Abstract
Der er gjort betydelige fremskridt i fastlæggelsen af mekanismen for mitokondrie-RNA redigering i trypanosomer. Ligeledes er der gjort betydelige fremskridt med at identificere de dele af editosome kompleks, der katalyserer RNA redigering. Men det er stadig ikke klart, hvordan disse proteiner arbejder sammen. Kemiske forbindelser opnået fra en high-throughput skærm mod editosome kan blokere eller påvirke et eller flere trin i redigeringen cyklus. Derfor vil den identifikation af nye kemiske forbindelser generere værdifulde molekylære prober for dissekere editosome funktion og montage. I tidligere undersøgelser, blev in vitro redigering analyser udføres ved hjælp af radio-mærket RNA. Disse assays er tidskrævende, ineffektiv og uegnet til højt gennemløb formål. Her en homogen fluorescens-baserede "mix og måle" hammerhoved-ribozymet in vitro reporter analysen til overvågning RNA-redigering, præsenteres. Kun som følge af RNA-redigering afhammerhoved-ribozym fluorescens resonans energi overførsel (FRET) oligoribonucleotid substrat undergår spaltning. Dette vil til gengæld resulterer i adskillelse af fluorophoren fra quencheren, hvorved der frembringes et signal. I modsætning hertil, når editosome funktion hæmmes, fluorescenssignalet vil blive standset. Dette er et yderst følsomt og enkelt assay, som skulle være generelt anvendelig til at overvåge in vitro-RNA-redigering eller high throughput screening af kemikalier, som kan hæmme editosome funktion.
Introduction
Processen af RNA redigering, en post-transkriptionel mRNA modifikation, blev først opdaget i trypanosomatids 1. Siden da har et stort arbejde udført i at studere mekanismen bag RNA redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en række af enzymatiske reaktioner, har editosome, en kerne sammensat af omkring 20 proteiner skaber modne mitokondrielle mRNA'er for flere komponenter i den energiproducerende oxidative phosphorylering system. Rækkefølgen af katalytiske begivenheder er spaltning i kernen, uridylate (U) tilføjelse eller sletning, og ligatur, som dikteret af vejledning RNA'er (gRNAs) 4..
Ud over de centrale editosome komplekse proteiner, har en række tilbehørsprodukter faktorer også blevet identificeret 5-7. Disse proteiner er for det meste set grupperes i selvstændige komplekser. Men rækkefølgen af protein samling i kernen editosome kompleks og samspillet mønstre af kernen kompleks med tilbehøretkomplekser er endnu ikke fastlagt. Målretning RNA redigeringsprocessen i trypanosomatids kan give kemiske dissektorerne, at støtte i at studere montering og funktion af editosome kompleks. Desuden har funktionelle undersøgelser af flere editosome proteiner vist væsentlighed på tværs af forskellige livsstadier, med angivelse af deres potentiale som lægemiddelkandidater 8-12. Derfor kan de fundne hæmmere af editosome også fungere som lead forbindelser mod trypanosomatids. Det er rettidig, som lægemidler øjeblikket er til rådighed mod sygdomme forårsaget af trypanosomatid er giftige, ineffektive og dyre 13,14.
En effektiv og praktisk in vitro assay er nødvendigt at undersøge den kemiske univers for specifikke inhibitorer, der blokerer RNA-redigering. Tre assays er blevet udviklet og anvendt til at overvåge editosome aktiviteter: (a) fuld runde in vitro RNA-redigering assay 15, (b) pre-spaltes in vitro RNA-redigering assay 16,17, ennd (c) hammerhoved ribozym (HHR)-baserede assay 18. De første to assays afhængige direkte visualisering af det redigerede produkt (ATPase 6-mRNA) ved hjælp af radioaktivitet. HHR-assay anvender en modificeret version af ATPase 6-mRNA, der er modelleret til at opføre sig som et ribozym ved redigering. Den funktionelle ribozym så specifikt spalter et radioaktivt mærket RNA substrat, der tjener som en reporter. For nylig Moshiri et al. Udviklet en 'mix og måle' HHR-baserede in vitro reporter analysen til overvågning RNA-redigering, hvor det radioaktivt mærkede RNA underlaget er erstattet med en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) substrat 19. De vigtigste fordele ved dette assay, er: (a) det er en hurtig og bekvem blanding og måling type assay, da produktionen af aktivt ribozym og substrat spaltning forekomme samtidigt i det samme rør i lavt volumen (dvs. 20 ul), (b ) den undgår anvendelsen af radioaktivt mærkede materialer (c) følsomhed, der er enfforded ved fluorescens instrumentering i en mikro-titerplade format og (d) et højt signal-støj-forhold. Ved hjælp af denne analyse blev effekten af kendte RNA redigering ligase hæmmere mod renset editosome bekræftet 19. Dette eksperiment valideret assay for hurtig identifikation af RNA-redigering hæmmere, primært mod hele editosomes fra T. brucei.
Figur 1 er en detaljeret trin-for-trin skematisk af fluorescens-baserede in vitro-RNA-redigering assay. Denne protokol kan enten anvendes til overvågning af RNA-redigering in vitro eller let kan tilpasses til screening af sammensatte biblioteker af forskellige skalaer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor beskriver fremgangsmåden til udførelse af fluorescens-baserede RNA-redigering assay. Assayet kan udføres i en enkelt PCR-rør, 96-brønds eller 384 brønds-plader, afhængigt af omfanget af eksperimentet. Efterfølgende fluorescenssignalet kan læses på en egnet real time PCR detection system. Assayet her er beskrevet i forbindelse med 384-brønds plader.
1.. Dyrkning T. brucei Cells
- Forbered et vækstmedium til T. brucei procyklisk danner celler. For 1 I medium:
- 25,4 g SDM-79 pulver opløses i 800 ml miliQ vand.
- Tilsæt 2 g NaHCO3 og pH til 7,3 med 10 M NaOH.
- Tilføj nanorent vand til et slutvolumen på 900 ml, filter steriliseres.
- Tilføj føtalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin-opløsning og hemin (2,5 mg / ml) til slutkoncentrationer på 10% (v / v), 100 U / ml og 7,5 mg / L hhv.
- Grow 300 ml T. <em> brucei 1.7A vildtype (procyklisk form) celler ved 28 ° C, rysten ved 70 rpm til en tæthed på 1,5 x 10 7 celler / ml. BEMÆRK: Dette skal producere 3 ml aktiv editosome med ~ 0,5 mg total protein, tilstrækkelig til 600 redigering reaktioner.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 6.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Vask pelleten med 50 ml kølet PBSG puffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2PO 4, 145 mM NaCl og 6 mM glucose) og spin ned cellerne igen ved centrifugering ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
2.. Isolering af Crude Mitokondrier
NB: Alle trin skal udføres på is eller ved 4 ° C for at bevare editosome aktivitet.
- Resuspender høstede celler i 30 ml DTE-buffer (1 mM Tris-HCI pH 8,0 og 1 mM EDTA). Anvend en 40 ml steril Dounce homogenisator (forafkølet) at forstyrre cellemembranen ved at kæle op og ned mindst 10 gange på is. Straks tilføje 4,3 ml af 60% sucrose (w / v, dvs 1,75 M) til homogenatet til en endelig koncentration på 0,25 M. Der centrifugeres ved 15.800 xg i 10 minutter ved 4 ° C, til fortrinsvis at nedbringe mitokondrier.
- Resuspender mitochondrial pellet i 4,6 ml STM-buffer (20 mM Tris-HCI pH 8,0, 250 mM saccharose og 2 mM MgCI2). Tilføj 13.8 pi 0,1 M CaCl2 og 4 pi RNase-fri DNase I til slutkoncentrationer på 0,3 mM, og 9 U / ml. Inkubér blandingen i 1 time på is.
