Summary
皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。
Abstract
GABA作動性抑制性介在は、脳の神経回路内の中心的な役割を果たしている。介在ニューロンは、ニューロン集団（10〜20％）の小規模なサブセットを含みますが、その多様な機能を反映して、生理的、形態学的および神経化学的不均質性の高いレベルを示している。したがって、介在ニューロンの調査は、組織の原則と神経回路の機能に重要な洞察を提供しています。しかし、これは、個別の介在ニューロンの種類の選択と識別のための統合された生理学的および神経解剖学的アプローチが必要です。トランスジェニック動物の急性脳切片からの全細胞パッチクランプ記録、ニューロン特異的マーカーのプロモーターの下で蛍光タンパク質を発現し、標的とし、電気生理学的に、特定のニューロン型の内因性及びシナプスの特性を特徴付けるための効率的な方法を提供する。細胞内の色素の標識と組み合わせることで、このアプローチは、事後カ月で拡張することができますrphologicalおよび免疫細胞化学分析、記録されたニューロンの体系的な識別を可能にします。これらの方法は、皮質ニューロンの多様な種類の機能的特性に関する科学的問題の広い範囲に合うように調整することができる。
Introduction
海馬神経回路は、長い、それらの学習と記憶に重要な役割だけでなく、ヒトとげっ歯類の両方における空間ナビゲーションに、解剖学と生理学の両方に関して、厳しい調査の対象とされてきた。同様に、海馬の著名な、単純な層状の組織は、この領域の皮質ネットワークの構造的および機能的特性に取り組む研究の好ま対象になります。
海馬の回路は主要な興奮性細胞（> 80％）およびより小さな（10〜20％）が、抑制性介在1-3の非常に多様な集団から構成されている。介在ニューロンは、その高速なイオンチャネル型のGABA A受容体（GABA Aルピー）で作用軸索の端末と低速メタボの GABA B受容体（GABA Bルピー）からγ-アミノ酪酸（GABA）を放出4。これらの阻害のメカニズムは、励起を相殺し、主要な細胞の興奮性を調節するため、赤外線タイミング及び放電のパターン。しかし、介在ニューロンから放出されたGABAは、本人の細胞上ではなく、介在ニューロン自身5,6のみならず機能します。前とシナプス後受容体が介在ニューロンの多様な種類の中フィードバック調節および抑制の相互作用を媒介する。介在ニューロンネットワークにおけるこれらの阻害メカニズムは、異なる周波数7における特定の振動で、集団活動パターンの生成および整形の中心であると考えられる。
全細胞パッチクランプ記録は、固有の性質とニューロンのシナプスの相互作用の検査のために十分に確立された方法である。しかし、介在ニューロンの種類の高度な多様性のために、抑制性介在の調査は、記録された細胞の厳密な識別を必要とします。海馬介在ニューロンタイプが明確な形態的特徴および神経化学的マーカー発現によって特徴付けられるように、解剖学的および免疫細胞化学のE組み合わせxaminationは、正確な介在ニューロンのアイデンティティ6,8,9を決定するための手段を提供することができる。
本論文では、ゆっくりとGABA Bの特徴付けを可能にする、単一のニューロンまたはシナプス結合のペアからホールセルパッチクランプ記録は事後形態学的および免疫細胞化学分析に続いて、細胞内の標識を組み合わせた実験的なアプローチについて説明します受容体は特定さ介在ニューロンにおける阻害効果を媒介する。一例として、私たちはそのシナプス後の標的の細胞体および近位樹状突起の神経支配と「速いスパイク」（FS）ことを特徴としている介在ニューロンの一つの主要なタイプ、いわゆる「籠細胞」（BC）のサブセット、に焦点を当てる放電パターン、密細胞体層を覆う軸索、およびカルシウム結合タンパク質のパルブアルブミン（PV）10,11の発現。これらのニューロンは、大規模なシナプス後抑制電流だけでなく、著名な事前の表示GABA B R活性化12に応答して、それらのシナプス出力のシナプス変調。ここで説明される技術の組み合わせは、他の同定されたニューロンタイプのさまざまな内因性またはシナプスのメカニズムを調査するためにも同様に適用することができる。
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Protocol
倫理に関する声明：すべての手順や動物のメンテナンスが動物の保護に関する制度的なガイドライン、ドイツの動物保護法、欧州理事会指令609分の86 / EECに基づいて実施し、地元当局からガイドライン（ベルリン、T-0215/11 ）
急性海馬スライスの調製
- 皮質抑制性介在13の大部分をラベルVGATプロモーター下に蛍光ヴィーナス/ YFPタンパク質を発現するトランスジェニックラット（17から24日齢）を取る。ラットを首を切る。急速semifrozen、carbogenated（95％O 2/5％CO 2）のスクロースベースの人工脳脊髄液（スクロースACSF、 図1A）に脳（<40秒）を解剖。
- ゴーグルに搭載された、505nmのLEDランプ515発光フィルターで金星/ YFP蛍光のために解剖したラットの脳を評価する。
- 皮質の前頭三分の一を取り外し、勉強家エルム;すべてメスで、半球を分離する。以前に14を説明したように、脳を下に接着する平坦な表面を提供するために、皮質の背側表面を削除します。
- ビブラトーム上の海馬体の横方向のスライス（300μm）をカットし、半球がsemifrozenで囲む必要があり、ショ糖ACSF（ 図1B）14 carbogenated。吻側大脳皮質、中脳および脳幹の追加の領域を削除します。 carbogenated 35ºCに温め、スクロースACSFを含む浸水保持チャンバーに各スライスを転送します。
- 温めACSFに入る最後のスライス時から30分間、35ºCで回復するのスライスにしておきます。代謝プロセスを再活性化し、カット神経突起の再シールを容易にするためにこれを行います。そこで、ストレージ（ 図1C）を、室温に転送。
2の作製と記録ピペットの充填
- PuのガラスキャピラリーからのLLパッチピペットを濾過（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）を充填した際に2-4MΩのピペット抵抗が達成されるように、（細胞内標識化のための）0.1％ビオシチンを含む細胞内液を。その成分の劣化を防止するために氷上で冷却細胞内液を保管してください。
- 濃度（;ソリューションのリストを参照してくださいE R（のCl - ）= -61 mVの） -生理学的に関連の低いのClを含有する溶液とシナプス後電流を識別するためのパッチピペットを埋める。
- 濃度（E R（のCl - ）= -ペアの録音は、シナプス前受容体媒介応答を識別するために、低カルシウム2 +バッファシナプス前伝達物質の放出との干渉を防止するための能力だけでなく、4倍高いClでなどを有する細胞内液とパッチピペットを埋める-20 mV）は、信号対雑音薬理RESPの正確な評価を可能に観測されたのIPSC 5のを改善するためにonsiveness。濃度IPSC動態15を変化させることができる-のClの変更があることに注意してください。
FS-INSから3。全細胞パッチクランプ記録
- ACSFをCarbogenateと（また、吸引ライン、 図2Aを介して、記録室からACSFを除去する）蠕動ポンプを用いて、記録チャンバーに灌流システムフィードスルー。レコーディングに備えてセットアップ上のすべての機器の電源をオンにします。
- 録音室にスライスを移し、絹の単繊維を張ったプラチナリングで所定の位置に保持する。ポジションスライスCA1の地層（文字列）錐体の両方STRに2ピペットでアクセスを許可する、視野を垂直に実行されるようにします。放線とstr。同時にオリエンス （ 図2Cおよび4A）。
- セットアップ中に室を配置し、carbogenatedの灌流を開始し、温めた（32〜34℃）記録A5〜10ミリリットル/分の流速でCSF。
- 40倍対物倍率におけるIR-DIC光学の下でスライス品質を評価し、ディスプレイ上で見CCDカメラで可視化する。ラウンド、適度に対比さCA1錐体細胞（CA1のPC）が多数STRで見ることができても、適切なスライスの品質を前提としています。軽く滑らかでクレーター表面下20〜30ミクロン（ 図2C）の深さで錐体 。質の悪いスライスは、不均一なスライス面で、非常に対照的で、縮小または膨張した多数の細胞が含まれています。
- str内または近くには、大多細胞体を持つヴィーナス/ YFP（ 図2B）を発現するものとして落射照明下での推定のFS介在ニューロンを識別します。錐体 。より自分の形態学的整合性を維持するために、合理的に深いスライス内の細胞（50〜100ミクロン、 図2C）を選択します。
- ヘッドステージ上のピペットホルダーに記録電極をマウント。その後アプリLYチューブラインを介して、低、正圧（20〜30ミリバール）。スライスの表面にピペットを下げ、わずかに選択されたニューロンの中心にオフセット。
- 以前に14,16説明したようにホールセル記録の設定を取得し、参照することも2Dおよび2Eフィギュア ：
- 標的細胞：70〜80ミリバールに圧力を増やし、急速にちょうど選択したセル（ 図2D、上）の細胞体上のスライスを通してピペットを下げる。
- セルアプローチ（ 図2D、上）、その上に「ディンプル」を生成するために、細胞膜に対してピペットを押します。隣接セルのビオサイチンラベリングを防ぐために、迅速にこの手順を実行します。
- ギガオームシールを作成します。圧力を解放すると同時に、ピペットに20 mVの電圧指令を適用します。ギガオームシール（1-50GΩ; 図2D、底面および図2E中央）typic同盟国は急速に開発しています。いったん密封され、電圧指令として（通常は-70と-60 mVの間）に予想される静止膜電位を印加する。
- パッチを突破：密閉されると、負圧の短いパルスで膜パッチを破裂。それによって、全細胞構成（ 図2E、ボトム）を達成。
- 細胞全体のキャパシタンスと直列抵抗（R S）を補償する。 R sは 、通常、最大120分間5-20MΩと安定している。ブレイクスルー上の膜電位（V M）が -50 mVのより脱分極であれば細胞を放棄。 R Sが 30MΩより、最初は大きい。またはR Sは、記録の経過にわたって20％以上変化する。
- 電流パルス（-250 250 Paで、 図2F、上）脱分極にハイパーファミリーに（電流クランプモードの場合）、その応答によってFS-INSを特定します。 FS-INSは、比較的V M（通常は-50トンを脱分極しているO -60 mVの）、短い膜時定数（<20ミリ秒）と500 PAが周波数で活動電位（AP）を列に電流注入を脱分極に応答する>顕著である100Hzの11（ 図2F、下）、 CA1のPC（ 図2F、中央）とは異なる。
GABA B R媒介性応答を誘発する4。細胞外電気刺激
- strの境界にスライスにおける：;シナプス誘発反応を観察するためには、細胞外の刺激電極（0.1〜0.3MΩ抵抗2のNaClを充填したパッチピペット）を配置します。放線とstr。 lacunosum-moleculareは刺激アーティファクト（ 図3A）、細胞を直接電気刺激を防ぎ、最小限にするために細胞体に電極200〜300ミクロンの横方向の位置を調整します。
- 刺激電極が配置されると、のホールセル記録を得る選択したセルとセクション3.9（ 図3B）のように電流固定モードでの生理的な表現型を評価する。
- 電圧クランプ（V M -65 mVの）に記録ニューロンでは、孤立した定電圧刺激装置を使用して、50 V（〜500μA効果的な刺激）毎週20秒シナプス前軸索の電気刺激を提供します。 GABA B R仲介性IPSCを観察して、より大きな伝達物質の放出を生成するために複数の刺激（200 Hzで）の列車をインターリーブする単一の刺激（100μ秒の期間、 図3C、トップ）を使用します。
- 孤立した単シナプスIPSC（ 図3C、ミドルアッパーを）明らかにする：;：バスはイオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬（D-AP5 [50μM] NMDA受容体DNQX [10μM] AMPA受容体）を適用。さらに、GABA A Rブロッカーの適用とGABA B R媒介IPSCを隔離（gabazine [10μM]; 図3CミドルLワー）。
- GABA B（灰色でunderlain 図3C低い）CGP-55845 [5μm]とのその後の適用によりR媒介されているものとして、得られたスロー外向き電流（下図3C、拡張した）を確認
FS-INとCA1のPC結合シナプスの5ペア録音
- 以下に説明するようにシナプス結合のINとPCのペアの間で行われる同時録画、と抑制性シナプス伝達のGABA B R媒介シナプス前制御を評価する。
- まず、（セクション3のように）シナプス前ニューロンの細胞全体の記録を確立し、FS表現型（ 図4A）を確認。
- その後、近隣のCA1、PC（20〜100ミクロンの距離、 図4A）をパッチを適用し、APを引き出すために（電流クランプモードで開催された）シナプス前INに電流パルスを脱分極簡単な閾値上（1ミリ秒の継続時間、1-5 nAの振幅）を適用。シナプスの共同の場合nnection（約80％のR、Sを補償）電圧クランプで開催され、CA1 PC内のIPSCのIN結果のAPが存在する。
- 必要に応じて、接続が見つかるまで、さらにCA1パソコンから新しい記録電極と記録を埋める。
- 接続が確立されると、単一のシナプス応答と動的挙動の両方を評価するために、シナプス前FS-INでのAPの対を誘発する。 50ミリ秒間隔（ 図4B）で2脱分極刺激の典型的なペアのパルスプロトコルを使用してください。
- ベースライン条件の制御トレースを収集します。そして、このように完全に受容体媒介効果をブロックするために、アンタゴニストCGP-55845（5μM）に続いての GABA B Rsは、活性化、灌流ACSFに対して選択的なGABA B Rアゴニストのバクロフェン（10μM）を適用。各薬物の状態（ 図4BおよびC）の定常状態時に〜50トレースを収集します。
- 記録が完了すると、outsidを形成することにより体細胞膜をシール電子アウトパッチ：ゆっくりVクランプに細胞体からピペットを撤回とR Sの増加に伴い、mVの-40 V Mを減らす。アウトサイドアウトパッチの形成を促進するために、これを行います。その後浴からピペットを取り外します。
電気生理学的特性の解析6。
- 注：別のソフトウェアパッケージの群衆は電気生理学的データの取得のために用意されています。ここで、WinWCPは、無料のストラスクライド電気生理学ソフトウェア·パッケージ内のWindowsプログラムは、最大16のアナログ入力チャンネルの記録と10のデジタル信号の出力を可能にする、使用されている。
- ローパスフィルタ20 kHzで、すべての5〜10 kHzでのデータとサンプル。
- オフライン分析スイートとの生理学的データを分析します。
注：Stimfit、Pythonのシェルを含むオープンソースソフトウェア·パッケージは、このインスタンスで使用されている。しかし、他の選択肢を容易代わりに使用することができる。- 受動膜pを分析記録されたニューロンのroperties、静止膜電位から、電流クランプで取得された。
- 記録の最初から記録された応答のベースラインからの平均静止膜電位を測定します。
- 最小の過分極電流パルス（≤-50 pA）で、電圧応答から、オームの法則を使用して、入力抵抗を計算します。信号対雑音比、平均複数のトレースに信号を改善する。注：私たちの例では、一般的に10〜50の個別の掃引の平均である。
- 最小の過分極電流パルスに対する応答の減衰に次指数曲線を当てはめることによって見かけ上の膜時定数を推定します。
- しきい値を決定するために、活動電位波形、電流パルス脱分極の閾値レベルによって誘発された振幅（ピーク閾値）と期間（ハーフ高さで測定された幅）を分析します。
- 電圧クランプ記録からGABA B R仲介性IPSCを分析します。フィルタートレースオフラインで500ヘルツ（ガウシアンフィルタ）と、（少なくとも10のトレースの平均）でGABA B R媒介性応答のピーク振幅と遅延を評価する。
- ピークと前のベースラインとの間で測定GABA A R媒介性IPSCのピーク振幅の変化としてINSの抑制出力にGABA B Rs の影響を検出します。制御周期のため≥50トレースから平均振幅とすべての薬理学エポックの定常状態を計算します。
FSインの7。可視化と免疫細胞化学
- 記録後、4℃で0.1 Mリン酸バッファー（PB、pHは= 7.35）O / Nで4％パラホルムアルデヒドに浸漬してスライスを固定します。
- 必要なスライスは、PBに移し、加工前〜1週間まで保存することができる場合。
- 自由に新鮮なPB中、続いて0.9％NaClで0.025 M PB中ウォッシュスライス（PBS、pH値= 7.35）。
- 非特異的抗体結合を低減するために、foのスライスをブロック10％正常ヤギ血清（NGS）を含有する溶液中で、室温でrは1時間、0.3％トリトン-X100（膜を透過するための界面活性剤）および0.05％のNaN 3、PBS中で作製。
- PBS中で、NaN 3を 5％NGS、0.3％のTriton-X100、0.05％を含有する溶液中で希釈した抗-PVモノクローナルマウス抗体を使用して、PV発現のために標識する。 4℃12で2〜3日間、一次抗体をインキュベートする。 PBS中で徹底的にスライスをすすぐ。
- 蛍光抗マウス二次抗体を適用します（ 例：アレクサ-546。）ビオチン結合タンパク質ストレプトアビジンと一緒に、蛍光色素にコンジュゲート（ 例えば 、アレクサ-647）;そしてPBS中に希釈し、3％NGS、0.1％トリトン-X100、0.05％のNaN 3を含有する溶液中でインキュベートし、4℃でO / Nインキュベートする。
- たっぷりPB中2-3リンスに続いてPBSでスライス2〜3倍をすすぐ。スライドガラス上のスライスをマウントします。崩壊のスライスを防止するために、300μmの寒天スペーサーを使用してください。性蛍光物質で覆いスリップスライスネイルワニスセント封入とシール。
8。イメージングと可視化の再構築FSイン
- /金星のためのPVのためのアレクサ-546標識およびアルゴン488または515nmのためのヘリウムネオン543 nmの、適切なレーザライン（アレクサ-647用のダイオードレーザー635nmので励起fluorochomeレポーターで、走査型共焦点顕微鏡を使用してスライスを視覚化YFP）。
- 全細胞のZスタックを生成する（20X対物レンズを用いて、通常は0.5〜1ミクロンのステップ）は、適切なZ-解像度で画像を撮影する。複数のスタックは、通常の画像にデジタルでフィジー/ ImageJソフトウェア（ 図5A）を使用して、オフラインでステッチすることができ、全細胞を、必要とされる。
- （フィジー/ ImageJソフトウェアパッケージ17、 図Cにおける単純な神経トレーサープラグイン）半自動トレース法を用いたステッチ画像スタックからの細胞を再構築。
- 最後に、私のPV-免疫反応性を評価する高開口数の対物レンズ（60Xシリコン浸漬、NA = 1.3）でnterneuron。 PVの体細胞洗い出しが強すぎると細胞体の像、近位樹状突起と軸索の近位、あるいは軸索の端末を作成します。免疫標識はビオシチン標識された構造（ 図5B）と整列するように確認された場合、細胞を、PVのための免疫反応性とみなされる。
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Representative Results
但し、スライス品質はCA1 PCやFS-INSは、最小限の困難を伴って達成することができ、両方からの録音、かなり良いです。 VGATプロモーター13の下ヴィーナス/ YFPを発現するトランスジェニックラットのラインが明確にFS-INS、または実際のBCを識別しない。しかし、INSからの記録str内とその周辺。錐体 、FS-INSの密度は、FS-INS（ 図2B）を選択する可能性の高い結果1一般的に高い。 FS-INSは、CA1パソコンとRS-INSの両方とは異なるそれらの特徴的な生理学的特性によって区別することができる。彼らは比較的脱分極静止膜電位（-58.9±1.5 mVの、15細胞、対CA1パソコン、26細胞における-62.6±1.1 mVの）、低入力抵抗を持っている（92±12MΩ対103のPCが±14MΩ）と高速見かけの膜時定数（15.4±2.6ミリ秒対PCの中で22.0±2.7ミリ秒）、resul過分極電流パルス（ 図2F）への迅速な電圧応答内ティン。 FS-INSは、（振幅22.6±2.9 mVの平均）を非常に顕著に高速afterhyperpolarization続い比較的低振幅（82.8±1.0 mVの）の非常に短い活動電位（0.38±0.01ミリ秒）を排出する。 （左、図2D; 34から128 Hzの範囲82±10 Hz）を大脱分極電流パルス（250 pA）でに応じて、FS-INSは、高周波数で発射した。
FS-INSにおけるGABA B R媒介性シナプス後電流を評価するために、薬理学的に分離されたシナプス応答はSTRでの抑制性線維の細胞外刺激によって誘発された。放線/ lacunosum-moleculareボーダー。 図3を FS-IN、複合シナプス応答の構成要素の連続的な遮断は単シナプスGABA B R媒介遅いIPSCを分離した例を示している。シナプス応答は、イーライだったSTRに3-5刺激（200 Hzで配信50 Vの強さ、0.1ミリ秒の持続時間、）の単一の刺激や電車によって引用。 lacunosum-moleculare /放線ボーダー（ 図3A）。興奮性と抑制性の両方の構成要素（ 図3C、上 ）を含む初期化合物の応答が強く（： 図3C、ミドルそれぞれDNQX、10μMおよびAP-5、50μMの、）AMPAおよびNMDA受容体拮抗薬の浴適用によって減少した。 （ -これらの実験で、約-60 mV程度の逆転電位で、保持電位-65 mVので媒介現在の推定の内向きのCl）を、現在の遅い外向き（推定により媒介される残留単シナプスIPSCは内向き電流早く速く成る100 mVのに逆転近い電位とK +コンダクタンス）。選択的GABA A Rアンタゴニストgabazineの応用（SR-95531、10μM）を残して、速いIPSCを廃止遅いGABA B R媒介IPSC（ 図3C、下部、黒いトレース）を単離し;これは単一の刺激に応答して観察されたが、より明確に刺激の短い列に応答した。それは強力かつ選択的な拮抗薬CGP-55845（CGP、5μM、 図3C、下、灰色のトレース）によって遮断されたように、この応答は、GABA B R活性化K +コンダクタンスであることが確認された。 FSのBCは、典型的には、最近の刊行物12に示すように大きな振幅GABA B R媒介性IPSCを示す。
GABA B RSによってFS-IN抑制出力のシナプス前調節を評価するために、記録がシナプス結合されたFS-INとCA1 PCから行われたペアリング。以前に1,3に示すように、FSのBCをとのCA1 PC間のシナプス接続性は、比較的高い。以前に示したようにこれらの記録では、カップリング確率が近接セル対（≤5010μmの50％以上である。
記録は、アウトサイドアウトパッチが正常に形成され、完了した後、切片を一晩固定し、続いて視覚化し、分析し記録した細胞の形態を、それらの神経化学的マーカーの含有量を決定するために処理した。 図5Aは 、代表的な一FS BCの形態を示して共焦点顕微鏡で得られた合成画像スタックの投影中。 PVの細胞の発現は、細胞体と記録され、ビオシチンで標識した細胞（ 図5B）の近位樹状突起の上に明確な免疫シグナルを与えた免疫細胞化学的ラベリングで確認された。細胞の三次元再構成は、フィジーソフトウェア（ 図5C）17簡単な神経トレーサープラグインを使用してステッチ画像スタックから行われた。軸索は、strに近く担保の高密度を示した。錐体付き＆＃8220;と推定紀元前としてこのセルを識別する、CA1のPC（ 図5A、挿入図 ）の細胞体の周囲に形成されたバスケット」。また、strの近くソーマの局在。錐体とCA1のすべての層にまたがる放射状に指向樹状突起は、FSのBC 10の典型的な形態的特徴によく一致する。
要約すると、識別されたFSのPV +のBCから得た全細胞記録では、これらの細胞が大振幅の GABA B R媒介遅い性IPSCを発現し、それらのシナプス出力も著しくシナプス前GABA BとRs の活性化によって阻害されることを実証した。
急性海馬スライスの図1。調製（A）を、新たに解剖したラットの脳。維持し、脳を囲む氷に注意してください0℃付近脳全体の温度。ライカVT1200Sのビブラトーム上で300μmの海馬スライスの（B）のカット。半球の皮質表面が最初に切断されるように整列される。半球と脳スライスをカットした後、氷のACSF（矢印）。（C）の一定carbogenationを取り巻く雪解け氷を大量に注温めスクロースACSFに移動されます。スライスを裏返しだけ海馬とその上の皮質を残し、前脳と中脳を除去するためにトリミングされた。
