat en 0,1% biocytine Het vullen van elektroden voor gepaarde opnames pH = 7,4; osmolariteit = 295-305 mOsm
Fosfaatbuffer (PB) 100 mM NaH 2PO 4 Spoelen vast plakken pH = 7,4
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 25 mM NaH 2PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCl (0,9% g / v) Spoelen vast plakken en antilichaam incubatie pH = 7,4
Paraformaldehyde fixatief 4% w / v Paraformaldehyde, 0,1 mM PB Fixatie van de hersenen plakjes pH = 7,4

Lijst Tabel 1 Solutions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschrijven een werkwijze die elektrofysiologische en neuroanatomisch technieken combineert functioneel karakteriseren morphologically- en neurochemisch geïdentificeerde neuronen in vitro; in het bijzonder de verschillende vormen van corticale remmende ins. Belangrijke aspecten van de procedure zijn: (1) pre-selectie van potentiële INs; (2) intracellulaire opname en neuron visualisatie; en tenslotte (3) morfologische en immunocytochemische analyse van opgenomen INs. Hoewel dit onderzoek is gericht PV-ins bijzonder kan de beschreven protocol voor soortgelijke opnamen van een interneuron of andere neuronale typen met minimale wijzigingen.

Het relatief lage aantal interneuronen in corticale gebieden maakt willekeurige selectie en opname van deze cellen zeer inefficiënt. Uiteenlopende lokalisatie en morfologische kenmerken hebben de onderzoekers in staat om onderscheid te maken en routinematig opneemt van bepaalde types interneuron. Echter in plakjes, de identificatie van de stagiaireurons in en in de buurt van het cellichaam lagen blijft moeilijk, zoals bij FS-ins. De komst van transgene muis lijnen, de uiting van de fluorescerende eiwitten in specifieke interneuron populatie biedt een elegante oplossing die pre-selectie en registratie van deze neuronen veel efficiënter 2 maakt. Nu veel transgene lijnen, vooral muizen, maar in toenemende mate ook ratten 13 zijn beschikbaar, het onderzoek van interneuronen vergemakkelijken. Bij transgene lijnen, is het echter essentieel om de omvang en de specificiteit van de reporterexpressie stellen.

Kwaliteit van cellulaire etikettering en morfologie, alsmede de elektrofysiologische opname kritisch afhankelijk levensvatbaar hoge kwaliteit segmenten; waarvoor de hersenen op korte termijn moet worden ontleed (idealiter 20-40 sec), zeer zorgvuldig en continu gekoeld behandeld. We vinden dat het gebruik van sucrose-ACSF, waarbij de totale concentratie natrium en dus exciteerbaarheid van neuronen wordt verminderd, dramatisch verbetert de kwaliteit van de plakjes en interneuron overleven 18. Er moet echter worden benadrukt dat veel onderzoekers het gebruik van standaard-opname ACSF voor slice voorbereiding, hebben een groot effect 10,11,15. Morfologische integriteit sterk afhankelijk van de hoek waaronder plakjes worden gesneden 13; die verschilt per regio en het type cel. Echter, veel interneuronen betrouwbaar worden geregistreerd van transversale, coronale of sagittale plakjes. Om ontslagvergoeding van dendrieten en axon, cellen dieper in het weefsel moet worden gericht, zij het ten koste gaat IR-DIC kwaliteit en betrouwbaarheid van giga-ohm afdichting formatie verder te minimaliseren. Onder deze omstandigheden opnamen van zowel CA1 pyramidale cellen en FS-ins betrouwbaar kan worden verkregen.

Etikettering en visualisatie van de neuronen wordt bereikt werden na een typische opname sessie duurt 30 minuten of langer. Indien opnames duren dan 30 minuten, moet dit tijdstip vóór fixatie bio inschakelen mogelijkcytin diffunderen distale dendritische en axonale processen garandeert volledige vulling en dus post-hoc visualisatie van cellen.

In whole-cell opnames tot lage en stabiele serieweerstanden is noodzakelijk nauwkeurige fysiologische meting van synaptische en intrinsieke eigenschappen, alsmede grondige etikettering van de neuronen. Echter laagohmige elektrodes mogelijk snelle dialyse van het cytoplasma met de intracellulaire bevatte in de pipet. Aanvulling van de intracellulaire oplossing met ATP, GTP en phosphocreatine helpt zeker om de energievoorziening en de opname kwaliteit te handhaven. Echter, dialyse van neurotransmitters en eiwitten leiden tot verminderde reacties, verminderde plasticiteit en 19 kunnen belemmeren neurochemische identificatie. Bijvoorbeeld PV consequent van neuronen wordt gewassen in de loop van meer experimenten. Daarom kan behandeling van distale dendritische en axonale processen moeten dete rmine immunoreactiviteit van de opgenomen neuron. In die gevallen waarin een dergelijke dialyse van belang is, opnames met geperforeerde patch-configuratie kan worden gebruikt om de intracellulaire omgeving 20 beschermen, maar de patch worden gebroken op het einde van opnamen of het neuron vervolgens "repatched" in de hele-cel configuratie om biocytine vulling mogelijk.

Farmacologisch onderzoek opgenomen neuronen is een handige methode om de functionele betekenis van uiteenlopende neuromodulatory mechanismen te evalueren in het vormgeven van de intrinsieke en synaptische activiteit van Ins. In de hierboven beschreven werkwijzen, farmacologische isolatie en gekoppeld opnamen worden gebruikt voor post en presynaptische GABA B-R gemedieerde effecten, respectievelijk; echter kan men gemakkelijk de combinatie van receptor agonisten en antagonisten wijzigen om de rol van alternatieve receptor families beoordelen, bijvoorbeeld cannabinoïdensysteem 21.

"> Histologische en immunocytochemische verwerking opgenomen cellen is zeer betrouwbaar, eenmaal protocollen worden vastgesteld. Heeft de immunocytochemie protocol beschreven afgestemd met betrekking tot de combinatie van de gebruikte antilichamen, plakdikte en eis dat de neurochemische inhoud identificeren. We gebruiken normaal geitenserum alle secundaire antilichamen die worden opgewekt bij geiten. Als alternatief is het ook mogelijk om runderserumalbumine (BSA) of melkpoeder als blokkerende middelen. Opgemerkt zij dat dit protocol gebruikt met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor antilichaam incubatie maar alternatief kan men gewoon gebruik 0,1 M PB in plaats van PBS. gebruik van een relatief hoge concentratie detergens (0,3% Triton X-100), doet niets af aan duidelijk antigeniciteit, terwijl penetratie van antilichamen in de eerste 100 urn oppervlaktelaag van het deel , waarbij neuronen worden routinematig opgenomen. Indien diepere cellen worden geregistreerd of de plakken dikker zijn, is het raadzaam om resectiop de plakken met behulp van een cryostaat of een vibratome, en het uitvoeren van de immunolabeling op de dunne (40-70 micrometer) secties. Voor 300 urn segmenten, een lange incubatie van de antilichamen (bij 4 ° C structurele integriteit van de segmenten behouden) produceert zeer betrouwbare immunocytochemische resultaten.

Identificatie van de neuronen is gebaseerd op de gecombineerde informatie verkregen in de opname, de post-hoc morfologische en de immunocytochemische analyse. In de hippocampus, vanwege de strikte laminaire organisatie, axonale verdeling is een goede indicator van de postsynaptische targets interneuronen. Gescheiden axon of dendrieten kan echter de identificatie moeilijk of onmogelijk maken. Bovendien zijn sommige dubbelzinnigheid blijft, bijvoorbeeld bij het differentiëren PV + graad en axo-axonic interneuronen, door overeenkomst van de totale axonale lokalisatie. Een laatste definitieve identificatie zou elektron microscopische analyse van postsynaptische targets 1,3 o vereisenr verdere immuuncytochemische dissectie 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen Ina Wolter bedanken voor haar uitstekende technische bijstand. VGAT-Venus transgene ratten werden gegenereerd door Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi en Y. Kawaguchi in Nationaal Instituut voor Fysiologische Wetenschappen, Okazaki, Japan, met behulp pCS2-Venus die door Dr A. Miyawaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer Ltd. DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).

Tags

Neurowetenschappen elektrofysiologie acute slice whole-cell patch-clamp-opname neuronale morfologie immunocytochemie parvalbumine hippocampus remming GABAergische interneuronen synaptische transmissie IPSC GABA-B receptor
Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Booker, S. A., Song, J., Vida, I.… More

Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter