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Neuroscience

Morphologically- और Neurochemically पहचान Hippocampal interneurons से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Published: September 30, 2014 doi: 10.3791/51706
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Integrative Neuroanatomy, NeuroCure Cluster of Excellence, Charité Universitätmedizin

Summary

Cortical नेटवर्क निरोधात्मक interneurons का एक छोटा सा, लेकिन विविध सेट द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. Interneurons के कार्यात्मक जांच इसलिए लक्षित रिकॉर्डिंग और कठोर पहचान की आवश्यकता है. Intracellular लेबलिंग, बाद हॉक रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण के साथ न्यूरॉन्स की एकल या synaptically युग्मित जोड़े से पूरे सेल रिकॉर्डिंग से जुड़े एक संयुक्त दृष्टिकोण है यहाँ का वर्णन किया.

Abstract

GABAergic निरोधात्मक interneurons मस्तिष्क की neuronal सर्किट के भीतर एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. Interneurons न्यूरोनल जनसंख्या (10-20%) के एक छोटे सबसेट शामिल है, लेकिन उनके विविध कार्यों को दर्शाती है, शारीरिक रूपात्मक, और नयूरोचेमिकल विविधता के उच्च स्तर दिखा. इसलिए, interneurons की जांच महत्वपूर्ण संगठन के सिद्धांतों में अंतर्दृष्टि और neuronal सर्किट के समारोह में प्रदान करता है. यह, हालांकि, व्यक्तिगत interneuron प्रकार का चयन और पहचान के लिए एक एकीकृत शारीरिक और neuroanatomical दृष्टिकोण की आवश्यकता है. Interneuron विशेष मार्कर के प्रमोटरों के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें से रिकॉर्डिंग पूरे सेल पैच दबाना, लक्ष्य और electrophysiologically विशिष्ट interneuron प्रकार की आंतरिक और synaptic गुण चिह्नित करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है. Intracellular डाई लेबलिंग के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण के बाद हॉक मो के साथ बढ़ाया जा सकता हैrphological और immunocytochemical विश्लेषण, दर्ज न्यूरॉन्स के व्यवस्थित पहचान सक्षम करने से. इन विधियों cortical न्यूरॉन्स के विविध प्रकार के कार्यात्मक संपत्तियों के बारे में वैज्ञानिक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुरूप किया जा सकता है.

Introduction

हिप्पोकैम्पस neuronal सर्किट लंबे समय के कारण मानव और कृन्तकों दोनों में उनके सीखने और स्मृति में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में भी स्थानिक स्किप शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान, दोनों के लिए सम्मान के साथ, गहन जांच का विषय रहा है. समान रूप से, हिप्पोकैम्पस के प्रमुख, लेकिन सरल लामिना संगठन इस क्षेत्र Cortical नेटवर्क के संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों को संबोधित अध्ययन का एक इष्ट विषय बना देता है.

हिप्पोकैम्पस सर्किट उत्तेजक प्रिंसिपल कोशिकाओं (> 80%) और एक छोटे (10-20%), लेकिन निरोधात्मक interneurons 1-3 की अत्यधिक विविध पलटन के शामिल हैं. Interneurons तेजी ionotropic GABA एक रिसेप्टर्स पर कार्य करता है जो उनके अक्षतंतु टर्मिनलों से γ aminobutyric एसिड (GABA) (GABA एक रुपए) और धीमी metabotropic गाबा बी रिसेप्टर्स (गाबा बी रुपये) जारी 4. ये निरोधात्मक तंत्र उत्तेजना counterbalance और प्रिंसिपल कोशिकाओं के excitability को विनियमित, और इस प्रकारआईआर समय और छुट्टी के पैटर्न. हालांकि, interneurons से जारी गाबा प्रिंसिपल कोशिकाओं पर, लेकिन यह भी interneurons खुद 5,6 पर न केवल काम करता है. पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स interneuron के विभिन्न प्रकार के बीच प्रतिक्रिया विनियमन और निरोधात्मक आपसी बातचीत में मध्यस्थता. Interneuron नेटवर्क में इन निरोधात्मक तंत्र विभिन्न आवृत्तियों 7 पर विशेष दोलनों में पीढ़ी और जनसंख्या गतिविधि पैटर्न के आकार देने, के लिए केंद्रीय माना जाता है.

पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग आंतरिक गुणों और न्यूरॉन्स की synaptic बातचीत की परीक्षा के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है. हालांकि, interneuron प्रकार की उच्च विविधता के कारण, निरोधात्मक interneurons की जांच दर्ज की कोशिकाओं के कठोर पहचान की आवश्यकता है. हिप्पोकैम्पस interneuron प्रकार अलग रूपात्मक सुविधाओं और नयूरोचेमिकल मार्कर अभिव्यक्ति, संयुक्त शारीरिक और immunocytochemical ई की विशेषता है के रूप मेंxamination सटीक interneuron पहचान 6,8,9 निर्धारित करने के लिए एक साधन प्रदान कर सकते हैं.

वर्तमान पत्र में हम धीमी गाबा बी के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, एकल न्यूरॉन्स या synaptically युग्मित जोड़े से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के बाद हॉक रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण द्वारा पीछा किया, intracellular लेबलिंग के साथ संयुक्त कर रहे हैं, जिसमें एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन रिसेप्टर पहचान interneurons में निरोधात्मक प्रभाव मध्यस्थता. एक उदाहरण के रूप में, हम अपने पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों की सोमा और समीपस्थ डेन्ड्राइट innervates और एक "तेजी से spiking" (एफएस) के द्वारा होती है जो interneuron का एक प्रमुख प्रकार, तथाकथित "टोकरी कोशिकाओं" (ईसा पूर्व) के एक सबसेट, पर ध्यान केंद्रित कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन parvalbumin (पीवी) 10,11 के पैटर्न, घनी सेल शरीर परत को कवर एक अक्षतंतु, और अभिव्यक्ति का निर्वहन. ये interneurons बड़े पोस्टअन्तर्ग्रथनी निरोधात्मक धाराओं, साथ ही प्रमुख पूर्व प्रदर्शितगाबा बी आर सक्रियण 12 के जवाब में उनके synaptic उत्पादन की synaptic मॉडुलन,. यहाँ वर्णित तकनीक के संयोजन अन्य पहचान न्यूरॉन प्रकार की एक किस्म में आंतरिक या synaptic तंत्र की जांच करने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है.

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Protocol

आचार विवरण: सभी प्रक्रियाओं और पशु रखरखाव संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे, जर्मन पशु कल्याण अधिनियम, यूरोपीय परिषद जानवरों की सुरक्षा के बारे में निर्देशक 86/609 / ईईसी, और स्थानीय अधिकारियों (बर्लिन, टी 0215/11 से दिशा निर्देश )

तीव्र hippocampal स्लाइस की 1. तैयारी

  1. कॉर्टिकल निरोधात्मक interneurons 13 के बहुमत लेबल जो vGAT प्रमोटर, के तहत फ्लोरोसेंट वीनस / YFP प्रोटीन व्यक्त (17-24 दिन पुराना) एक ट्रांसजेनिक चूहे लो. चूहा सिर काटना. तेजी से carbogenated, semifrozen (95% 2 हे / 5% सीओ 2) सूक्रोज आधारित कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (सूक्रोज-ACSF, चित्रा 1 ए) में मस्तिष्क (<40 सेकंड) काटना.
  2. , दीपक और 515 उत्सर्जन फिल्टर एलईडी चश्मे की एक जोड़ी पर घुड़सवार एनएम एक 505 के साथ वीनस / YFP प्रतिदीप्ति के लिए विच्छेदित चूहे के मस्तिष्क का आकलन करें.
  3. प्रांतस्था और cereb के ललाट तीसरे निकालेंEllum; फिर सब एक स्केलपेल के साथ, गोलार्द्धों अलग. पहले 14 में वर्णित के रूप में, मस्तिष्क नीचे गोंद के लिए एक फ्लैट सतह प्रदान करने के लिए प्रांतस्था के पृष्ठीय सतह निकालें.
  4. एक vibratome पर हिप्पोकैम्पस गठन की अनुप्रस्थ स्लाइस (300 माइक्रोन) में कटौती, गोलार्द्धों semifrozen के साथ घेर लिया जाना चाहिए, सूक्रोज-ACSF (चित्रा 1 बी) 14 carbogenated. व्याख्यान चबूतरे वाला प्रांतस्था, मध्यमस्तिष्क और brainstem के अतिरिक्त क्षेत्रों निकालें. Carbogenated और 35 डिग्री सेल्सियस तक गरम किया जाता है जो सूक्रोज-ACSF युक्त एक जलमग्न होल्डिंग कक्ष में प्रत्येक टुकड़ा स्थानांतरण.
  5. गरम ACSF में प्रवेश आखिरी टुकड़ा के समय से 30 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए स्लाइस छोड़ दें. चयापचय की प्रक्रिया को पुन: सक्रिय और कटौती neuronal प्रक्रियाओं की resealing की सुविधा के लिए आदेश में यह मत करो. फिर भंडारण (चित्रा 1C) के लिए कमरे के तापमान को हस्तांतरण.

2 निर्माण और रिकॉर्डिंग pipettes के फिलिंग

  1. पु(intracellular लेबलिंग के लिए) 0.1% biocytin युक्त intracellular समाधान: फ़िल्टर्ड से भरा जब 2-4 MΩ की एक पिपेट प्रतिरोध हासिल की है कि ताकि कांच केशिकाओं से करूँगा पैच pipettes, (0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर, आकार ताकना). उसके घटकों की गिरावट को रोकने के लिए बर्फ पर ठंडा intracellular समाधान रखें.
  2. एकाग्रता (; समाधान सूची देख ई आर (Cl-) = -61 एम वी) - एक physiologically प्रासंगिक कम क्लोरीन युक्त समाधान के साथ पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं की पहचान के लिए पैच pipettes भरें.
  3. एकाग्रता (ई आर (Cl-) = - बनती रिकॉर्डिंग प्रीसानेप्टिक रिसेप्टर मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए, कम सीए 2 + बफर presynaptically ट्रांसमीटर रिलीज के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए क्षमता, के रूप में अच्छी तरह से 4 गुना अधिक है सीएल के रूप में साथ intracellular समाधान के साथ पैच pipettes भरने -20 एम वी) संकेत करने वाली शोर औषधीय resp का सही आकलन की अनुमति मनाया IPSCs 5 का सुधार करने के लिएonsiveness. एकाग्रता IPSC कैनेटीक्स 15 को बदल सकते हैं - CL बदलते ध्यान दें.

एफएस भारतीय नौसेना पोत से 3 पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

  1. ACSF Carbogenate और (यह भी एक सक्शन लाइन, चित्रा 2A के माध्यम से रिकॉर्डिंग कक्ष से ACSF निकालता है जो) एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से, रिकॉर्डिंग कक्ष छिड़काव प्रणाली के माध्यम से खाते हैं. रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी में सेटअप पर सभी उपकरणों को चालू करें.
  2. रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए एक टुकड़ा हस्तांतरण और रेशम की एकल फाइबर के साथ भावुक एक प्लेटिनम की अंगूठी के साथ जगह में पकड़. सीए 1 की परत (Str.) Pyramidale दोनों Str के लिए 2 pipettes साथ उपयोग की अनुमति, देखने के क्षेत्र के माध्यम से खड़ी चलाता है तो टुकड़ा स्थिति. radiatum और Str. oriens एक साथ (आंकड़े -2 सी और 4 ए).
  3. (32-34 डिग्री सेल्सियस) रिकॉर्डिंग एक सेटअप में चैम्बर प्लेस और carbogenated का छिड़काव शुरू और गरम5-10 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर सीएसएफ.
  4. 40x उद्देश्य बढ़ाई आईआर डीआईसी प्रकाशिकी के तहत टुकड़ा गुणवत्ता का आकलन, और एक प्रदर्शन पर देखा एक सीसीडी कैमरे के साथ कल्पना. दौर, मामूली विषम CA1 पिरामिड कोशिकाओं (सीए 1 पीसी) की एक बड़ी संख्या Str में देखा जा सकता है अगर अच्छा टुकड़ा गुणवत्ता मान लें. एक चिकनी और हल्के से cratered सतह (चित्रा -2) नीचे 20-30 माइक्रोन की गहराई पर pyramidale. खराब गुणवत्ता स्लाइस एक असमान टुकड़ा सतह के साथ, अत्यधिक विपरीत, सिकुड़ा हुआ या सूजन कोशिकाओं की संख्या में होते.
  5. में या Str के पास बड़े बहुध्रुवीय somata साथ वीनस / YFP (चित्रा 2B), व्यक्त उन लोगों के रूप epifluorescence रोशनी के तहत ख्यात एफएस interneurons पहचानें. pyramidale. यथोचित गहरी क्रम में टुकड़ा (50-100 माइक्रोन, चित्रा -2) के भीतर चयन कोशिकाओं बेहतर उनके रूपात्मक अखंडता की रक्षा करने के लिए.
  6. Headstage पर विंदुक धारक में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड माउंट; फिर अनुप्रयोगly ट्यूब लाइन के माध्यम से एक कम, सकारात्मक दबाव (20-30 मिलीबार). टुकड़ा की सतह पर पिपेट लोअर, थोड़ा चयनित न्यूरॉन के केंद्र के लिए ऑफसेट.
  7. पहले 14,16 वर्णित है और यह भी 2 डी और 2 ई के आंकड़े देख के रूप में पूरे सेल रिकॉर्डिंग विन्यास प्राप्त करें:
    1. एक सेल टारगेट: 70-80 मिलीबार के लिए दबाव बढ़ाने के लिए और तेजी से करने के लिए सिर्फ चयनित सेल (चित्रा 2 डी, शीर्ष) की सोमा ऊपर टुकड़ा के माध्यम से पिपेट कम है.
    2. सेल दृष्टिकोण: (शीर्ष, चित्रा 2 डी) इस पर एक "डिंपल" का निर्माण करने के कोशिका झिल्ली के खिलाफ पिपेट दबाएं. पड़ोसी कोशिकाओं की biocytin लेबलिंग को रोकने के क्रम में, तेजी से इस कदम प्रदर्शन.
    3. एक Giga ओम मुहर बनाएँ: पिपेट करने के लिए एक 20 एम वी वोल्टेज आदेश लागू एक साथ दबाव जारी है और. एक Giga ओम मुहर (1-50 GΩ, चित्रा 2 डी, नीचे और चित्रा 2 ई मध्य) typicसहयोगी तेजी से विकसित करता है. एक बार एक वोल्टेज कमांड के रूप में संभावित उम्मीद है और आराम झिल्ली (आमतौर के बीच -70 और -60 एम वी) लागू, तय हो गया.
    4. पैच के माध्यम से तोड़: सील एक बार, नकारात्मक दबाव की एक छोटी नाड़ी के साथ झिल्ली पैच टूटना; जिससे पूरे सेल विन्यास (चित्रा 2 ई, नीचे) को प्राप्त करने.
  8. पूरे सेल समाई और श्रृंखला प्रतिरोध (आर एस) क्षतिपूर्ति. आर एस 120 मिनट तक के लिए सामान्य रूप से 5-20 MΩ और स्थिर है. तोड़ने के माध्यम पर झिल्ली क्षमता (वी एम) -50 एम वी से अधिक depolarized अगर कोशिकाओं त्याग दें; आर एस 30 MΩ से शुरू में अधिक से अधिक है; रिकॉर्डिंग के दौरान अधिक से अधिक 20% से या आर एस परिवर्तन.
  9. (250 फिलीस्तीनी अथॉरिटी, चित्रा 2 एफ, शीर्ष पर -250) वर्तमान दालों depolarizing को अति के एक परिवार के लिए (वर्तमान दबाना मोड में) उनकी प्रतिक्रिया से एफएस भारतीय नौसेना पोत को पहचानें. FS-INS अपेक्षाकृत वी एम (आमतौर -50 टी depolarized हैओ -60 एम वी), कम झिल्ली समय निरंतर (<20 मिसे) और आवृत्तियों पर कार्रवाई क्षमता की एक ट्रेन (ए पी एस) के साथ वर्तमान इंजेक्शन depolarizing एक 500 फिलीस्तीनी अथॉरिटी को जवाब> 100 हर्ट्ज 11 (चित्रा 2 एफ, नीचे), स्पष्ट रूप से कर रहे हैं जो सीए 1 पीसी (चित्रा 2 एफ, मध्य) में उन लोगों से अलग.

4 कोशिकी बिजली की उत्तेजना गाबा बी आर मध्यस्थता प्रतिक्रियाएँ आह्वान

  1. Str की सीमा पर टुकड़ा में:; synaptically पैदा प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए, एक बाह्य उत्तेजना इलेक्ट्रोड (0.1-0.3 MΩ प्रतिरोध 2 एम NaCl से भरा एक पैच पिपेट) की स्थिति. radiatum और Str. lacunosum-moleculare. उत्तेजना कलाकृतियों (चित्रा 3) सेल के प्रत्यक्ष बिजली की उत्तेजना को रोकने और कम करने के लिए सोमा को इलेक्ट्रोड 200-300 माइक्रोन पार्श्व स्थिति.
  2. उत्तेजना इलेक्ट्रोड तैनात है एक बार, के पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्तचुने हुए सेल और धारा 3.9 (3B चित्रा) के रूप में वर्तमान दबाना मोड में शारीरिक phenotype का आकलन करें.
  3. वोल्टेज दबाना (वी एम -65 एम वी) में दर्ज न्यूरॉन के साथ, पर प्रीसानेप्टिक axons की बिजली की उत्तेजना देने 50 वी (~ 500 μA प्रभावी प्रोत्साहन) एक अलग निरंतर वोल्टेज उत्तेजक का उपयोग हर 20 सेकंड,. एकल उत्तेजनाओं का प्रयोग (100 μsec अवधि, चित्रा -3 सी, शीर्ष) गाबा बी आर मध्यस्थता IPSCs निरीक्षण करने के लिए, और अधिक से अधिक ट्रांसमीटर रिहाई का उत्पादन करने के लिए (200 हर्ट्ज पर) कई उत्तेजनाओं की गाड़ियों के साथ बिछा.
  4. पृथक monosynaptic IPSC (, मध्य ऊपरी चित्रा -3 सी) प्रकट करने के लिए:;: स्नान ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी (डी AP5 [50 माइक्रोन] NMDA रिसेप्टर DNQX [10 माइक्रोन] AMPA रिसेप्टर) लागू होते हैं. इसके अलावा एक GABA एक आर अवरोधक के आवेदन के साथ गाबा बी आर मध्यस्थता IPSC अलग (gabazine [10 माइक्रोन], चित्रा -3 सी बीच Lower).
  5. गाबा बी बाद के आवेदन CGP-55845 [5 माइक्रोन] (चित्रा -3 सी कम, ग्रे में underlain) द्वारा अनुसंधान की मध्यस्थता जा रहा है के रूप में परिणामी धीमी गति से जावक वर्तमान (विस्तार चित्रा -3 सी कम,) की पुष्टि

FS-IN और सीए 1 पीसी युग्मित Synaptically के 5 बनती रिकॉर्डिंग

  1. नीचे बताए अनुसार synaptically युग्मित में और पीसी जोड़े के बीच प्रदर्शन किया एक साथ रिकॉर्डिंग, साथ निरोधात्मक synaptic प्रसारण के गाबा बी आर मध्यस्थता presynaptic नियंत्रण का आकलन करें.
  2. सबसे पहले, (धारा 3 के रूप में) एक प्रीसानेप्टिक interneuron के एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग की स्थापना और एफएस फेनोटाइप (चित्रा -4 ए) की पुष्टि.
  3. तब एक पड़ोसी सीए 1 पीसी (20-100 माइक्रोन दूरी, चित्रा -4 ए) पैच और ए पी एस बटोर (वर्तमान दबाना मोड में आयोजित) प्रीसानेप्टिक में वर्तमान दालों (1 मिसे अवधि, 1-5 ना आयाम) depolarizing संक्षिप्त suprathreshold लागू होते हैं. एक synaptic सह हैंnnection, वोल्टेज दबाना में आयोजित सीए 1 पीसी, में IPSCs में में परिणाम में ए पी एस (के बारे में 80% करने के लिए आर एस क्षतिपूर्ति) मौजूद है.
  4. आवश्यक हो तो एक कनेक्शन पाया जाता है जब तक, आगे सीए 1 पीसी से एक नई रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और रिकॉर्ड भरें.
  5. एक कनेक्शन स्थापित हो जाने के बाद, एकात्मक synaptic प्रतिक्रिया और गतिशील व्यवहार दोनों का आकलन करने के लिए प्रीसानेप्टिक है FS में ए पी एस के जोड़े को प्रकाश में लाना. एक 50 मिसे अंतराल (चित्रा 4 बी) के साथ 2 depolarizing उत्तेजनाओं की एक ठेठ बनती पल्स प्रोटोकॉल का प्रयोग करें.
  6. आधारभूत स्थितियों में नियंत्रण निशान लीजिए. फिर, इस प्रकार पूरी तरह रिसेप्टर मध्यस्थता प्रभाव को ब्लॉक करने के लिए, प्रतिपक्षी CGP-55845 (5 माइक्रोन) द्वारा पीछा गाबा बी रुपये, को सक्रिय करने, perfusing ACSF को चयनात्मक गाबा बी आर एगोनिस्ट Baclofen (10 माइक्रोन) लागू होते हैं. प्रत्येक दवा हालत (चित्रा 4 बी और सी) की स्थिर अवस्था के दौरान ~ 50 निशान लीजिए.
  7. रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है एक बार, एक outsid गठन से दैहिक झिल्ली सीलई बाहर पैच: धीरे धीरे वी दबाना में सेल शरीर से विंदुक वापस लेने और आर एस वृद्धि के रूप में, एम वी -40 वी एम को कम. बाहर से बाहर पैच के गठन की सुविधा के लिए यह करो; फिर स्नान से पिपेट हटा दें.

Electrophysiological गुण के 6 विश्लेषण

  1. नोट: विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल की एक भीड़ electrophysiological डेटा के अधिग्रहण के लिए उपलब्ध हैं. इधर, WinWCP, मुफ्त स्ट्रेथक्लाइड इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर पैकेज में एक Windows कार्यक्रम के लिए 16 अनुरूप निवेश चैनलों की रिकॉर्डिंग और 10 डिजिटल संकेतों के उत्पादन की अनुमति देता है, जो प्रयोग किया जाता है.
  2. कम पास फिल्टर 20 kHz पर सभी 5-10 kHz पर डेटा और नमूना.
  3. एक लाइन विश्लेषण सूट के साथ शारीरिक डेटा का विश्लेषण.
    नोट: Stimfit,, इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है एक अजगर खोल भी शामिल है जो एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज; हालांकि अन्य विकल्प आसानी बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
    1. निष्क्रिय झिल्ली पी विश्लेषणदर्ज न्यूरॉन्स की roperties, झिल्ली क्षमता आराम से, वर्तमान दबाना में हासिल कर ली.
    2. रिकॉर्डिंग की शुरुआत से दर्ज की प्रतिक्रियाओं के आधार रेखा से मतलब आराम झिल्ली क्षमता को मापने.
    3. छोटी से छोटी hyperpolarizing वर्तमान दालों (≤ -50 PA) को वोल्टेज प्रतिक्रिया से, ओम कानून का उपयोग कर, इनपुट प्रतिरोध की गणना. शोर अनुपात, औसत कई निशान को संकेत में सुधार करना. नोट: हमारी उदाहरण आम तौर पर 10-50 व्यक्ति sweeps के औसत हैं.
  4. छोटी से छोटी hyperpolarizing वर्तमान दालों के लिए प्रतिक्रियाओं का क्षय करने के लिए एक monoexponential वक्र ढाले द्वारा लगातार स्पष्ट झिल्ली समय का अनुमान.
  5. सीमा, आयाम (सीमा पीक करने के लिए) और अवधि (आधा ऊंचाई पर मापा चौड़ाई) वर्तमान दालों depolarizing सीमा स्तर से हासिल निर्धारित करने के लिए कार्रवाई संभावित तरंग का विश्लेषण करें.
  6. गाबा बी आर वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग से मध्यस्थता IPSCs विश्लेषण. फ़िल्टर पर बंद लाइन निशान500 हर्ट्ज (गाऊसी फिल्टर) और (कम से कम 10 निशान का मूविंग में) गाबा बी आर मध्यस्थता प्रतिक्रिया के शिखर आयाम और विलंबता का आकलन करें.
  7. शिखर और पूर्ववर्ती आधारभूत बीच मापा GABA एक आर की मध्यस्थता IPSCs के शिखर आयाम में एक परिवर्तन के रूप में इन की निरोधात्मक उत्पादन पर गाबा बी रुपये के प्रभाव का पता लगाने. नियंत्रण अवधि और सभी औषधीय epochs के स्थिर राज्य के लिए ≥50 निशान से मतलब आयाम की गणना.

7 दृश्य और के Immunocytochemistry एफएस इन

  1. रिकॉर्डिंग के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब, पीएच = 7.35) ओ / एन के साथ 4% paraformaldehyde में विसर्जन से स्लाइस को ठीक.
  2. आवश्यक स्लाइस प्रक्रिया से पहले 1 ~ सप्ताह के लिए पंजाब को हस्तांतरित और संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. उदारतापूर्वक ताजा पंजाब में और बाद में 0.9% NaCl के साथ 0.025 एम पंजाब में धो स्लाइस (पीबीएस, पीएच = 7.35).
  4. के लिए स्लाइस ब्लॉक, बाध्यकारी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी कम करने के लिए10% सामान्य बकरी सीरम (NGS), 0.3% ट्राइटन-X100 पीबीएस में बना NaN 3, और 0.05% (झिल्ली permeabilize के लिए एक डिटर्जेंट) युक्त समाधान में आरटी पर आर 1 घंटा.
  5. पीबीएस में, नेन 3 से 5% NGS, 0.3% ट्राइटन-X100, 0.05% युक्त समाधान में पतला एक विरोधी पी.वी. मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी का उपयोग, पी.वी. अभिव्यक्ति के लिए लेबल के लिए. 4 डिग्री सेल्सियस 12 में 2-3 दिनों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं. अच्छी तरह से पीबीएस में स्लाइस कुल्ला.
  6. फ्लोरोसेंट विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें (जैसे Alexafluor-546.) बायोटिन बाध्यकारी प्रोटीन streptavidin के साथ साथ, एक fluorochrome संयुग्मित (जैसे, Alexafluor-647); और पीबीएस में पतला NaN 3 3% NGS, 0.1% ट्राइटन-X100, 0.05% युक्त समाधान में सेते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते हैं.
  7. उदारतापूर्वक 2-3 पंजाब में rinses द्वारा पीबीएस के साथ पीछा किया 2-3x स्लाइस कुल्ला. गिलास स्लाइड पर स्लाइस माउंट. ढहने से टुकड़ा को रोकने के लिए एक 300 माइक्रोन अगर स्पेसर का प्रयोग करें. एक fluores साथ कवर पर्ची स्लाइसनाखून वार्निश के साथ प्रतिशत बढ़ते मध्यम और मुहर.

8 इमेजिंग और कल्पना का पुनर्निर्माण एफएस इन

  1. उचित लेजर लाइन (डायोड लेजर Alexafluor-647 के लिए 635 एनएम के साथ उत्साहित fluorochome पत्रकार के साथ, एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग स्लाइस कल्पना, वीनस के लिए Alexafluor-546 पीवी के लिए लेबलिंग और आर्गन 488 या 515 एनएम के लिए हीलियम नियॉन 543 एनएम / YFP).
  2. पूरे सेल की एक z ढेर निर्माण करने के लिए (एक 20x उद्देश्य का उपयोग, आम तौर पर 0.5-1 माइक्रोन कदम) एक उपयुक्त जेड संकल्प पर चित्र लेने. एकाधिक ढेर सामान्य रूप से छवि को डिजिटली फिजी / ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा 5A) का उपयोग बंद लाइन सिले जा सकता है, जो पूरे सेल, आवश्यक हैं.
  3. एक अर्द्ध स्वचालित त्रुटि विधि का उपयोग सिले छवि ढेर से सेल का पुनर्निर्माण (फिजी / ImageJ सॉफ्टवेयर पैकेज 17 में सरल neurite अनुरेखक प्लगइन, चित्रा सी).
  4. अंत में, मैं की पी.वी. immunoreactivity आकलनएक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस के साथ nterneuron (60X सिलिकॉन विसर्जन, एनए = 1.3). पी.वी. की दैहिक वार्शआउट भी मजबूत है तो सोमा की छवियों, समीपस्थ dendrites और समीपस्थ अक्षतंतु, या वैकल्पिक रूप से अक्षतंतु टर्मिनलों के बनाओ. इम्युनो लेबलिंग biocytin लेबल संरचनाओं (चित्रा 5 ब) के साथ संरेखित करने के लिए देखा जाता है अगर कोशिकाओं पी.वी. के लिए immunoreactive समझा रहे हैं.

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Representative Results

बशर्ते कि टुकड़ा गुणवत्ता दोनों सीए 1 पीसी और FS आईएनएस न्यूनतम मुश्किल से हासिल किया जा सकता से रिकॉर्डिंग, appreciably अच्छा है. vGAT प्रमोटर 13 के तहत वीनस / YFP व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहे लाइन स्पष्ट एफएस इन, या वास्तव में बीसी की पहचान नहीं है. हालांकि में और Str के आसपास आईएनएस से रिकॉर्डिंग. pyramidale, एफएस इन का घनत्व 1 आम तौर पर अधिक है जहां, एफएस इन (चित्रा 2 बी) के चयन का एक उच्च संभावना में परिणाम है. FS-INS सीए 1 पीसी और रुपये आईएनएस दोनों के उन लोगों से अलग उनकी विशेषता शारीरिक गुणों से प्रतिष्ठित किया जा सकता. वे एक अपेक्षाकृत depolarized विश्राम क्षमता झिल्ली (-58.9 ± 1.5 एम वी, 15 कोशिकाओं, बनाम सीए 1 पीसी, 26 कोशिकाओं में -62.6 ± 1.1 एम वी), कम इनपुट प्रतिरोध (92 ± 12 MΩ बनाम 103 पीसी में ± 14 MΩ) और तेजी से स्पष्ट झिल्ली समय निरंतर (15.4 ± 2.6 मिसे बनाम पीसी में 22.0 ± 2.7 मिसे), resulतेजी से वोल्टेज प्रतिक्रिया में ting वर्तमान दालों (चित्रा 2 एफ) hyperpolarizing करने के लिए. एफएस इन (आयाम 22.6 ± 2.9 एम वी मतलब है) बहुत महत्वपूर्ण तेजी afterhyperpolarization द्वारा पीछा अपेक्षाकृत कम आयाम (82.8 ± 1.0 एम वी) का बहुत ही संक्षिप्त कार्रवाई क्षमता (0.38 ± 0.01 मिसे) छुट्टी दे दी. (: वाम, चित्रा 2 डी; 34-128 हर्ट्ज रेंज 82 ± 10 हर्ट्ज) बड़े depolarizing वर्तमान दालों (250 PA) के जवाब में, इस FS आईएनएस उच्च आवृत्तियों पर गोली चलाई.

एफएस भारतीय नौसेना पोत में गाबा बी आर मध्यस्थता पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं का आकलन करने के लिए, औषधीय अलग synaptic प्रतिक्रियाओं Str पर निरोधात्मक फाइबर की बाह्य उत्तेजना द्वारा हासिल किए गए थे. radiatum / lacunosum-moleculare सीमा. चित्रा 3 यौगिक synaptic प्रतिक्रिया के घटकों की अनुक्रमिक नाकाबंदी monosynaptic गाबा बी आर मध्यस्थता धीमी IPSC आइसोलेट्स जिसमें एक एफएस में, का एक उदाहरण दिखाता है. Synaptic प्रतिक्रियाओं एली थेएकल उत्तेजनाओं या Str के लिए (200 हर्ट्ज पर दिया 50 वी तीव्रता 0.1 मिसे अवधि) 3-5 उत्तेजनाओं की गाड़ियों से भी आह्वान किया. lacunosum-moleculare / radiatum सीमा (चित्रा 3A). उत्तेजक और निरोधात्मक दोनों घटकों (चित्रा -3 सी, शीर्ष) सहित प्रारंभिक यौगिक प्रतिक्रिया दृढ़ता (: चित्रा -3 सी, मध्य क्रमशः DNQX, 10 माइक्रोन और एपी-5, 50 माइक्रोन,) AMPA और NMDA रिसेप्टर विरोधी के स्नान आवेदन से कम हो गया था. (- इन प्रयोगों में, लगभग -60 एम वी के एक उलट क्षमता के साथ, होल्डिंग क्षमता -65 एम वी पर मध्यस्थता वर्तमान एक ख्यात आवक सीएल) और एक मौजूदा धीमी जावक (एक ख्यात द्वारा मध्यस्थता अवशिष्ट monosynaptic IPSC वर्तमान आवक जल्दी तेजी से एक शामिल + K 100 एम वी के लिए एक उलट संभावित पास से प्रवाहकत्त्व). चयनात्मक GABA एक आर प्रतिपक्षी gabazine के अनुप्रयोग (एसआर-95531, 10 माइक्रोन) एक छोड़ रहा है, तेजी से IPSC समाप्त कर दियाधीमी गाबा बी आर मध्यस्थता IPSC (चित्रा -3 सी, नीचे, काले ट्रेस) पृथक; जो उत्तेजनाओं की छोटी गाड़ियों के जवाब में अधिक स्पष्ट रूप से एक उत्तेजना के जवाब में मनाया गया था, लेकिन. यह शक्तिशाली और चयनात्मक प्रतिपक्षी CGP-55845 (CGP, 5 माइक्रोन, चित्रा -3 सी, नीचे, ग्रे ट्रेस) द्वारा अवरुद्ध किया गया था के रूप में यह प्रतिक्रिया, एक GABA बी आर सक्रिय + K प्रवाहकत्त्व के रूप में पुष्टि की गई. एफएस बीसी आम तौर पर इस तरह के अपने हाल के प्रकाशन के 12 में दिखाया गया के रूप में बड़े आयाम गाबा बी आर मध्यस्थता IPSCs, दिखा.

इस FS में GABA बी रुपये से निरोधात्मक उत्पादन, बनती रिकॉर्डिंग synaptically युग्मित FS-IN और सीए 1 पीसी से प्रदर्शन किया गया की प्रीसानेप्टिक विनियमन का आकलन करने के लिए. पहले 1,3 के रूप में दिखाया एफएस बीसी और सीए 1 पीसी के बीच synaptic कनेक्टिविटी, अपेक्षाकृत अधिक है. पहले के रूप में दिखाया ये रिकॉर्डिंग में, युग्मन संभावना निकट स्थित सेल जोड़े (≤50 माइक्रोन के बीच 50% से अधिक है; 5. हालांकि, इस जांच interneuron प्रकार पर दृढ़ता से निर्भर करता है. कनेक्टिविटी एक एकल एपी प्रत्येक eliciting एक लंबे depolarizing वर्तमान इंजेक्शन (100 मिसे, ≥ 500 PA) या कम depolarizing दालों (20 हर्ट्ज पर दिया 10 दालों को 1 मिसे अवधि, 1-5 ना,) की एक ट्रेन या तो साथ परीक्षण किया गया था. प्रीसानेप्टिक interneurons में ए पी एस तेजी GABA एक synaptically मिलकर पीसी में कम विलंबता, तेजी से वृद्धि और क्षय के साथ IPSCs आर मध्यस्थता हासिल. बनती दालों (20 हर्ट्ज पर 2 दालों) लागू किया गया है, जब अन्तर्ग्रथन अल्पकालिक अवसाद से पता चला है (बनती पल्स अनुपात <1) 1. दिखाए गए उदाहरण सेल में, गाबा बी आर एगोनिस्ट Baclofen (2-10 माइक्रोन) के स्नान आवेदन पहले IPSC (आंकड़े 4B और 4C) के आयाम में पर्याप्त कमी के परिणामस्वरूप. प्रतिपक्षी CGP-55845 के बाद स्नान आवेदन सदा ही 5 कोशिकाओं 12 <से बाहर IPSC (5 की वसूली में हुई/ Sup>; आंकड़े 4B और 4C).

एक रिकॉर्डिंग पूरा किया गया था एक बार, एक के बाहर से बाहर पैच सफलतापूर्वक गठन, स्लाइस रातोंरात तय की और बाद में कल्पना और विश्लेषण दर्ज की कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और उनकी नयूरोचेमिकल मार्कर सामग्री का निर्धारण. चित्रा 5A एक प्रतिनिधि एफएस ई.पू. की आकारिकी दिखाता को प्रोसेस किया गया एक confocal खुर्दबीन पर प्राप्त संयुक्त छवि के ढेर के प्रक्षेपण में. पीवी सेल की अभिव्यक्ति एक सेल शरीर पर स्पष्ट इम्युनो संकेत और के समीपस्थ डेन्ड्राइट दिया कि immunocytochemical लेबलिंग में पुष्टि की गई और दर्ज biocytin लेबल सेल (चित्रा 5 ब). सेल के तीन आयामी पुनर्निर्माण फिजी सॉफ्टवेयर (चित्रा 5C) 17 में सरल neurite अनुरेखक प्लगइन का उपयोग सिले छवि के ढेर से प्रदर्शन किया गया था. अक्षतंतु में और Str के पास कोलेटरल के एक उच्च घनत्व दिखाया. pyramidale साथ और# 8220; कथित एक ई.पू. के रूप में इस सेल की पहचान करने, सीए 1 पीसी (चित्रा 5 ए, इनसेट) की somata के आसपास का गठन टोकरी ". इसके अलावा, सोमा के स्थानीयकरण के पास str के लिए. pyramidale और सीए 1 के सभी परतों फैले त्रिज्यात उन्मुख डेन्ड्राइट एफएस बीसी 10 के विशिष्ट रूपात्मक सुविधा के लिए अच्छी तरह से अनुरूप हैं.

