Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

Published: September 30, 2014 doi: 10.3791/51706
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Integrative Neuroanatomy, NeuroCure Cluster of Excellence, Charité Universitätmedizin

Summary

Кортикальные сети контролируется небольшой, но разнообразный набор тормозных интернейронов. Функциональное исследование интернейронов поэтому требуется целенаправленное запись и строгий идентификацию. Описанный здесь является комбинированный подход с участием цельноклеточная записи из одной или синаптически-связанных пар нейронов с внутриклеточным маркировка, ретроспективный морфологический и иммуноцитохимического анализа.

Abstract

ГАМКергические тормозных интернейронов играть центральную роль в нейронных цепях мозга. Интернейроны содержать небольшое подмножество нейронов населения (10-20%), но показать высокий уровень физиологической, морфологической и нейрохимические неоднородности, отражающие их разнообразные функции. Поэтому исследование интернейронов содержит важную информацию о принципах организации и функционирования нейронных цепей. Это, однако, требует комплексного физиологического и нейроанатомической подход к выбору и идентификации отдельных типов интернейронов. Весь-клеток патч-зажим записи с острыми срезах мозга трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентные белки по промоторов интернейронов-специфических маркеров, обеспечивает эффективный способ целевому и электрофизиологически характеризуют внутренние и синаптические свойства определенных типов интернейронов. В сочетании с маркировки внутриклеточного красителя, этот подход может быть расширен с пост-специальной месrphological и иммуноцитохимический анализ, что позволяет систематическое определение записанных нейронов. Эти методы могут быть адаптированы в соответствии широкий спектр научных вопросов, касающихся функциональных свойств различных типов нейронов коры.

Introduction

Гиппокампа нейронов схемы уже давно предметом пристального внимания, как по отношению к анатомии и физиологии, в связи с их важной роли в процессах обучения и памяти, а также пространственной навигации у человека и грызунов. Равным образом, заметным, но просто ламинарного организация гиппокампа делает этот регион любимым предметом исследований, посвященных структурные и функциональные свойства коры сетей.

Гиппокампа схемы состоят из возбуждающих главных клеток (> 80%) и в меньшей (10-20%), но весьма разнообразной когорте тормозных интернейронов 1-3. Интернейроны выпустить γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) от их аксонов, которая действует на быстро ионотропных рецепторов ГАМК А (ГАМК RS) и медленные метаботропные ГАМК B рецепторами (ГАМК B RS) 4. Эти ингибирующие механизмы противовеса возбуждение и регулируют возбудимость главных клеток, и, таким образомИК сроки и структура разряда. Тем не менее, ГАМК освобожден от интернейронов действует не только на главных клетках, но и на самих 5,6 интернейронов. До и постсинаптические рецепторы обеспечивают регулирование обратной связи и ингибирующие взаимных взаимодействий между различными типами интернейрон. Эти ингибирующие механизмы интернейронных сетей, как полагают, центральное место в генерации и формирования паттернов активности населения, в частности колебаний на разных частотах 7.

Цельноклеточная записи патч-зажим является хорошо признанным методом для исследования внутренних свойств и синаптических взаимодействий нейронов. Тем не менее, в связи с большим разнообразием типов интернейронов, исследование тормозных интернейронов требует строгого идентификации записанных клеток. Как гиппокампа типы интернейронов характеризуются различными морфологическими особенностями и нейрохимические экспрессии маркеров, в сочетании анатомических и иммуноцитохимического еxamination может служить средством для определения точного 6,8,9 интернейрон, удостоверяющий личность.

В настоящей работе мы описываем экспериментальный подход, в котором цельноклеточные записи патч-зажим от отдельных нейронов или синаптически-связанных пар в сочетании с внутриклеточной маркировки, а затем после специальной морфологического и иммуногистохимического анализа, что позволяет для характеристики медленного ГАМК B рецепторов опосредовано ингибирующие эффекты в определенных интернейронов. В качестве примера, мы ориентируемся на одного крупного типа интернейронов, подмножества так называемых «корзину клеток" (до нашей эры), который иннервирует сомы и проксимальных дендритов своих постсинаптических целей и характеризуется «быстрой пики" (FS) выполнять узор, аксон плотно закрывающую слой тела клеток и экспрессию белка парвальбумина кальция связывания (PV) 10,11. Эти интернейронов отображения больших постсинаптические ингибирующие токов, а также заметную предварительносинаптической модуляция их синаптической выходе, в ответ на ГАМК B R активации 12. Сочетание методов, описанных здесь, могут быть применены в равной степени, чтобы исследовать внутренние механизмы или синаптические в различных других определенных типов нейронов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

О себе Этика: Все процедуры и животных обслуживание были выполнены в соответствии с ведомственным руководящим принципам, Закон немецкий Animal Welfare, директиву Европейского Совета 86/609 / EEC о защите животных, и руководящие принципы от местных властей (Берлин, T-0215/11 )

1 Подготовка Острый-срезов гиппокампа

  1. Возьмите трансгенного крысу (с 17 по 24 день старый), выражая флуоресцентный Венера / YFP белок под vGAT промоутера, который маркирует большинство корковых тормозных интернейронов 13. Обезглавить крысу. Быстро анализировать мозг (<40 сек) в semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) на основе сахарозы искусственного спинномозговой жидкости (сахароза-ACSF, рис 1А).
  2. Оценивать расчлененный мозг крысы для Венера / YFP флуоресценции с 505 нм LED лампы и 515 фильтр выбросов, установленного на пару очков.
  3. Снимите фронтальную треть коры и CerebEllum; Затем отделить полушария, все с помощью скальпеля. Снимите спинной поверхности коры, чтобы обеспечить плоскую поверхность приклеить мозг вниз, как описано выше 14.
  4. Вырезать поперечных срезов (300 мкм) гиппокампа на vibratome, полушария должны быть окружены semifrozen, carbogenated сахароза-ACSF (Рисунок 1В) 14. Удалить дополнительные регионы ростральной коры, среднего мозга и ствола мозга. Трансфер каждый ломтик в подводном удерживающей камере, содержащей сахарозу-ACSF, который carbogenated и нагревают до 35 °.
  5. Оставьте ломтики восстановить при 35 ° С в течение 30 мин с момента последнего среза, поступающего в подогретое ACSF. Сделайте это для того, чтобы реактивировать обменные процессы и облегчить восковые колпачки из срезанных нейронных процессов. Затем передать комнатной температуре в течение хранения (рисунок 1С).

2 Изготовление и Заполнение Запись пипетки

  1. PuLL патч-пипетки из стеклянных капилляров, так что сопротивление пипетки 2-4 МОм достигается при наполнении фильтровали (шприцевой фильтр, размер пор: 0,2 мкм) внутриклеточный раствор, содержащий 0,1% biocytin (для внутриклеточного маркировки). Держите внутриклеточный решение охлажденное на льду для предотвращения деградации его составляющих.
  2. Заполните патч-пипетки для идентификации постсинаптических токов с раствором, содержащим физиологически соответствующую низкую концентрации Cl - (Е Р (Сl-) = -61 мВ, см список раствор).
  3. Для парные записи, чтобы определить пресинаптические рецепторы опосредованные ответы, заполните патч пипетки с внутриклеточной раствора с низкой Ca 2 + буферной емкости, чтобы предотвратить вмешательство в высвобождения трансмиттера пресинаптически, а также 4 раза выше Cl - концентрация (E R (Cl-) = -20 мВ), чтобы улучшить отношение сигнал-шум наблюдаемых ИПСК 5 позволяющих точно оценить фармакологической соответственноonsiveness. Заметим, что изменение Cl - концентрация может изменить IPSC кинетики 15.

3 Всего сотовый патч-зажим Запись с FS-INS

  1. Carbogenate в ACSF и корма через систему перфузии в камеру записи, с помощью перистальтического насоса (который также удаляет ACSF из камеры записи через линию всасывания, Фиг.2А). Включите все оборудование на установке для подготовки к записи.
  2. Трансфер кусочек для записи камеры и удерживать на месте с платиновым кольцом, натянутой с отдельных волокон шелка. Расположите кусочек так, чтобы слой (ул.) Pyramidale АК1 работает вертикально через поле зрения, позволяя доступ с 2 пипеток как к ул. radiatum и ул. Ориенс одновременно (Цифры 2C и 4А).
  3. Поместите камеру установки и начать перфузии carbogenated и нагревают (32-34 оС) записи AКСФ при скорости потока 5-10 мл / мин.
  4. Оценка качества среза под ИК-ДИК оптики при 40-кратном увеличении объективного, и визуализировать с ПЗС-камерой увидеть на дисплее. Предположим, хорошее качество среза, если большое количество круглых, умеренно контрастных СА1 пирамидальных клеток (СА1 PC) можно увидеть в ул. pyramidale на глубине 20-30 мкм ниже гладкой и слегка кратерами поверхность (Рисунок 2C). Бедные ломтики качества содержат большое количество высококонтрастных, усохшие или опухшие клеток, с неровной поверхностью среза.
  5. Определить предполагаемые FS интернейронов под эпифлуоресцентной освещения как те, которые выражают Венера / YFP (Рисунок 2B), с большим многополярного somata в или вблизи ул. pyramidale. Выделите ячейки разумно глубоко в срезе (50-100 мкм, рис 2С) для того, чтобы лучше сохранить их морфологический целостность.
  6. Установите электрод записи в держатель пипетки на headstage; Затем приложениелы низкой, избыточное давление (20-30 мбар) через трубки линии. Опустить пипетки на поверхность среза, с небольшим смещением от центра выбранного нейрона.
  7. Получить конфигурацию записи цельноклеточную, как описано выше 14,16 и смотри также рис 2D и 2Е:
    1. Цель ячейку: Повысить давление до 70-80 мбар и быстро опустить пипетку через срез, чтобы чуть выше сомы от выбранной ячейки (Рисунок 2D, сверху).
    2. Подойдите к ячейке: Нажмите пипетку против клеточной мембраны, чтобы произвести "ямочка" на нем (Рисунок 2D, сверху). Выполните этот шаг быстро, с тем чтобы предотвратить biocytin маркировки соседних ячеек.
    3. Создать уплотнение гига-ом: Ослабить давление и одновременно применить команду 20 мВ напряжения для пипетки. Уплотнение гига-ом (1-50 ГОм; Рисунок 2D, снизу и фиг.2Е среднего) Typicсоюзником стремительно развивается. После запечатаны, применяются ожидаемого мембранный потенциал покоя (обычно между -70 и -60 мВ) в качестве команды напряжения.
    4. Перерыв через патч: После запечатаны, разрыв мембраны патч с коротким импульсом отрицательного давления; обеспечивая тем самым конфигурацию целой клетки (рис 2E, внизу).
  8. Компенсировать цельноклеточную емкость и сопротивление серии (R S). R с, как правило, 5-20 МОм и стабильной до 120 мин. Отказаться от клетки, если мембранный потенциал (V M) на прорыве более деполяризованная чем -50 мВ; R S изначально больше, чем 30 МОм; или Р С меняется более чем на 20% в течение записи.
  9. Определить FS-INS по их реакции (в режиме ток-зажим) в семье гипер чтобы деполяризующими импульсы тока (-250 до +250 Па, рис 2F, вверху). FS-INS уже относительно деполяризованы V M (обычно -50 то -60 мВ), короткие мембрана постоянная времени (<20 мс) и ответить на 500 Па деполяризующими подачу тока с поездом потенциалов действия (APS) на частотах> 100 Гц 11 (Рисунок 2F, снизу), которые заметно отличаются от тех, в СА1 ПК (Рисунок 2F, средний).

4 Внеклеточная Электростимуляция вызвать ГАМК B R-опосредованных ответов

  1. Для наблюдения синаптически вызвали ответы, позиционировать внеклеточный стимуляции электрод (патч пипетка наполненная 2 М NaCl сопротивление: 0,1-0,3 МОм) в срезе на границе ул. radiatum и ул. lacunosum-moleculare. Расположите электрод 200-300 мкм сбоку от сомы, чтобы предотвратить прямой электрической стимуляции клетки и минимизировать стимуляции артефактов (Рисунок 3А).
  2. После стимуляции электрод расположен, получить запись вся-клетоквыбранная ячейка и оценить физиологическое фенотип в режиме ток-зажим, как в разделе 3.9 (Рисунок 3В).
  3. С нейрона, записанной в фиксации потенциала (V M -65 мВ), поставить электрическую стимуляцию пресинаптических аксонов в 50 В (~ 500 мкА эффективным стимулом) каждые 20 сек, используя изолированную стимулятор постоянного напряжения. Используйте одну стимулы (100 мкс длительность, 3С, сверху), чтобы наблюдать ГАМК B R опосредованных ИПСК, и чередовать с поездов нескольких раздражителей (при 200 Гц), чтобы произвести большее высвобождение передатчика.
  4. Ванна применять ионотропных антагонистов рецептора глутамата (АМРА рецепторов: DNQX [10 мкМ]; рецептора NMDA: д-AP5 [50 мкМ]), чтобы выявить изолированный моносинаптического IPSC (3С, средний верхний). Далее изолировать ГАМК B R-опосредованной IPSC с применением ГАМК R блокатора (gabazine [10 мкМ]; 3С среднего лАуэр).
  5. Подтверждение полученного медленно наружу ток (Рисунок 3C ниже, расширен) как ГАМК B R-посредничестве последующего нанесения CGP-55845 [5 мкМ] (3С ниже, залегает в серый)

5. Парные Записи синаптически Связанные FS-IN и CA1 ПК

  1. Оценка ГАМК B R-опосредованной пресинаптическое контроль тормозной синаптической передачи с одновременной регистрации, выполняемых между синаптически разобрана и ПК пар, как описано ниже.
  2. Во-первых, создать запись цельноклеточную из пресинаптического интернейрон (как в разделе 3) и подтвердить FS фенотип (Рисунок 4а).
  3. Тогда залатать соседнюю СА1 ПК (20-100 расстояния мкм, 4А) и применять краткий сверхпороговой деполяризующего импульсы тока (1 мсек продолжительность, 1-5 амплитудные Na) в пресинаптической IN (состоится в режиме ток-зажим), чтобы вызывать точки доступа. Если синаптической сотрудничествать соединение присутствует, точек доступа в результат в в ИПСК в СА1 ПК, состоявшейся в фиксации потенциала (компенсировать R S примерно до 80%).
  4. При необходимости заполнить новый электрод записи и запись из дальнейших ПК СА1, пока соединение не будет найден.
  5. После того, как соединение установлено, вызывают пары точек доступа в пресинаптической FS-IN для оценки как унитарную синаптическую реакцию и динамическое поведение. Используйте стандартный протокол парных импульсов 2 деполяризующих стимулов с 50 мс интервала (Рисунок 4B).
  6. Соберите управления следы в исходных условиях. Затем применять селективные ГАМК B R агониста баклофен (10 мкм) с перфузии ACSF, таким образом, активации ГАМК B Rs, после чего антагониста CGP-55845 (5 мкм), чтобы полностью блокировать опосредованную рецептором эффекты. Сбор ~ 50 следов в установившемся состоянии каждого условия наркотиков (фиг.4В и C).
  7. После завершения записи, печать соматическую мембрану путем формирования outsidE-патч из: Медленно вывести пипетку из тела клетки в V-зажимом и как S возрастает R, уменьшить V М до -40 мВ. Сделайте это, чтобы способствовать формированию внешнего отъезда патча; затем снимите пипетки из ванны.

6 Анализ электрофизиологических свойств

  1. ПРИМЕЧАНИЕ: множество различных пакетов программного обеспечения доступны для приобретения электрофизиологических данных. Здесь WinWCP, программа для Windows в состав бесплатного пакета Стратклайд электрофизиологии Software используется, который позволяет записывать до 16 каналов аналогового ввода и вывода 10 цифровых сигналов.
  2. Фильтр низких частот все данные 5-10 кГц и образец при 20 кГц.
  3. Анализ физиологических данных с ванной анализа офф-лайн.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Stimfit, пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом, которая включает в себя оболочку Python, используемый в данном случае; Однако другие альтернативы может быть легко использован вместо.
    1. Анализ пассивный мембранный рСВОЙСТВА записанных нейронов, приобретенные в токовых клещей, от мембранный потенциал покоя.
    2. Измерение среднего мембранный потенциал покоя от базовой линии записанных ответов от начала записи.
    3. Рассчитать входное сопротивление, используя закон Ома, из ответа напряжения до мельчайших импульсов гиперполяризующих тока (≤ -50 Па). Для улучшения отношения сигнал-шум, средних нескольких следов. Примечание: наши примеры, как правило, в среднем 10-50 отдельных циклах.
  4. Оцените кажущуюся время мембраны постоянного путем установки моноэкспоненциальное кривую к распаду ответов на самых маленьких импульсов гиперполяризующих тока.
  5. Анализ потенциала действия сигнала для определения порога, амплитуду (порог до пика) и длительность (ширина измеренная на половине высоты), вызванную порогового уровня деполяризующей импульсы тока.
  6. Анализ ГАМКв R опосредованных ИПСК из зажима напряжения записей. Фильтр прослеживает офф-лайн в500 Гц (фильтр Гаусса) и оценить пиковую амплитуду и латентность ГАМК B R опосредованной реакции (в среднем не менее 10 следов).
  7. Обнаружение эффекта ГАМК B рупий на ингибиторной выходе ИНС, изменения пиковой амплитуды ГАМК R-опосредованных ИПСК измеренных между пиком и предыдущей базовой линии. Рассчитать среднее амплитуду от ≥50 следов за период регулирования и стационарного всех фармакологических эпох.

7 Визуализация и Иммуноцитохимия ФС-Ins

  1. После записи, исправить ломтики погружением в 4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере (PB, рН = 7,35) O / N при 4 ° С.
  2. При необходимости ломтики могут быть переданы в ПБ и хранили в течение до ~ 1 недели перед обработкой.
  3. Ломтики Вымойте либерально в свежем ПБ и впоследствии в 0,025 М PB с 0,9% NaCl (PBS, рН = 7,35).
  4. Для снижения неспецифической связывания антитела, блокировать ломтики FOR 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки (NGS), 0,3% Triton-X100 (моющее средство, чтобы проницаемыми мембранами) и 0,05% NaN 3, выполненный в PBS.
  5. Чтобы пометить для выражения PV, использовать анти-PV Мышиные моноклональные антитела, разбавленного в растворе, содержащем 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, в PBS. Инкубируйте первичных антител в течение 2-3 дней при 4 ° С 12. Промыть срезы тщательно в PBS.
  6. Применение флуоресцентные анти-мышиные вторичные антитела (например, AlexaFluor-546.) Вместе с биотин-связывающий белок стрептавидин, конъюгированный с флуорохромом (например, AlexaFluor-647); и инкубируют в растворе, содержащем 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, разбавленного в PBS и инкубируют O / N при 4 ° С.
  7. Обильно промойте кусочки 2-3 раза с PBS с последующим 2-3 полосканий в ПБ. Установите ломтики на стеклах. Используйте агар прокладку 300 мкм для предотвращения кусочек от коллапса. Обложка нескользящей ломтики с fluoresцент монтажа средних и печать с лаком-лаком.

8 изображений и Реконструкция визуализированных FS-Ins

  1. Представьте ломтики с помощью сканирующей конфокальной микроскопии, с fluorochome репортера возбужденного с соответствующим лазерной линии (лазерного диода 635 нм для AlexaFluor-647; гелий-неоновый 543 нм для AlexaFluor-546 маркировки для PV и аргона 488 или 515 нм для Венеры / YFP).
  2. Съемку на соответствующем Z-разрешением (как правило, 0,5-1 мкм с шагом, с использованием объектива 20х) с получением Z-стек всей клетки. Несколько стеки обычно требуется, чтобы изображение всю ячейку, которая может быть цифровой сшитые офф-лайн с использованием Фиджи / ImageJ программное обеспечение (фиг.5А).
  3. Реконструировать ячейку из сшитого стека изображений с использованием метода полу-автоматического слежения (Простой плагин нейритов Tracer на Фиджи / ImageJ программного пакета 17, Рисунок C).
  4. Наконец, оценки PV-иммунореактивности в Interneuron с высокой числовой апертурой объектива (60X кремний-погружения, NA = 1,3). Сделайте образы сомы, проксимальных дендритов и проксимального аксон, или альтернативно из аксонов, если соматическое смыв PV является слишком сильным. Клетки считаются иммунореактивны для PV, если иммуно-маркировки видно, чтобы выровнять с biocytin меченных структур (Рисунок 5б).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При условии, что качество ломтик заметно хорошее, записи из обоих CA1 ПК и FS-модули могут быть достигнуты с минимальными трудностями. Трансгенных крыс линии выражая Венера / YFP под vGAT промоутер 13 не однозначно идентифицировать FS-Ins, или действительно БЦ. Однако записи с КН в и вокруг ул. pyramidale, где плотность FS-INS, как правило, высокий 1, приводит к высокой вероятности выбора FS-INS (Рисунок 2B). FS-INs можно отличить по характерным физиологическим свойствам отличаются от свойств обоих СА1 ПК и RS-INS. Они имеют относительно деполяризованную мембранный потенциал покоя (-58,9 ± 1,5 мВ, а 15 клеток, против -62,6 ± 1,1 мВ в СА1 ПК, 26 ячеек), низким сопротивлением входного (92 ± 12 МОм против 103 ± 14 МОм в ПК) и быстро очевидным постоянная времени мембраны (15,4 ± 2,6 мс против 22,0 ± 2,7 мс в ПК), Resulтин в оперативном реагировании на напряжения до гиперполяризацию импульсы тока (Рисунок 2F). FS-INs выписан очень краткие потенциалы действия (0,38 ± 0,01 мс) с относительно низкой амплитуде (82,8 ± 1,0 мВ), а затем очень видного быстрой гиперполяризации (средняя амплитуда 22,6 ± 2,9 мВ). В ответ на импульсы большой деполяризующих тока (250 Па), FS-INs обжигают при высоких частотах (82 ± 10 Гц, радиус 34-128 Гц; Рисунок 2D, слева).

Для оценки ГАМК B R-опосредованной постсинаптические токи в FS-Ins, фармакологически изолированные синаптические ответы вызванное внеклеточным стимуляции тормозящих волокон на ул. radiatum / lacunosum-moleculare границы. На рисунке 3 показан пример FS-IN, в которой последовательное блокада компонентами мер соединение синаптической изолирует моносинаптического ГАМК B R-опосредованной медленный IPSC. Synaptic ответы были Элипривел одиночными стимулами или поездах 3-5 стимулов (интенсивности 50 V, 0,1 мсек, произнесенной на 200 Гц) до ул. lacunosum-moleculare / radiatum границы (3А). Первоначальная реакция соединение в том числе и возбуждающих и тормозных компонентов (Рисунок 3C, сверху) сильно сократилась по применению бани антагонистов АМРА и NMDA рецепторов (DNQX, 10 мкм и AP-5, 50 мкм, соответственно: Рисунок 3C, в центре). Остаточная моносинаптического IPSC состоит рано быстро входящего тока (предполагаемый внутрь Cl - опосредованный ток на проведение потенциального -65 мВ, с разворота потенциала примерно -60 мВ, в этих экспериментах) и медленнее наружу ток (при посредничестве предполагаемого K + проводимость с разворота потенциал, близкий к 100 мВ). Применение селективного ГАМК R антагониста gabazine (SR-95531, 10 мкмоль) отменила быстрый IPSC, оставляяизолировали медленно ГАМК B R-опосредованной IPSC (Рисунок 3C, дно, черный след); которое наблюдалось в ответ на стимуляцию одного, но более четко в ответ на коротких поездов раздражители. Этот ответ был подтвержден как ГАМК B R-активации К + проводимости, как это было заблокировано мощной и селективный антагонист CGP-55845 (CGP, 5 мкм, фиг.3С, нижней, серый трассировки). FS BCs обычно показывают большие амплитуды ГАМК B R-опосредованной ИПСК, такие как показано в нашей недавней публикации 12.

Для оценки пресинаптическое регулирование FS-IN ингибиторной продукции по ГАМКв рупий, парные записи были произведены в период с синаптически-связанных FS-В и СА1 ПК. Синаптические связи между ФС БЦ и СА1 ПК является относительно высоким, как было показано ранее 1,3. В этих записей, как показано выше, вероятность того, муфта более 50% между близко расположенными парами клеток (≤50 мкм; 5. Тем не менее, это сильно зависит от типа интернейронов рассматривается. Связь была проверена либо с длиной деполяризующей инжекции тока (100 мсек, ≥ 500 Па) или в поезде коротких импульсов деполяризующих (1 мсек, 1-5 нА, до 10 импульсов, поставляемых при 20 Гц) вызывая точку доступа каждый. Точек доступа в пресинаптических интернейронов вызвало быстрый ГАМК R-опосредованной ИПСК с короткой задержкой, быстрый рост и распад в синаптически-связанных компьютеров. При парных импульсов (2 импульсов на 20 Гц) были применены, синапс показал краткосрочную депрессию (отношение Парные импульса <1) 1. В примере элемента, показанного, приложение ванна из ГАМКв R агонистов баклофен (2-10 мкМ) привело к существенному снижению амплитуды первой IPSC (Рисунки 4B и 4C). Последующая заявка ванна антагониста CGP-55845 неизменно привело к восстановлению IPSC (5 из 5 ячеек 12 </ SUP>; Фигуры 4В и 4С).

После записи была завершена, за выход патч успешно сформирован, срезы фиксировали в течение ночи, а затем обрабатываются для визуализации и анализа морфологии записанных клеток и определить их содержание нейрохимических маркеров. 5А иллюстрирует морфологию одного представителя FS BC в проекции в сочетании стеков изображения, полученных от конфокального микроскопа. Выражение лица ячейки ФВ была подтверждена в иммуноцитохимического маркировки, который дал четкое иммуно-сигнала по телу клетки и проксимальных дендритов записаны и biocytin меченных клеток (5В). Трехмерная реконструкция ячейки была выполнена из сшитых стеки с помощью простого плагина нейритов Tracer в Фиджи программного обеспечения (Рисунок 5C) 17. Аксон показал высокую плотность залогов в и около ул. pyramidale с &# 8220; корзины "образованные вокруг somata АК1 ПК (рисунке 5А, вставка), предположительно выявления эту ячейку как до нашей эры. Кроме того, локализация сомы рядом с ул. pyramidale и радиально ориентированные дендриты, охватывающие все слои СА1 хорошо соответствуют типичной морфологической особенностью FS BCS 10.

Таким образом, в целом-клеток, полученных из записей идентифицированного FS PV + БЦ, мы показали, что эти клетки экспрессируют большой амплитуды ГАМК B R-опосредованной медленные ИПСК и их синаптических выход также заметно ингибируется активацией пресинаптических ГАМК B Rs.

Рисунок 1
Рисунок 1 Подготовка острых срезов гиппокампа. () Недавно расчлененный головного мозга крысы. Обратите внимание на лед, окружающую мозг, поддерживаятемпература всего головного мозга около 0 ° С. (Б) Режущая 300 мкм срезах гиппокампа на vibratome Leica VT1200s. Полушария выровнены так, чтобы поверхности коры режется первый. Обратите внимание на большое количество мокрый лед окружающей полушарий и постоянное carbogenation из ледяной ACSF (стрелка). (C) После резки ломтиками мозга перемещаются в подогретой сахароза-ACSF. Срезы перевернулся и поправили удалить переднего и среднего мозга, оставляя только гиппокамп и облегающего кору.

Рисунок 2
Рисунок 2 Цельноклеточная записи патч-зажим от интернейронов. (А) Конфигурация записи вокруг камеры. Примечание приток и отток находятся на противоположных сторонах камеры для достижения близко к ламинарного потока. Также видна являются recordiнг электродов, установленных на headstages, а электроды с двух сторон, а также цель (40X, вода-погружение) в середине. (B) с низким энергопотреблением эпифлуоресцентной образ / сигнал vGAT-Венера YFP в СА1 гиппокампа в срезе. (С) ИК-ДИК изображений одной и той же области. Стрелки на B и C указывают на положительный интернейрон Венера / YFP в слое тела клетки. (D) Мощные ИК-ДИК изображения сомы нейрона, указанной в панели Б, с приближающейся патч пипетки, образующего ямочка на поверхность (сверху) и, впоследствии, клетка в конфигурации цельноклеточная (внизу). (E) Схематическое изображение основных этапах создания целой клетки записи патч-зажим (левая сторона) с ответами мультфильмов на испытательном напряжении -pulse контроля сопротивления на кончике пипетки (справа). Верхний ряд: Пипетка в ванне от клетки; Высший средний: Впадина образование, сопровождаетсяуменьшение амплитуды импульса, что указывает на умеренное увеличение сопротивления. Ниже среднего: формирование Giga-ом уплотнение. Следует отметить, что амплитуда импульса тока резко уменьшается. Могут видеть только в начале и в конце импульса до пипетка емкость компенсируется быстрые емкостные токи. Внизу: конфигурация записи Цельноклеточная достигается пробив мембраны патч под кончика пипетки. Обратите внимание, что большие, но относительно медленные емкостные токи в начале и конце импульса до компенсации сопротивления серии применяется. (F) Представительства следы FS-IN (вверху) и СА1 ПК (внизу), вызываемые семье гипер - для импульсов деполяризующими тока (показано выше протокол). Обратите внимание на очень высокой частоты разряд FS-IN по сравнению с гораздо более медленными стрельбе из СА1 ПК. Вставки справа: Сравнение сигнала AP от СА1 ПК (вверху) и FS-IN (нижней, в серый, накладывается на ПК AP в черном), иллюстрирующие диfference в форме волны ЗС и МАИ.

Рисунок 3
Рисунок 3 Фармакологическое рассечение ответ соединения синапсов, изолируя медленные ГАМК B R-опосредованной ИПСК в FS-IN. (А) ИК-ДИК изображение среза в записи камеры, с регистрирующего электрода (Patch) размещены на границе с ул. Ориенс (Ori.) и pyramidale (Pyr.) и электрод моделирование (Стим) на границе ул. radiatum (. Rad) и lacunosum-moleculare (LM) (B) Слева:. Схематическое изображение конфигурации записи. Справа: Наложение ответы напряжения в FS-IN вызываемые семье гипер чтобы деполяризующими текущие инъекции (в) представитель следы записанных с FS-IN в ответ на внеклеточной стимуляции.. Топ: Соединениесинаптического ответа производится в нормальном ACSF, вызванной одной стимула (интенсивность 50 В, 0,1 мсек). Ближний верхний: Изолированные моносинаптического IPSC после применения бани DNQX (10 мкм) и д-AP-5 (50 мкм). Ближний ниже: Быстрые моносинаптические ИПСК блокируется после добавления gabazine (10 мкм) в ванну. Внизу: поезд из 5 стимулов (при 200 Гц) показывает медленный ГАМК B R опосредованное IPSC (черный след), которая блокируется при последующем применении CGP (5 мкм) в ванну (накладывается серый трассировки).