- Tilføj 4,6 ml STE-buffer (20 mM Tris-HCI pH 8,0, 250 mM sucrose og 2 mM EDTA) for at inaktivere DNase I. centrifugeres ved 15.800 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes i 400 pi lysisbuffer (10 mM Tris-HCI pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCI, 1 ug / ml pepstatin, 1 mM DTT, og 1x komplet EDTA-fri proteaseinhibitor) og overføres til en mikrofugerør.
- Tilsæt 10% Triton X-100 til en slutkoncentration på 1%nd inkubere lysatet i 15 minutter ved 4 ° C på et rør rotator.
- Fjern mitokondrie lysat ved centrifugering to gange ved 17.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C; fastholde klarede supernatant hver gang.
3.. Editosome Oprensning
- Hæld 10 ml 10% -30% (v / v) lineær glycerolgradient (tabel 1) i et ultracentrifugerør hjælp 2x HHE gradient buffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCI, og 2 mM EDTA) og en gradient maker ved at følge brugsanvisningen.
- Fjern forsigtigt 500 ml af opløsningen fra toppen af glycerolgradient og forsigtigt lægge 500 ul af blokerede mitokondrie lysat. Centrifugering ved 178.000 xg i 6 timer ved 4 ° C ved hjælp af en ultracentrifuge.
- Saml pi fraktioner 500 sekventielt fra toppen til bunden af gradienten ved 4 ° C. Derefter snap fryse fraktionerne ved hjælp af flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Anneale de respektive DNA-template indeholdende sekvens komplementær til T7-promotor-sekvens (tabel 2) med en T7-promotor oligonucleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') i et 1:1 molforhold ved opvarmning ved 90 ° C i 3 minutter og afkøling ved stuetemperatur i mindst 10 minutter.
- Transskribere RNA ved hjælp af en in vitro-transskription kit ved at følge brugsanvisningen.
- Stop transkriptionsreaktion ved tilsætning af lige så stort volumen af 7 M urinstof farvestof (7 M urinstof, 0,05% Xylen Cynol og 0,05% bromphenolblåt). Køre på en filtersteriliseret 9% denaturerende polyacrylamidgel (9% acrylamid, 7 M urinstof, 1x TBE).
- Brug ultraviolet (UV) skygning med en kortbølget UV-lampe til at lokalisere og punktafgifter respektive RNA. Anbring det udskårne gelstykket i et mikrofugerør, og der tilsættes 400 pi gel elueringspuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA og 0,25% SDS). Elueres natten over ved stuetemperatur på et rør rotator.
- Precipitate det eluerede RNA ved at tilsætte 1 ml kold 100% ethanol og inkubering enten ved -80 ° C i 30 min eller -20 ° C natten over.
- Der centrifugeres ved 16.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at pelletere ned RNA'et.
- Vask pelleten med 1 ml 75% ethanol. Centrifuger ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender RNA-pelleten hensigtsmæssigt i RNase frit vand for at opnå de ønskede koncentrationer, som vist i tabel 2..
5. Fluorescens-baserede RNA-redigering Assay
- For en enkelt reaktion, kombinere 1 pmol (1 ul) af preA6Rbz og 2,5 pmol (1 ul) af gA6Rbz (1:2,5 molforhold) i et mikrofugerør, inkuberes ved 70 ° C i 3 minutter og lad det sidde ved stuetemperatur i mindst 10 min.
- I mellemtiden forbereder en master mix hjælp af tabel 3, uden preA6Rbz og gA6Rbz for redigering reaktion indeholdende 1x HHE buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl og 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl2, 16 ng / ul Torula gær-RNA, 0,1% Triton X-100, og det oprensede editosome.
- Tilføj udglødet preA6Rbz og gA6Rbz at færdiggøre master mix.
- Doser 18 pi af master mix (tabel 3) i brønde indeholdende enten 2 pi RNase-frit vand (brønde uden forbindelser) eller 2 pi 200 pM kemiske forbindelser og omfatter kontrolprøver i pladen ifølge fig. 5.