図2の介在からの全細胞パッチクランプ記録。（A）室の周りに記録の設定。流入及び流出が層流に近いを達成するために、チャンバの両側にあることに注意してください。また、目に見えるrecordiです電極ngの、ヘッドステージ上に搭載し、両側の接地電極だけでなく、客観的な中央の（40X、水浸）。（B）VGAT-ヴィーナス/ YFP信号の低消費電力落射蛍光画像スライス内の海馬のCA1。同じ領域の（C）IR-DICイメージング。 BとCの矢印は、細胞体層中の金星/ YFPポジティブ介在ニューロンを示している。（D）パネルBに示されたニューロンの細胞体の高出力IR-DIC画像、ディンプルを形成近づいパッチピペットで表面（上）と、続いて、全細胞構成（ボトム）のセル。（E）の記録全細胞パッチクランプを確立する主要な段階を模式図（左側）試験電圧に漫画応答を有するピペットチップ（右側）の抵抗を監視する-pulse。一番上の行：離れて、細胞からの浴中のピペット;アッパーミドル：ディンプルの形成を伴うパルス振幅の減少、抵抗の穏やかな増加を示した。中央下：ギガオームシール形成。電流パルス振幅が劇的に減少していることに注意してください。ピペット容量が補償される前にのみ、高速容量性電流は、パルスの最初と最後に表示されます。下：ホールセル記録構成は、ピペットチップの下の膜パッチを突破することによって達成される。 FS-IN（上）とハイパーファミリーにより誘発さCA1 PC（下）の直列抵抗補償が適用される前にパルスの最初と最後に大きいが、比較的遅い容量性電流に注意してください。（F）代表痕跡 - 脱分極電流パルスに（プロトコルは、上の図を参照）。 CA1 PCのはるかに遅い発射に比べて、FS-INの非常に高い周波数の放電に注意してください。右側のインセット：CA1 PC（上）と、FS-INからのAP波形の比較（底部は灰色で、黒で、PC、AP上にオーバーレイ）、ジを示すAPとAHPの波形のfference。
図3。薬理学的化合物のシナプス応答の解剖、FS-INが遅いの GABA B R媒介性IPSCを分離する。 strの境界に配置された記録電極（パッチ）と、（A）記録チャンバー内のスライスのIR-DIC画像、。オリエンス （オリ）と錐体 （Pyrで。）とstrの国境でのシミュレーション電極（スティミュラス）。放線 （。ラッド）とlacunosum-moleculare（LM）、（B）左：。記録構成の模式図。右：現在の注射を脱分極するハイパーファミリーにより誘発さFS-INにおける重畳電圧応答（C）は 、細胞外刺激に応答して、FS-INから記録された代表のトレース。上：化合物シナプス応答は、単一の刺激（50 Vの強さ、0.1ミリ秒の持続時間）によって誘発された通常のACSFで生産。アッパーミドル：DNQX（10μM）とd-AP-5（50μM）の浴適用後の単シナプスIPSC絶縁型。ミドル下：速い単シナプス性IPSCは、お風呂にgabazine（10μM）の添加後にブロックされます。下：（200 Hzで）5刺激の列車がお風呂にCGPの後願（5μM）（重ね合わせた灰色のトレース）によってブロックされているIPSC（黒のトレース）仲介遅いの GABA B Rを明らかにする。
対になった結合されたFS-INとCA1、PC対から記録する抑制性シナプス伝達のシナプス前調節の図4。分析。 （A）左図：二つの記録ピペットのIR-DIC画像、<の境界でのFS-IN上にパッチ左に1 em>のSTR。オリエンス（オリ）と錐体 （Pyrで）近いSTRへのCA1、PC上にパッチ右。放線 （ラッド）。右パネル：。APを示す代表的なトレースがシナプス前のFS-INに誘発される電流パルスの家族へのFS-IN（左）と、CA1 PC（右）からの代表的な電圧応答（B）と記録的な構成の概略制御条件バクロフェンの浴適用後の（左上のトレース）、（10μM、中央）、およびCGPのその後のアプリケーション（右5μM）の下（上）と、CA1、PC（下）の短期の待ち時間ユニタリIPSC 。 CGPはIPSCの振幅のほぼ完全な回復をもたらしたのに対し、バクロフェンは、〜50％IPSCの振幅を減少させたことに注意してください。制御トレースはunderlainて示されている。IPSCの振幅の（C）経時プロットは、バクロフェンおよびCGPの効果を示す。性IPSCは、10秒間隔で記録した。
図5の可視化、復興とビオシチン-標識の免疫細胞化学的同定は、FS-BCを記録した。（A）共焦点顕微鏡での20倍の対物レンズで画像化FS-INの画像のステッチスタックの投影。細胞体は、strの境界に位置しています。放線 （ラッド）と錐体 （Pyrで。）CA1領域の軸索の大部分は細胞体層とその周辺発見された一方で、樹状突起は、放射状に実行し、すべての層にまたがる。 BCのためのような典型的な。スケールバー：100μmである。挿入図、右上：推定上のCA1 PCの細胞体（オレンジアスタリスク）の周囲に形成する軸索の代表的なバスケットを示した20層の高倍率プロジェクション、。スケールバー：10μmの（B）IN（白pseudocolour、下のパネル、矢印）のビオサイチンで満たされた細胞体は（緑、上のパネルで）PV用の免疫反応性を示している。スケールバー：20μmのセルの3次元再構成（C）の投影。ソーマと樹状突起は、黒と赤の色の軸索である。 CA1の層は青色で描かれている。略語：オリ、STR。オリエンス ; STR、LM。 lacunosum-moleculare。スケールバー：100μmである。
| 名前 | 組成（mM）の | 使用 | ノート |
| スクロースACSF | 87のNaCl、2.5のKCl、25のNaHCO 3、1.25のNaH 2 PO 4、25グルコース、ショ糖75、7のMgCl 2、0.5のCaCl 2、1ピルビン酸ナトリウム、1のNa-アスコルビン酸 | 調製および脳スライスのストレージ | でpH = 7.4;浸透圧=〜350オスモル |
| ACSFの記録 | 125のNaCl、2.5のKCl、25のNaHCO 3、1.25のNaH 2 PO 4、25グルコース、1のMgCl | 脳スライスからの記録 | でpH = 7.4;浸透圧= 310〜315 mOsmで |
| 細胞内液（1） | 125 K-グルコン酸、10のKCl、10 HEPES、10 EGTA、2のMgCl 2、2のNa-ATP、0.3のNa-GTP、1のNa-ホスホクレアチン及び0.1％ビオシチン | GABAB IPSC記録の電極を充填 | でpH = 7.4;浸透圧= 295から305ミリオスモル |
| 細胞内液（2） | 105 K-グルコン酸、40のKCl、10 HEPES、0.1 EGTA、2のMgCl 2、2のNa-ATP、0.3のNa-GTP、1のNa-ホスホクレアチン及び0.1％ビオシチン | 対になった記録のための電極を充填 | でpH = 7.4;浸透圧= 295から305ミリオスモル |
| リン酸緩衝液（PB） | の100mMのNaH 2 PO 4 | 固定スライスをすすぎ | pH値= 7.4 |
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS） | 25のNaH 2 PO 4 </ SUB>、154のNaCl（0.9％w / v）の | 固定スライスおよび抗体インキュベーションをすすぎ | pH値= 7.4 |
| パラホルムアルデヒド固定液 | 4％重量/パラホルムアルデヒド、0.1 mMのPB V | 脳切片の固定 | pH値= 7.4 |
表1。ソリューションの一覧。
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Discussion
私たちは、機能的にin vitroでmorphologically-と神経化学的に特定したニューロンを特徴づけるために、電気生理学的および神経解剖学的手法を組み合わせた方法を記載している。特に皮質抑制性INSの多様な種類の。手順の重要なポイントは以下のとおりです潜在的なインの（1）事前選択; （2）細胞内記録とニューロンの可視化;そして最後に、（3）記録されたINSの形態学的および免疫細胞化学分析。この研究は、特にPV-INSに対処していますが、記載されているプロトコルは、最小限の変更で、いずれかの介在ニューロンまたは他の神経型から同じような記録のために使用することができます。
皮質領域におけるニューロンの比較的低い数が非常に非効率的これらの細胞からランダムに選択して記録を行う。発散局在と形態学的特徴を識別し、日常的にいくつかの介在ニューロンタイプから録音する研究者を有効にしている。しかし、スライス、インターンの同定に細胞体層に近いeuronsは、FS-INSと同様に、依然として困難である。特定のニューロン集団に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス系統の出現は、はるかに効率的な2これらのニューロンの事前選択して記録を行う洗練されたソリューションを提供しています。今では多くのトランスジェニック系統、主にマウスが、ますますもラット13が介在ニューロンの調査を容易に利用可能である。トランスジェニック系統を使用する場合は、しかし、程度およびレポーター発現の特異性を確立するために不可欠である。
携帯ラベリングおよび形態の品質だけでなく、電気生理学的記録は、批判的に実行可能な、高品質のスライスに依存;脳が急速に切開する必要のある（理想的には20〜40秒）、非常に慎重に、継続的に冷却された処理されます。私たちは神経細胞の全体的なナトリウム濃度、したがって、興奮性が低減されるスクロースACSFの使用が判明、ドラマticallyはスライスと介在ニューロンの生存18の品質が向上します。しかし、それは多くの研究者が大きな効果を10,11,15に、スライス調製のための標準記録ACSFを利用してきたことを強調すべきである。形態学的整合性は、スライスが13を切っている角度に大きく依存します。どの領域および細胞型によって異なります。しかし、多くの介在ニューロンを確実に横方向、冠状または矢状スライスから記録することができる。さらに樹状突起と軸索の退職を最小限にするために、組織内のより深い細胞はギガオームシール形成のIR-DIC品質と信頼性を犠牲にすることはあるが、目標とされるべきである。これらの状況下では、両方のCA1錐体細胞およびFS-INSからの記録を確実に得ることができる。
ニューロンの標識および可視化は30分以上持続する典型的なレコーディング·セッション後に達成されている。記録は30分未満持続する場合、それはバイオを可能にするために、固定前に、この時間を確保することが必要である細胞の可視化を完全に充填を保証する、遠位樹状突起と軸索のプロセス中に拡散し、したがって、 事後にするcytin。
ホールセル記録では、低く安定した直列抵抗を維持することは、シナプスと本来の特性を正確に生理学的な測定だけでなく、神経細胞を徹底的にラベル付けすることが不可欠です。しかし、低抵抗電極は、ピペット内に含まれる細胞内液と細胞質の迅速な透析を可能にする。 ATPと細胞内液を補充する、GTPおよびクレアチンリン酸は確かにエネルギー供給と記録品質を維持するのに役立ちます。しかし、神経化学物質とタンパク質の透析は、減少した応答を引き起こす可塑19を減少させ 、また、神経化学的同定を妨げることができます。例えばPVは一貫して、より長い実験の過程で神経細胞の外に洗浄される。したがって、遠位樹状突起や軸索のプロセスの検査では、DETEが必要になる場合があり記録されたニューロンのrmine免疫反応性。透析が懸念される、穿孔パッチ構成を使用して記録が細胞内環境20を保持するために利用することができるような場合には、しかしながら、パッチは録音の終了またはその後全細胞構成において「repatched「ニューロンで破断しなければならないビオシチン充填を可能にする。
記録された神経細胞の薬理学的調査は、INSの内因性およびシナプス活性の形成に発散神経調節機構の機能的意義を評価するための有用な方法である。上記の方法において、薬理学的な単離および記録はそれぞれ、ポストシナプス前GABA B R-媒介効果を評価するために使用されるペアリング;しかし人は簡単例えばカンナビノイド系21、代替受容体ファミリーの役割を評価するために受容体アゴニストおよびアンタゴニストの組み合わせを変更することができます。
">組織学的および記録された細胞の免疫細胞化学的処理は、プロトコルが確立されたら、ここに記載さ免疫細胞化学プロトコルは神経化学的コンテンツを識別するために使用される抗体の組み合わせに対して、スライス厚及び要件に調整された、信頼性が高い。私たちは、正常ヤギ血清を利用する使用される全ての二次抗体は、ヤギに産生されるように、代替案としては、ブロッキング剤として、ウシ血清アルブミン（BSA）または粉乳を使用することも可能であり、このプロトコルは、抗体インキュベーションのためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用することに留意すべきである、スライスの最初の100μmの表面層への抗体の浸透を可能にしながら、しかしその代わり1は、単に、PBSの代わりに0.1MのPBを使用することができます。洗剤の比較的高濃度（0.3％トリトンX-100）を使用して、見かけ上の抗原性を減少させない、ニューロンは日常的により深い細胞が記録されている場合。記録された、またはスライスが厚くされる場合、それはresectiすることをお勧めしますスライス上、クライオスタットまたはビブラトームを使用して、薄い（40〜70ミクロン）切片上で免疫標識を行う。 300μmのスライスを、抗体の長いインキュベーション（4ºCでは、スライスの構造的完全性を維持するために）、信頼性の高い免疫細胞化学の結果を生成します。ニューロンの同定は、記録、 事後形態学的および免疫細胞化学分析で得られた結合された情報に依存しています。海馬では、厳格な層状組織に、軸索分布は介在ニューロンのシナプス後の標的の良い指標である。軸索や樹状突起を断絶したが、識別が困難または不可能にすることができます。さらに、いくつかのあいまいさが原因全体の軸索局在の類似性のために、PV +のBCと軸索axonic介在ニューロンを分化、例えば残る。最後の決定的な同定は、シナプス後のターゲット1,3 Oの電子顕微鏡分析を必要とするさらに免疫細胞化学的解剖22 r を 。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、彼女の優れた技術支援のための伊那ウォルターに感謝したい。 VGAT-ヴィーナストランスジェニックラットは博士によって生成された。博士A.宮脇により提供PCS2-金星を使用してY.柳川、M.平林およびY.川口生理学研究所において、岡崎、日本、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