Рисунок 4
Рисунок 4 Анализ пресинаптической модуляции тормозной синаптической передачи в паре записи с сочетании FS-IN и CA1 ПК пары. (A) Левая панель: ИК-ДИК изображение из двух записывающих пипеток, слева один заплата на FS-IN на границе < EM> ул. Ориенс (Ori.) и pyramidale (Pyr.) и право исправлена ​​на более СА1 ПК ближе к ул. radiatum (Рад.). Правая панель:. Схема конфигурации записи, с представительными ответов напряжения от FS-IN (слева) и СА1 ПК (справа) в семье импульсов тока (B) Характерные следы, показывающие точки доступа вызвал в пресинаптических FS-IN (вверху) и короткого задержки унитарное IPSC в СА1 ПК (внизу) в контрольных условиях (следы на левой), после применения ванны баклофена (10 мкм, в центре), и последующее применение CGP (5 мкМ, справа) . Обратите внимание, что баклофен уменьшало амплитуду IPSC на ~ 50%, в то время как CGP привело к почти полному восстановлению амплитуды IPSC. Следы управления показаны залегает. (С) Время Конечно участок амплитуды IPSC показан эффект, баклофен и CGP. ИПСК были записаны в 10-секундными интервалами.

с "> Рисунок 5
Рисунок 5 Визуализация, реконструкция и иммуноцитохимический идентификация biocytin меченных записал FS-н. (А) проекция сшитые штабеля образов FS-IN изображаемого с целью 20X на конфокальной микроскопии. Somata находится на границе ул. radiatum (Рад.) и pyramidale (Pyr.) из области СА1, дендриты запустить радиально и охватывают все слои, в то время как большинство аксона находится внутри и вокруг слоя тела клетки; как типичные для БЦ. Шкала бар: 100 мкм. Врезка, вверху справа: большое увеличение проекции 20 слоев, показывая типичные корзины аксона, образуя вокруг предполагаемого СА1 PC somata (оранжевые звездочки). Измерительная линейка:. 10 мкм (Б) biocytin заполненный корпус из клеток в (белый pseudocolour, нижняя панель, стрелка) показывает иммунореактивность для PV (в зеленом, верхняя панель). Масштаббар:. 20 мкм (C) Проекция 3-мерной реконструкции ячейки. Сома и дендриты в черно-аксон красного цвета. Слои СА1 очерчены синим цветом. Сокращения: Ори, ул. Ориенс; LM, ул. lacunosum-moleculare. Шкала бар: 100 мкм.

Имя Состава (мМ) Использование Примечания
Сахароза-ACSF 87 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 глюкозы, 75 сахароза, 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 1 Na-пирувата, 1 Na-аскорбиновая кислота Приготовление и хранение срезах мозга рН = 7,4; осмолярность = ~ 350 мОсм
Запись ACSF 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 глюкозы, 1 MgCl 2, 1 Na-пирувата, 1 Na-аскорбиновая кислота Запись с срезах мозга рН = 7,4; осмолярность = 310-315 мОсм
Внутриклеточный раствор (1) 125 K-глюконат, 10 KCl, 10 HEPES, 10 ЭГТА, 2 MgCl 2, 2 Na-АТФ, 0,3 Na-GTP, 1 Na-фосфокреатин и 0,1% biocytin Заполнение электроды GABAB IPSC записей рН = 7,4; осмолярность = 295-305 мОсм
Внутриклеточный раствор (2) 105 K-глюконат, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 ЭГТА, 2 MgCl 2, 2 Na-АТФ, 0,3 Na-GTP, 1 Na-фосфокреатин и 0,1% biocytin Заполнение электроды для парных записей рН = 7,4; осмолярность = 295-305 мОсм
Фосфатном буфере (PB) 100 мМ NaH 2 PO 4 Промывка фиксированных срезов рН = 7,4
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) 25 мМ NaH 2 PO 4 </ Суб>, 154 мМ NaCl (0,9% вес / объем) Промывка фиксированных срезов и антитела инкубации рН = 7,4
Параформальдегид фиксатор 4% вес / объем параформальдегида, 0,1 мМ PB Фиксация срезах мозга рН = 7,4

Таблица Список 1. Решения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы опишем метод, который сочетает электрофизиологические и нейроанатомической методы функционально охарактеризовать morphologically- и нейрохимически-выявленных нейронов в пробирке; в частности, различные виды корковых тормозных модулей. Ключевые аспекты процедуры являются: (1) предварительный отбор потенциальных КН; (2) внутриклеточные записи и нейрон визуализации; и, наконец, (3) морфологические и иммуноцитохимический анализ записанных КН. Несмотря на то, что это исследование обратилась PV модули, в частности, описано протокол может быть использован для аналогичных записей из любого интернейронов или других типов нейронов, с минимальным изменением.

Относительно низкое число интернейронов в областях коры делает случайный выбор и запись с этих клеток крайне неэффективными. О расходящихся локализация и морфологические особенности позволили исследователям различать и регулярно записывать с некоторыми типами интернейронов. Однако в срезах, идентификация стажераeurons в и около слоев тела клетки остается сложной, например, с FS-КН. Появление трансгенных линий мышей, выражая флуоресцентные белки в конкретных групп населения интернейронных предлагает элегантное решение, которое делает предварительный отбор и запись этих нейронов гораздо более эффективных 2. Сейчас многие трансгенные линии, в основном мышей, но все более и крыс 13 доступны, содействия осуществлению расследования интернейронов. При использовании трансгенных линий, однако, важно установить степень и специфику выражения репортера.