- Forsegle skiltet med plade kapslen og spin pladen ned, for at fjerne eventuelle luftbobler. Inkuber ved 28 ° C i 4 timer.
- Tilsæt 25 pmol (2 pi) i gA6Rbz konkurrent til hver brønd. Placer en frisk sealer, dreje pladen ned og placere den på en real-time PCR-maskine. Programmere følgende eksperiment:
Trin 1: 85 ° C i 5 minutter; Trin 2: 24 ° C i 10 min; Trin 3: Stop. - Tilføj 15 pmol (1 ul) af FRET substrat til hver brønd til en endelig volumen på 23 ul. Forsegle skiltet med en frisk sealer.Hurtigt dreje pladen og læg den tilbage på den real-time PCR-maskine.
- Programmere et nyt eksperiment med følgende trin:
Trin 1: 37 ° C i 1 min; Trin 2: Læs; Trin 3: Gå til trin 1, 40 gange; Trin 4: Stop. - Opsætning pladen ved at markere alle de brønde, der kræver læsning og vælger FAM filteret. Input volumen som 23 ul og starte kørslen.
- Beregn hældningen af de værdier, der opnås fra hver brønd / prøve for at opnå en kinetisk måling ved at plotte skråninger på et søjlediagram til analyse. BEMÆRK: En kinetisk read forbedrer signal-støj-forholdet mellem prøven og baggrunden; som baggrund prøve ville have en hældning tæt på nul. Et slutpunkt læsning har højere baggrundsstøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere de nødvendige skridt, der er nødvendige for oprettelsen af en storstilet skærm, figur 2-5 er repræsentative kontrol eksperimenter relateret til kvaliteten af analysen. Disse er vigtige eksperimenter for en konsekvent analyse over flere dage af screening eller til sammenligning af forskellige skærme kontrol.
Vurdering af fluorescenssiqnal-støj Ratio
For at sikre stabiliteten og kvaliteten af fluoresceinmærket oligoribonucleotid substrat i en storstilet opsætning blev Z'-faktor, der defineres som forskellen mellem assayet baggrund og den maksimale signal beregnes ved hjælp af den aktive ribozymmolekylet (A6Rbz). . Analyser med Z'-faktor> 0.5 anses for acceptable for high-throughput skærm Figur 2 viser repræsentative data ved hjælp af FRET substrat mærket med 5 'fluorescein (FAM, emitter) og 3' N, N '-tetramethylrhodamine (TAMRA; quencher) (A6Rbz_F / T). Dette substrat produceret en Z'-faktor på 0,64, når den beregnes ved hjælp af 72 gentagelser i nærvær og fravær af A6Rbz.
I dette assay et alternativt substrat ved hjælp Iowa Black mørk quencher (A6Rbz_F/Ib) kan give et bedre signal-til-støj-forholdet i forhold til TAMRA. Dette skyldes, Iowa Sort modsætning TAMRA, udsender absorberede energi som varme og ikke lys. Den Z'-faktor opnået ved hjælp af FAM / Iowa Black (F / Ib)-mærket substrat var 0,68. Forbedringen i den Z'-faktor for F / Ib-mærket substrat i TAMRA-mærket substrat er på grund af dens relativt lavere baggrund. Disse repræsentative resultater viser, at begge substrater er levedygtige muligheder for anvendelse i en high-throughput screen.
Bestemmelse af de Redigering af aktiviteter af glycerol gradientfraktioner
For at bestemme og vælge de mest aktive editosome fraktioner til eksperimenter, den glycerol gradientfraktioner blev testet for redigering i vitro under anvendelse af fluorescens-baserede assay (trin V). Disse data viser (figur 3) fraktionerne 7-12 som den mest aktive fraktioner (≥ 50% redigering aktivitet med den mest aktive fraktion som 100%). Disse fraktioner kan kombineres, når mere editosome er påkrævet.
Beregning af Z'-faktor, når de Editosome fraktioner blev samlet
For at bestemme virkningen af combinig fraktionen editosome blev Z'-faktor-værdi på 0,6 beregnes, når de aktive fraktioner (F8 + F9 + F10) blev anvendt som kilde til editosome. Til beregning af Z'-faktor 72 replikater blev testet i nærvær og fravær af editosome (figur 4). F / Ib-substrat blev anvendt i dette eksperiment. Disse data viser, at baseret på Z'-faktor, der kombinerer glycerol gradientfraktioner har minimal indvirkning på kvaliteten af assayet.
ass = "jove_content"> Repræsentant kontroleksperiment for analysen
Repræsentative data, der sammenligner forskellige kontrolprøver blev anvendt til at analysere variablerne i assayet. Som vist i figur 5, behøver reaktioner mangler enhver RNA-redigering komponenter (reaktioner 1-4) ikke kløve substratet. Spaltning af underlaget målt ved fluorescens og relative redigering aktivitet kun observeret i overværelse af alle dele af redigering reaktioner i fravær af en inhibitor (reaktion 5) eller i overværelse af alle redigering komponenter og en inaktiv forbindelse (reaktion 6). I modsætning hertil kan en inhiberende forbindelse blokere RNA-redigering og anvendes som en positiv kontrol (reaktion 7). Her blev Mordant sort (MRB) og C53-forbindelser anvendes som positive og negative kontroller, hhv.
ghres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1.. Hammerhead ribozym-baserede in vitro-RNA-redigering assay. A) Trin-for-trin skematisk repræsentation af fluorescens-baserede in vitro redigering analyse: (a) hybridisering af præ-redigerede hammerhoved ribozym (præ-redigeret A6Rbz) med sin guide RNA (gA6Rbz). (B) anerkendelse og interaktionen af RNA-duplex med det oprensede editosome kompleks. (C) Udeladelse RNA-redigering katalyseret af editosome. (D) dissociation af den redigerede A6Rbz fra editosome og gA6Rbz ved opvarmning ved 85 ° C og tilsætning af guide RNA konkurrent (gA6Rbz_comp). (E) Hybridisering af FRET underlaget med den aktive A6 hammerhoved-ribozym (aktiv A6Rbz). (F) Påvisning af FAM-signaler efter spaltning af FRET substrat ved den aktive ribozym. B) Den præ-redigerede hammerhoved ribozym (pre-redigerede A6Rbz) er vist i forbindelse med gA6Rbz der angiver sletning af tre os (dobbelt-ledes arrow) fra redigering stedet (ES). Som et resultat af RNA-redigering i nærværelse af funktionelle editosome den inaktive ribozym redigeret til dets aktive form (redigeret A6Rbz), som nu kan spalte substratet FRET (spaltningssted angivet med en pil). Den bevarede 5'-CUGA-3 'i den redigerede A6Rbz i den katalytiske kerne afgørende for ribozymaktivitet (redigeret hjemmeside) er markeret (Dette tal er blevet ændret fra Moshiri 19). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Signal-støjforhold sammenligning mellem FRET substrater huser forskellige quenchers. Ribozym (A6Rbz) aktivitet ved FAM / TAMRA (F / T) og FAM / Iowa Black FQ (F / Ib) substrater. Y-aksen represeNTS fluorescens vilkårlig enhed (FAU) per minut.
Fig. 3. RNA-redigering aktivitet af udvalgte fraktioner opnået fra glycerolgradient centrifugering af mitokondrie lysat. Fraktion # 9 (F9) har den højeste aktivitet. Y-aksen repræsenterer relativ redigering aktivitet i procent, i betragtning F9 som 100%.
Figur 4.. Z'-faktor beregning ved hjælp de mest aktive fraktioner (F8 + F9 + F10) som editosome kilde. Eksperimentel variation blev opnået fra 72 gentagelser af hver type reaktion. Z'-faktor blev beregnet til 0,6. Y-aksen repræsenterer relativ redigering aktivitet.
Figur 5. Repræsentativt eksperiment til fluorescens-baserede RNA-redigering assay. Reaktioner blev udført i et slutvolumen på 20 pi per brønd og CFX384 TouchTM real-time PCR detection system blev anvendt til måling af fluorescenssignalet. Grafen viser forskellige kontroller i tillæg til en komplet redigering reaktion, der indeholder alle komponenter til assayet (# 5). Fluorescensen blev målt i nærvær af FRET substrat alene (# 1) at vurdere integriteten af substratet. Prøve # 2 blev udført i fravær af editosome at overvåge enhver ribozymaktivitet inden redigering. For at vurdere effekten af denatureret editosome på underlaget, blev fluorescens målt i nærværelse af editosome og FRET substrat kun (# 3). For at teste guide-instrueret redigering specificitet, en sampel i fravær af gA6Rbz blev brugt (# 4). En ikke-inhiberende (C53, # 6), og en inhiberende forbindelse (MRB, nr. 7) blev anvendt til at teste virkningen på redigering assay. Mens RNA-redigering hæmmes betydeligt ved MRB, C53 har kun ubetydelig effekt. Fejlsøjlerne svarer til en eksperimentel variation (standardafvigelse) på mellem 10 gentagelser. Y-aksen repræsenterer relativ redigering aktivitet i procent, i betragtning af den komplette reaktion (# 5), 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE gradient buffer | 5 ml | 5 ml |
| Glycerol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H2O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 pi | 10 pi |
Tabel 1. 10% og 30% Glycerol Solution (10 ml hver).
| Pre-redigeret A6 Ribozym (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz DNA-template | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA lager conc. | 1 uM |
| Guide A6 Ribozym (gA6Rbz) | |
| gA6RBz DNA-template | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA lager conc. | 2,5 uM |
| Guide A6 Ribozym Konkurrent (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp DNA-template | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA lager conc. | 12.5 uM |
| Aktiv A6 Ribozym (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA-template | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA lager conc. | 1 uM |
| FRET substrat | |
| TAMRA quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Black quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA lager conc. | 15 pM (for begge) |
Tabel 2. DNA skabeloner og RNA-substrater.
| Sammensætning | Redigering reaktion (ul) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M CaCl2 | 1 |
| 100 mM ATP | 0.2 |
| 10% Triton X-100 | 0.2 |
| 500 ng / ul Torula gær-RNA | 1 |
| Editosome | 5. |
| RNase fri H2O | 7.1 |
| 1 uM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 uM gA6Rbz | 1 |
| Samlet | 18 |
Tabel 3. Reaktion Sammensætning og Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny high-throughput screening metode til at identificere inhibitorer mod RNA-redigering kompleks af trypanosomer blev præsenteret, tilvejebringe et nyt værktøj for lægemiddelforskning at imødegå sygdomme forårsaget af trypanosomatids. FRET-baserede ribozym assay er blevet flittigt brugt til forskellige formål 20-22; imidlertid har vi brugt kapacitet FRET-baserede ribozym assay for in vitro-overvågning af RNA-redigering aktivitet 19. Dette assay potentielt kunne tilpasses til andre typer af RNA-redigering i eukaryoter, såsom nucleotidsubstitution redigering af nucleus kodet RNA'er af pattedyr 23.
Nyheden af dette assay er ikke i oprettelse FRET-baserede ribozym assays per se, men at udvikle en fremgangsmåde, der inkorporerer denne teknik i en RNA-redigering assay, der er modtagelig for high-throughput screening af kemiske stoffer mod editosome. Ribozymet assay-metode har flere fordele frem for andre skærme og røvays øjeblikket anvendes til dette formål. Konkret teknik giver en følsom og reproducerbar "mix-and-foranstaltningen" assay bygger på et fluorescerende substrat i modsætning til en radioaktivt mærket en, hvilket gør det egnet til high-throughput screening 19. Real-time overvågning af et fluorescens-signal efter tilsætning af substratet i stedet for en enkelt endepunkt signal gør det muligt mere præcist at bestemme IC50-værdier af de analyserede forbindelser 19. Endvidere tillader afprøvning af de inhibitoriske virkninger af forbindelser på hel-editosome komplekset i modsætning til individuelle rekombinante proteiner. I betragtning af den dynamiske karakter af interaktioner inden protein komplekser, kan det foreslås, at denne metode giver mulighed for identifikation af inhibitorer mod editosome proteiner i en mere biologisk repræsentant indstilling 24. Desuden rettet mod hel-editosome komplekset giver mulighed for potentielt arrestere progression af RNA-redigeringpå forskellige forbigående skridt, der ikke tidligere er blevet identificeret. Således vil teknik tillade få et bedre perspektiv med hensyn til interaktioner og aktiviteter, der er afgørende for processen af RNA redigering. Denne fremgangsmåde har vist sig at være en succes i fortiden som eksemplificeret ved opklaringen af prokaryote ribosomkomplekset samling og funktion udnytte antibiotika, såsom viomycin og erythromycin, som inhibitorer af komplekset 24,25.
For at sikre en vellykket afslutning af metoden kan visse justeringer i protokoller være nødvendig. Først, udvælgelse af den rette glycerolgradient mitokondrie ekstrakt fraktion er afgørende. Her fraktionerne 7 til 11, svarende til ~ 20S region af gradienten, viste den højeste redigering aktivitet med fraktion 9 udviser maksimal aktivitet. Selv om denne fraktion blev valgt til alle test fremlagt, er det vigtigt at teste alle fraktioner på forhånd med henblik på at vurdere, på hvilke fromKTION de redigering aktivitet toppe. For det andet at validere valget fraktion, er det vigtigt at udføre indledende test til at vurdere signal-til-støj-forholdet ved at beregne Z'-faktor værdi. Hvis korrekt mitokondrie ekstrakt glycerolgradient fraktionering er afsluttet, kan der opnås en Z'-værdi på 0,6. Dernæst anbefales det at revurdere reaktionen mængden af mitokondrie ekstrakt nødvendig for at opnå maksimal redigering aktivitet via titrering 19.
En vigtig begrænsning af teknikken i dette papir vedrører den besværlige og tidskrævende proces mitochondriel ekstrakt glycerolgradient fraktionering ved hvilken editosome komplekset renses 19. På trods af disse ulemper, er denne teknik fortrinsvis foreslået at opnå rå editosome fraktioner givet sin lave omkostninger versus udbyttepotentiale derved at betegne det til anvendelse i high-throughput screening. I modsætning andre metoder såsom TAP-tag purification, der er i stand til at give mere oprensede editosome fraktioner er tilrådeligt for lav til medium gennemløb assays, såsom i tilfælde af sekundære analyser. Desuden for at sikre specifik hæmmende virkning af forbindelser, er det nødvendigt at medtage kontrol for at teste dem mod aktiviteten af ribozym (A6Rbz) i fravær af editosome. Det skal bemærkes, at tidligere undersøgelser har vist, at denne metode kan være ineffektive til at beregne IC50-værdierne for dye-lignende forbindelser fra mulig interferens ved høje koncentrationer af forbindelse 19.
For yderligere at forøge følsomheden af HTS teknik fremlagt, at udvikle en lignende fluorescens-assay involverer præ-spaltede præ-redigeret ribozym er gavnligt. Dette ville gøre det muligt at omgå det hastighedsbegrænsende spaltning i trin katalyseres af endonukleaser i editosome kompleks. En anden fordel ved denne modificerede assay ville være programmet som en sekundær screening værktøjat overvåge effekten af inhibitorer er identificeret gennem den primære skærm på ExoUase, TUTase og ligerings katalytiske aktiviteter. Den aktuelt foreslåede analyse er begrænset til påvisning af inhibitorer mod sletning type RNA redigering. Derfor ville en anden vej til at udforske være modifikationen af præsenterede assay for at muliggøre overvågning af forbindelsens virkninger på indsættelse type RNA-redigering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