संक्षेप में, पहचान एफएस पी.वी. + बीसी से प्राप्त पूरे सेल रिकॉर्डिंग में, हम इन कोशिकाओं बड़े आयाम गाबा बी आर मध्यस्थता धीमी IPSCs व्यक्त करने और उनके synaptic उत्पादन भी स्पष्ट रूप से प्रीसानेप्टिक गाबा बी रुपये की सक्रियता से हिचकते है कि प्रदर्शन किया है.

चित्रा 1
तीव्र hippocampal स्लाइस की संख्या 1 तैयारी. (ए) एक हौसले से विच्छेदित चूहे के मस्तिष्क. को बनाए रखने, मस्तिष्क के आसपास बर्फ नोट0 डिग्री सेल्सियस के पास पूरे मस्तिष्क का तापमान. (बी) एक Leica VT1200s vibratome पर 300 माइक्रोन हिप्पोकैम्पस स्लाइस के काटने. गोलार्द्धों cortical सतह पहली कट जाता है, ताकि गठबंधन कर रहे हैं. गोलार्द्धों और मस्तिष्क के स्लाइस काटने के बाद बर्फीले ACSF (तीर). (सी) के लगातार carbogenation आसपास के हलका बर्फ की बड़ी मात्रा में नोट गरम सूक्रोज-ACSF में ले जाया जाता है. स्लाइस खत्म कर दिया और केवल हिप्पोकैम्पस और overlying प्रांतस्था छोड़ने, अग्रमस्तिष्क और मध्यमस्तिष्क दूर करने के लिए छंटनी किए गए थे.

चित्रा 2
Interneurons से चित्रा 2 पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग. (ए) कक्ष के आसपास रिकॉर्डिंग विन्यास. प्रवाह और बहिर्वाह लामिना का प्रवाह करने के लिए एक करीबी को प्राप्त करने के लिए कक्ष के पक्ष का विरोध कर रहे हैं पर ध्यान दें. इसके अलावा दिखाई recordi हैंइलेक्ट्रोड एनजी, headstages पर मुहिम शुरू की है, और दोनों पक्षों पर जमीन इलेक्ट्रोड, साथ ही उद्देश्य बीच में (40x, पानी विसर्जन). (बी) vGAT-वीनस / YFP संकेत के कम बिजली epifluorescent छवि में एक टुकड़ा में हिप्पोकैम्पस के सीए 1. एक ही क्षेत्र (सी) आईआर डीआईसी इमेजिंग. बी और सी में तीर सेल शरीर परत में एक वीनस / YFP सकारात्मक interneuron संकेत मिलता है. (डी) पैनल बी में संकेत न्यूरॉन की सोमा के उच्च शक्ति IR-डीआईसी छवियों, पर डिंपल गठन एक निकट पैच पिपेट साथ एक परीक्षण वोल्टेज के कार्टून प्रतिक्रियाओं के साथ रिकॉर्डिंग एक पूरे सेल पैच दबाना (बाईं ओर) की स्थापना के प्रमुख चरणों के बाद सतह (ऊपर) और, पूरे सेल विन्यास (नीचे) में सेल. (ई) योजनाबद्ध चित्र पिपेट टिप (दाएं) पर प्रतिरोध निगरानी -pulse. शीर्ष पंक्ति: दूर सेल से स्नान में पिपेट; उच्च मध्यम: डिंपल गठन, एक के साथपल्स आयाम में कमी, प्रतिरोध में एक मामूली वृद्धि का संकेत है. लोअर मिडिल: Giga ओम मुहर गठन. वर्तमान पल्स आयाम नाटकीय रूप से कम हो जाता है कि ध्यान दें. केवल तेजी से कैपेसिटिव धाराओं पिपेट समाई मुआवजा दिया है पहले नाड़ी की शुरुआत और अंत में दिखाई दे रहे हैं. निचला: पूरे सेल रिकॉर्डिंग विन्यास पिपेट टिप के तहत झिल्ली पैच के माध्यम से तोड़ने के द्वारा हासिल की है. शुरुआत और श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा पहले नाड़ी के अंत में बड़ी लेकिन अपेक्षाकृत धीमी कैपेसिटिव धाराओं लागू किया जाता है कि ध्यान दें. (एफ) हाइपर के एक परिवार द्वारा हासिल एक एफएस में (ऊपर) और सीए 1 पीसी (नीचे) के प्रतिनिधि निशान, - depolarizing वर्तमान दालों के लिए (प्रोटोकॉल ऊपर दिखाया गया है). सीए 1 पीसी के बहुत धीमी फायरिंग की तुलना में इस FS में बहुत उच्च आवृत्ति मुक्ति नोट. सही पर insets: सीए 1 पीसी (ऊपर) और (काले रंग में पीसी एपी पर मढ़ा नीचे, ग्रे में,) FS-IN से एपी तरंग की तुलना करें, डि illustratingएपी और AHP की तरंग में fference.

चित्रा 3
चित्रा 3 भेषज यौगिक synaptic प्रतिक्रिया के विच्छेदन, एक है FS में धीमी गाबा बी आर मध्यस्थता IPSCs अलग. Str की सीमा पर रखा रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (पैच) के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा (ए) आईआर डीआईसी छवि,. oriens (मूल). और pyramidale (Pyr.) और str की सीमा पर अनुकरण इलेक्ट्रोड (Stim). radiatum (. रेड) और lacunosum-moleculare (एल एम) (बी) वाम:. रिकॉर्डिंग विन्यास के योजनाबद्ध चित्र. अधिकार: अति का एक परिवार द्वारा हासिल है FS में आरोपित वोल्टेज प्रतिक्रियाओं वर्तमान इंजेक्शन depolarizing को बाह्य उत्तेजना के जवाब में FS-IN से दर्ज (सी) प्रतिनिधि निशान.. ऊपर: यौगिकsynaptic प्रतिक्रिया एक भी प्रोत्साहन (50 वी तीव्रता 0.1 मिसे अवधि) द्वारा हासिल सामान्य ACSF में उत्पादन किया. उच्च मध्यम: DNQX (10 माइक्रोन) और D-AP-5 (50 माइक्रोन) के स्नान आवेदन के बाद monosynaptic IPSC अलग. निम्न मध्यम: फास्ट monosynaptic IPSCs स्नान करने gabazine के अलावा (10 माइक्रोन) निम्नलिखित अवरुद्ध है. नीचे: (200 हर्ट्ज पर) 5 उत्तेजनाओं की एक ट्रेन स्नान करने CGP के बाद आवेदन (5 माइक्रोन) (आरोपित ग्रे ट्रेस) द्वारा अवरुद्ध है जो IPSC (काला ट्रेस) की मध्यस्थता एक धीमी गाबा बी आर का पता चलता है.

चित्रा 4
में निरोधात्मक synaptic प्रसारण के प्रीसानेप्टिक मॉडुलन की चित्रा 4 विश्लेषण एक एक युग्मित FS-IN और सीए 1 पीसी जोड़ी से रिकॉर्डिंग बनती. (ए) वाम पैनल: दो रिकॉर्डिंग pipettes आईआर डीआईसी छवि, की सीमा <पर FS-IN पर समझौता छोड़ दिया उन्हें> Str. oriens (मूल). और pyramidale (Pyr.) और करीब Str के लिए एक सीए 1 पीसी पर समझौता सही. radiatum (रेड.). राइट पैनल:. रिकॉर्डिंग विन्यास का एक योजनाबद्ध, वर्तमान दालों के एक परिवार के लिए एफएस में (बाएं) और सीए 1 पीसी (दाएं) से प्रतिनिधि वोल्टेज प्रतिक्रियाओं के साथ (बी) प्रीसानेप्टिक में हासिल APs दिखा प्रतिनिधि निशान FS-IN (दाएं 5 माइक्रोन,) (ऊपर) और नियंत्रण की शर्तों के तहत सीए 1 पीसी में कम विलंबता एकात्मक IPSC (नीचे) (बाईं तरफ के निशान), Baclofen के स्नान आवेदन (10 माइक्रोन, मध्य) के बाद, और CGP के बाद आवेदन . CGP IPSC आयाम के एक लगभग पूरी वसूली में हुई जबकि Baclofen, 50% ~ द्वारा IPSC आयाम कम ध्यान दें. नियंत्रण निशान underlain दिखाए जाते हैं. IPSC आयाम (सी) समय पाठ्यक्रम साजिश Baclofen और CGP के प्रभाव को दर्शाता है. IPSCs 10 सेकंड के अंतराल पर दर्ज किए गए.

एस "> चित्रा 5
चित्रा 5 दृश्य, पुनर्निर्माण और एक biocytin लेबल दर्ज FS-ई.पू. के Immunocytochemical पहचान. (ए) एक confocal खुर्दबीन पर एक 20x उद्देश्य के साथ imaged एक है FS में छवियों के सिले के ढेर के एक प्रक्षेपण. somata Str की सीमा पर स्थित है. radiatum (रेड). और pyramidale (Pyr.) CA1 क्षेत्र अक्षतंतु के बहुमत में और सेल शरीर परत के आसपास पाया जाता है, जबकि डेन्ड्राइट, त्रिज्यात चलाने और सभी परतों अवधि की; बीसी के लिए विशिष्ट रूप में. स्केल बार: 100 माइक्रोन. आसपास ख्यात सीए 1 पीसी somata (नारंगी तारक) के गठन अक्षतंतु की ठेठ टोकरी दिखा एक 20 परतों की उच्च वृद्धि प्रक्षेपण,: इनसेट, शीर्ष सही. स्केल बार:. 10 माइक्रोन (ख) के biocytin से भरे सेल शरीर (सफेद pseudocolour, कम पैनल, तीर) (हरा, ऊपरी पैनल में) पीवी के लिए immunoreactivity से पता चलता है. स्केलबार:. सेल के 3 आयामी पुनर्निर्माण के 20 माइक्रोन (सी) प्रक्षेपण. सोमा और डेन्ड्राइट काले रंग में हैं और अक्षतंतु लाल रंग का. सीए 1 की परतें नीले रंग में चित्रित कर रहे हैं. लघुरूप: मूल, Str. oriens; Str, एलएम. lacunosum-moleculare. स्केल बार: 100 माइक्रोन.

नाम संगठन (मिमी) उपयोग नोट्स
सुक्रोज-ACSF 87 NaCl, 3 NaHCO, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 25 ग्लूकोज, 75 सूक्रोज, 7 2 MgCl, 0.5 2 CaCl, 1 ना पाइरूवेट, 1 ना एस्कॉर्बेट 2.5 KCl, 25 तैयारी और मस्तिष्क के स्लाइस की भंडारण पीएच = 7.4; परासारिता = ~ 350 mOsm
रिकॉर्डिंग ACSF 3 NaHCO, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 25 ग्लूकोज, 1 MgCl 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 2, 1 ना पाइरूवेट, 1 ना एस्कॉर्बेट मस्तिष्क के स्लाइस से रिकॉर्डिंग पीएच = 7.4; परासारिता = 310-315 mOsm
Intracellular समाधान (1) 125 कश्मीर gluconate, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl 2, 2 ना एटीपी, 0.3 ना जीटीपी, 1 ना phosphocreatine और 0.1% biocytin GABAB IPSC रिकॉर्डिंग के इलेक्ट्रोड भरना पीएच = 7.4; परासारिता = 295-305 mOsm
Intracellular समाधान (2) 105 कश्मीर gluconate, 40 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl 2, 2 ना एटीपी, 0.3 ना जीटीपी, 1 ना phosphocreatine और 0.1% biocytin बनती रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड भरना पीएच = 7.4; परासारिता = 295-305 mOsm
फॉस्फेट बफर (पंजाब) 100 मिमी नाह 2 पीओ 4 तय स्लाइस Rinsing = पीएच 7.4
फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 25 मिमी नाह 2 पीओ 4 </ उप>, 154 मिमी NaCl (डब्ल्यू 0.9% / वी) तय स्लाइस और एंटीबॉडी ऊष्मायन Rinsing = पीएच 7.4
Paraformaldehyde लगानेवाला 4% डब्ल्यू / Paraformaldehyde, 0.1 मिमी पंजाब वी मस्तिष्क के स्लाइस के फिक्सेशन = पीएच 7.4

तालिका 1 समाधान सूची.

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Discussion

हम कार्यात्मक विट्रो में morphologically- और neurochemically पहचान न्यूरॉन्स चिह्नित करने के लिए electrophysiological और neuroanatomical तकनीकों को जोड़ती है जो एक विधि का वर्णन; विशेष रूप से कॉर्टिकल निरोधात्मक आईएनएस के विभिन्न प्रकार के. प्रक्रिया के महत्वपूर्ण पहलुओं हैं: संभावित आईएनएस (1) के पूर्व चयन; (2) intracellular रिकॉर्डिंग और न्यूरॉन दृश्य; और अंत में (3) दर्ज आईएनएस की रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण. इस अध्ययन में विशेष रूप से पी.वी. भारतीय नौसेना पोत को संबोधित किया है, वर्णित प्रोटोकॉल कम से कम परिवर्तन के साथ किसी भी interneuron या अन्य neuronal प्रकार से इसी तरह की रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

cortical क्षेत्रों में interneurons की अपेक्षाकृत कम संख्या अत्यधिक अक्षम इन कोशिकाओं से यादृच्छिक चयन और रिकॉर्डिंग बनाता है. विभिन्न स्थानीयकरण और रूपात्मक सुविधाओं भेद और नियमित तौर पर कुछ interneuron प्रकार से रिकॉर्ड करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है. प्रशिक्षु की हालांकि स्लाइस में, पहचानमें और सेल शरीर परतों के पास eurons ऐसे एफएस इन के साथ के रूप में, मुश्किल बना हुआ है. विशिष्ट interneuron आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के आगमन, 2 और अधिक कुशल इन न्यूरॉन्स की पूर्व चयन और रिकॉर्डिंग बनाता है जो एक सुरुचिपूर्ण समाधान प्रदान करता है. अब कई ट्रांसजेनिक लाइनों, ज्यादातर चूहों, लेकिन तेजी से भी चूहों 13 interneurons की जांच की सुविधा उपलब्ध हैं. ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करते हैं, हालांकि, यह हद तक और पत्रकार अभिव्यक्ति की विशिष्टता स्थापित करने के लिए आवश्यक है.

सेलुलर लेबलिंग और आकृति विज्ञान, साथ ही electrophysiological रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता, गंभीर रूप से व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता स्लाइस पर निर्भर; जिसके लिए मस्तिष्क तेजी, (आदर्श 20-40 सेकंड) विच्छेदित बहुत ध्यान से और लगातार ठंडा संभाला जाना चाहिए. हम पाते हैं कि समग्र सोडियम एकाग्रता और न्यूरॉन्स के इस प्रकार excitability, नाटक कम हो जाता है जिससे सूक्रोज-ACSF, का उपयोगtically स्लाइस और interneuron अस्तित्व 18 की गुणवत्ता में सुधार. हालांकि, यह कई शोधकर्ताओं महान प्रभाव 10,11,15 को टुकड़ा तैयारी के लिए मानक रिकॉर्डिंग ACSF, का इस्तेमाल किया है कि प्रकाश डाला जाना चाहिए. रूपात्मक अखंडता स्लाइस 13 काट रहे हैं जिस पर कोण पर काफी निर्भर करता है; जो क्षेत्र और सेल प्रकार से भिन्न होता है. हालांकि, कई interneurons मज़बूती, अनुप्रस्थ राज्याभिषेक या बाण के समान स्लाइस से दर्ज किया जा सकता है. आगे डेन्ड्राइट और अक्षतंतु, गहरी ऊतक में कोशिकाओं आईआर डीआईसी गुणवत्ता और Giga ओम मुहर गठन की विश्वसनीयता त्याग हालांकि, लक्षित किया जाना चाहिए की विच्छेद कम करने के लिए. CA1 पिरामिड कोशिकाओं और दोनों से इन परिस्थितियों रिकॉर्डिंग के तहत FS-INS मज़बूती से प्राप्त किया जा सकता है.

लेबल और न्यूरॉन्स के दृश्य 30 मिनट या उससे अधिक समय तक चलने वाले एक ठेठ रिकॉर्डिंग सत्र के बाद हासिल की है. रिकॉर्डिंग कम से कम 30 मिनट के लिए पिछले है, यह जैव सक्षम करने के लिए निर्धारण करने से पहले इस बार की अनुमति आवश्यक हैcytin पूरा भरने और कोशिकाओं के इस प्रकार के बाद हॉक दृश्य गारंटी, बाहर का वृक्ष के समान और axonal प्रक्रियाओं में फैलाना.

पूरे सेल रिकॉर्डिंग में कम और स्थिर श्रृंखला प्रतिरोधों को बनाए रखने synaptic और आंतरिक गुणों का सही शारीरिक माप, साथ ही न्यूरॉन्स की संपूर्ण लेबलिंग करने के लिए आवश्यक है. हालांकि कम प्रतिरोध इलेक्ट्रोड पिपेट भीतर निहित intracellular समाधान के साथ कोशिका द्रव्य का तेजी से डायलिसिस अनुमति देते हैं. एटीपी के साथ intracellular समाधान सप्लीमेंट, जीटीपी और phosphocreatine निश्चित रूप से ऊर्जा की आपूर्ति और रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को बनाए रखने में मदद करता है. हालांकि, neurochemicals और प्रोटीन की डायलिसिस, कम प्रतिक्रियाओं को जन्म दे प्लास्टिसिटी 19 कम और भी नयूरोचेमिकल पहचान प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैं. उदाहरण के लिए पी.वी. लगातार लंबे समय तक के प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर न्यूरॉन्स के बाहर धोया जाता है. इसलिए, बाहर का वृक्ष के समान या axonal प्रक्रियाओं की परीक्षा देते करने के लिए आवश्यक हो सकता है दर्ज न्यूरॉन के rmine immunoreactivity. ऐसे डायलिसिस एक चिंता का विषय है, जहां इस तरह के मामलों, intracellular वातावरण में 20 संरक्षित करने के लिए उपयोग किया जा सकता छिद्रित पैच विन्यास का उपयोग रिकॉर्डिंग में, हालांकि पैच रिकॉर्डिंग के अंत या बाद में पूरे सेल विन्यास में "repatched" न्यूरॉन में तोड़ दिया जाना चाहिए biocytin भरने की अनुमति है.

दर्ज न्यूरॉन्स के औषधीय जांच आईएनएस की आंतरिक और synaptic गतिविधि को आकार देने में अलग neuromodulatory तंत्र के कार्यात्मक महत्व का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. ऊपर वर्णित विधि में, औषधीय अलगाव और बनती रिकॉर्डिंग क्रमशः, पोस्ट और प्रीसानेप्टिक गाबा बी आर की मध्यस्थता प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि एक बड़ी आसानी उदाहरण cannabinoid प्रणाली 21 के लिए, वैकल्पिक रिसेप्टर परिवारों की भूमिका का आकलन करने के लिए रिसेप्टर एगोनिस्ट और विरोधी के संयोजन संशोधित कर सकते हैं.

"> Histological और दर्ज कोशिकाओं के Immunocytochemical प्रसंस्करण प्रोटोकॉल स्थापित कर रहे हैं एक बार. यहाँ वर्णित immunocytochemistry प्रोटोकॉल नयूरोचेमिकल सामग्री की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के संयोजन के संबंध में, टुकड़ा मोटाई और आवश्यकता के साथ देखते किया गया है, अत्यंत विश्वसनीय है. हम सामान्य बकरी सीरम का उपयोग प्रयुक्त सभी माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी में उठाया जाता है. विकल्प के रूप में, यह एजेंट अवरुद्ध रूप में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) या दूध पाउडर का उपयोग करने के लिए भी संभव है. इस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करता है कि यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि वैकल्पिक रूप से एक बस पीबीएस के एवज में 0.1 एम पी बी इस्तेमाल कर सकते हैं. डिटर्जेंट की एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता का उपयोग (0.3% TritonX-100) टुकड़ा के पहले 100 माइक्रोन सतह परत में एंटीबॉडी के प्रवेश की अनुमति है, जबकि स्पष्ट प्रतिजनकता कम नहीं है , न्यूरॉन्स नियमित गहरी कोशिकाओं दर्ज कर रहे हैं. दर्ज की, या स्लाइस मोटा हो रहे हैं, जहां यह resecti को सलाह दी जाती हैस्लाइस पर, एक cryostat या एक vibratome का उपयोग, और पतली (40-70 माइक्रोन) वर्गों पर immunolabeling प्रदर्शन करते हैं. 300 माइक्रोन स्लाइस के लिए, एंटीबॉडी की एक लंबी ऊष्मायन (4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस की संरचनात्मक अखंडता की रक्षा करने के लिए) अत्यधिक विश्वसनीय immunocytochemical परिणाम पैदा करता है.

न्यूरॉन्स की पहचान रिकॉर्डिंग, बाद हॉक रूपात्मक और immunocytochemical विश्लेषण में प्राप्त संयुक्त जानकारी पर निर्भर करता है. हिप्पोकैम्पस में होने के कारण सख्त लामिना संगठन के लिए, axonal वितरण interneurons की पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों का एक अच्छा संकेत है. अक्षतंतु या डेन्ड्राइट कटे, हालांकि, पहचान मुश्किल या असंभव बना सकते हैं. इसके अलावा, कुछ अस्पष्टता समग्र axonal स्थानीयकरण में कारण समानता के लिए पी.वी. + बीसी और AXO-axonic interneurons, फर्क में उदाहरण के लिए, बनी हुई है. एक अंतिम निश्चित पहचान पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्य 1,3 ओ के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण की आवश्यकता होगीआगे immunocytochemical विच्छेदन 22 आर.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए इना Wolter का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. VGAT-वीनस ट्रांसजेनिक चूहों डीआरएस द्वारा उत्पन्न किया गया. डॉ ए Miyawaki द्वारा प्रदान pCS2-वीनस का उपयोग वाई Yanagawa, एम Hirabayashi और राष्ट्रीय शारीरिक विज्ञान के लिए संस्थान, Okazaki, जापान में वाई कावागुची,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer Ltd. DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 91 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तीव्र टुकड़ा पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग neuronal आकारिकी immunocytochemistry parvalbumin हिप्पोकैम्पस निषेध GABAergic interneurons synaptic प्रसारण IPSC गाबा बी रिसेप्टर
Morphologically- और Neurochemically पहचान Hippocampal interneurons से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग
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Booker, S. A., Song, J., Vida, I.… More

Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

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