Качество сотовой маркировки и морфологии, а также электрофизиологические записи, критически зависит от жизнеспособных срезов, высокие качества; для которых мозг должен быть быстро рассекают (в идеале 20-40 сек), обрабатываются очень тщательно и непрерывно охлаждается. Мы обнаружили, что использование сахароза-ACSF, в результате чего общая концентрация натрия и, таким образом, возбудимость нейронов уменьшается, драматически улучшает качество ломтиками и межнейронных выживания 18. Тем не менее, следует отметить, что многие исследователи использовали стандартный записи ACSF для подготовки среза, с большим эффектом 10,11,15. Морфологические целостность сильно зависит от угла, под которым ломтики сократить 13; который зависит от региона и типа клеток. Тем не менее, многие интернейронов может быть надежно записаны от поперечных, корональных или сагиттальных. Для дальнейшей минимизации разрыве дендритов и аксона, клетки глубже в ткани должны быть направлены, хотя жертвуя ИК-ДИК качество и надежность формирования гига-ом уплотнения. В этих условиях записей из обеих СА1 пирамидальных клеток и FS-модули могут быть надежно получены.

Маркировка и визуализация нейронов достигнуто следующее типичного сеанса записи прочного 30 минут или дольше. Если записи длиться менее 30 минут, необходимо, чтобы на этот раз до крепление для включения биоcytin диффундировать в дистальной дендритных и аксонов процессов, гарантируя полное заполнение и, следовательно, после специальной визуализации клеток.

В цельноклеточных записей, сохраняя низкие и стабильные сопротивлений серии Необходимо точного физиологического измерения синаптических и внутренних свойств, а также тщательного маркировки нейронов. Однако с низким сопротивлением электродов позволяют быстро диализ цитоплазме с внутриклеточным раствором, содержащейся в пипетку. Дополняя внутриклеточный раствор с АТФ, ГТФ и фосфокреатин, безусловно, помогает поддерживать энергоснабжение и качество записи. Тем не менее, диализ нейрохимических веществ и белка может приводить к снижению ответов, уменьшается пластичность 19, а также может помешать нейрохимический идентификацию. Например П.В. последовательно промывали из нейронов в течение более длительных опытах. Таким образом, исследование дистальных дендритных процессов или аксонов может потребоваться Dete rmine иммунореактивность записанного нейрона. В таких случаях, когда, например диализ имеет значение, записи с использованием конфигурации с перфорацией-патч может быть использован для сохранения внутриклеточного среду 20, однако патч должен быть разорван в конце записи или нейрона затем "repatched" в конфигурации цельноклеточной чтобы заполнение biocytin.

Фармакологическое исследование записанных нейронов является полезным методом для оценки функциональной значимости расходящихся нейромодуляторных механизмов в формировании внутренней и синаптической активности коренных народностей. В способах, описанных выше, фармакологическая изоляции и парные записи используются для оценки почтовые и пресинаптических ГАМК B R-опосредованных эффектов, соответственно; Однако можно легко изменить комбинацию агонистов и антагонистов, чтобы оценить роль альтернативных семей рецепторов, например системы 21 каннабиноидов.

"> Гистологические и иммуноцитохимическая обработки записанных клеток обладает высокой надежностью, когда протоколы установлены. Протокол иммуноцитохимия описано здесь, был настроен по отношению к комбинации антител, используемых, толщина среза и требование, чтобы определить содержание нейрохимических. Мы используем нормальной козьей сывороткой а все вторичные антитела, используемые выращиваются в козла. В качестве альтернативы, также возможно использовать бычий сывороточный альбумин (BSA) или обезжиренное молоко, как блокирующих агентов. Следует отметить, что этот протокол использует забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) для антител инкубации Однако в альтернативном варианте можно было бы просто использовать 0,1 М PB вместо PBS. Использование относительно высокую концентрацию моющего средства (0,3% Тритон Х-100), не уменьшает видимую антигенность, позволяя при этом проникновение антител в первую мкм поверхностного слоя среза 100 , где обычно записывается нейроны. При более глубокие клетки записываются или ломтики толще, желательно, чтобы resectiна ломтики, использу криостат или vibratome, а также выполнять Анализ иммунного на шлифах (40-70 мкм). Для 300 мкм ломтиками, длиной инкубация антитела (при 4 ° С, чтобы сохранить структурную целостность ломтиков) производит высоконадежные иммуноцитохимических результаты.

Идентификация нейронов зависит от комбинированного информации, полученной в записи, ретроспективный морфологического и иммуногистохимического анализа. В гиппокампе, благодаря жесткому организации ламинарного, аксонов распределение является хорошим показателем постсинаптических целями интернейронов. Severed аксон или дендритов, однако, может сделать идентификацию трудно или невозможно. Кроме того, некоторая неясность остается, например, в дифференциации PV + БЦ и ОВБ-аксонального интернейронов, в силу схожести в общей аксонов локализации. Окончательное Окончательное определение потребует электронный микроскопический анализ постсинаптических целевых 1,3 уплотнительноег дальнейшее иммуноцитохимический рассечение 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Ina Вольтер за отличную техническую помощь. VGAT-Венера трансгенные крысы были получены докторами. Ю. Янагава, М. Hirabayashi и Y. Кавагути в Национальном институте физиологических наук, Окадзаки, Япония, используя PCS2-Венера, предоставленную д-ра А. Miyawaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer Ltd. DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).

Tags

Neuroscience выпуск 91 электрофизиологии острый срез записи цельноклеточная патч-зажим нейронов морфология иммуноцитохимия парвальбумина гиппокамп ингибирование ГАМКергические интернейронов синаптическая передача IPSC ГАМК-Б рецепторов
Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Booker, S. A., Song, J., Vida, I.… More

Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter