Abstract
Notevoli progressi sono stati compiuti nel determinare il meccanismo mitocondriale RNA editing in trypanosomes. Allo stesso modo, sono stati compiuti notevoli progressi nell'identificazione dei componenti del complesso editosome che catalizzano RNA editing. Tuttavia, non è ancora chiaro come queste proteine lavorino insieme. Composti chimici ottenuti da uno schermo ad alta velocità contro il editosome possono bloccare o influenzare una o più fasi del ciclo di editing. Pertanto, l'identificazione di nuovi composti chimici genererà sonde molecolari importanti per sezionare la funzione editosome e assemblaggio. In studi precedenti, in vitro saggi di modifica in sono stati effettuati utilizzando RNA radio-marcato. Questi test sono molto tempo, inefficace e inadatto per scopi di high-throughput. Qui, una con sede a fluorescenza omogenea "mix e misurare" martello ribozyme in vitro giornalista per monitorare RNA editing, viene presentato. Solo come conseguenza di RNA editing diil ribozyme martello una risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET) substrato oligoribonucleotide subisce scissione. Questo a sua volta provoca la separazione del fluoroforo dal quencher producendo così un segnale. Al contrario, quando la funzione editosome è inibita, si spegnerà il segnale di fluorescenza. Questo è un test altamente sensibile e semplice che dovrebbe essere generalmente applicabile per monitorare in vitro RNA editing o high throughput screening delle sostanze chimiche che possono inibire la funzione editosome.
Introduction
Il processo di editing dell'RNA, una modifica mRNA post-trascrizionale, è stato scoperto nel trypanosomatids 1. Da allora, il lavoro sostanziale è stato condotto nello studio del meccanismo che sta dietro RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In una serie di reazioni enzimatiche, la editosome, un complesso nucleo di circa 20 proteine, crea mRNA mitocondriali maturi per più componenti del sistema di fosforilazione ossidativa di generazione di energia. L'ordine degli eventi catalitici è scissione endonucleolitico, uridylate (U), aggiunta o cancellazione, e legatura, come dettato dalla RNA guida (gRNAs) 4.
Oltre al nucleo proteine editosome complessi, un numero di fattori accessori sono stati anche identificati 5-7. Queste proteine si osservano principalmente raggruppati in complessi indipendenti. Tuttavia, l'ordine di montaggio proteina nel complesso nucleo editosome e gli schemi di interazione del complesso nucleo con l'accessoriocomplessi sono ancora da determinare. Targeting il processo di editing RNA in trypanosomatids può prevedere dissettori chimici che aiuti a studiare l'assemblaggio e la funzione del complesso editosome. Inoltre, studi funzionali in diverse proteine editosome hanno dimostrato l'essenzialità attraverso diverse fasi della vita, indicando la loro potenziale come bersagli farmacologici 8-12. Pertanto, gli inibitori trovate del editosome possono anche agire come composti di piombo contro trypanosomatids. Questo è tempestivo, in quanto i farmaci attualmente disponibili contro le malattie causate da trypanosomatid sono tossici, inefficiente e costoso 13,14.
Un test efficiente e conveniente in vitro è necessario per esplorare l'universo chimica per inibitori specifici che bloccano RNA editing. Tre saggi sono stati sviluppati e utilizzati per monitorare editosome attività: (a) ciclo completo in vitro RNA editing saggio di 15, (b) pre-spaccati in vitro RNA editing saggio di 16,17, unnd dosaggio 18 (c) martello ribozyme (HHR)-based. I primi due saggi si basano sulla visualizzazione diretta del prodotto modificato (ATPasi 6 mRNA) con l'aiuto di radioattività. Il saggio basato HHR utilizza una versione modificata del ATPasi 6 mRNA che viene modellato a comportarsi come un ribozima su editing. Il ribozima funzionale poi specificamente ad un substrato RNA radiomarcato, che serve come reporter. Recentemente, Moshiri et al. Sviluppato un 'mescolare e misurare' HHR-basato in vitro reporter per monitorare RNA editing dove il substrato RNA radiomarcato viene sostituito con un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrato 19. I vantaggi principali di questo saggio sono: (a) è un mix rapido e conveniente e misura tipo di dosaggio, come la produzione di ribozima attivo e substrato fenditura si verificano simultaneamente nella stessa provetta a basso volume (cioè 20 microlitri), (b ) evita l'uso di materiali marcati radioattivamente, (c) sensibilità che è unfforded da fluorescenza strumentazione in un formato di piastra di micro-titolazione, e (d) un alto rapporto segnale-rumore. Usando questo test, l'effetto di inibitori noti RNA editing ligasi contro editosome purificato è stato confermato 19. Questo esperimento convalidato il test per la rapida identificazione di inibitori di RNA editing, soprattutto contro editosomes interi da T. brucei.
La figura 1 è uno schema dettagliato passo-passo del saggio in vitro RNA editing basato sulla fluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato sia per il monitoraggio RNA editing in vitro o facilmente essere adattato per lo screening di librerie di composti di varie scale.
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Protocol
Il protocollo che segue descrive la procedura per eseguire il test RNA editing basato sulla fluorescenza. L'analisi può essere eseguita in un unico tubo PCR, 96 ben-, o 384 pozzetti a seconda del campo di applicazione dell'esperimento. Successivamente il segnale di fluorescenza può essere visualizzato su un sistema di rilevazione adeguato tempo reale PCR. Il saggio qui è descritta nel contesto di piastre a 384 pozzetti.
1. Culturing T. Le cellule brucei
- Preparare un terreno di coltura per T. brucei prociclico cellule formano. Per 1 L di terreno:
- Sciogliere 25.4 g SDM-79 polvere in acqua 800 ml miliQ.
- Aggiungere 2 g di NaHCO3 e il pH a 7,3 con NaOH 10 M.
- Aggiungere acqua Nanopure ad un volume finale di 900 ml, filtro sterilizzare.
- Aggiungere siero fetale bovino (FBS), penicillina-streptomicina soluzione e emina (2,5 mg / ml) a concentrazioni finali di 10% (v / v), 100 U / ml e 7,5 mg / L rispettivamente.
- Grow 300 ml di T. <em> brucei 1.7A wild type (forma prociclico) le cellule a 28 ° C, si stringono a 70 giri per una densità di 1,5 x 10 7 cellule / ml. NOTA: Questo dovrebbe produrre 3 ml di editosome attivo con ~ 0,5 mg di proteine totali, sufficienti per 600 reazioni di editing.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Lavare il pellet con 50 ml di tampone PBSG refrigerati (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl e 6 mM di glucosio), e centrifugare le cellule di nuovo per centrifugazione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.
2. Isolamento di greggio mitocondri
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio oppure a 4 ° C per preservare editosome attività.
- Risospendere le cellule raccolte in 30 ml di tampone DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 e EDTA 1 mM). Usare un 40 ml sterile omogeneizzatore Dounce (pre-refrigerata) per distruggere la membrana cellulare da accarezzare su e giù almeno 10 volte su ghiaccio. Immediatamente aggiungere 4,3 ml di 60% di saccarosio (w / v; cioè 1,75 M) al omogenato ad una concentrazione finale di 0,25 M. Centrifugare a 15.800 xg per 10 min a 4 ° C, per portare preferenzialmente giù mitocondri.
- Risospendere il pellet mitocondriale in 4,6 ml di tampone STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM saccarosio e 2 mM MgCl 2). Aggiungere 13,8 ml di 0,1 M CaCl 2 e 4 ml di DNasi I RNasi-free a concentrazioni finali di 0,3 mm e 9 U / ml, rispettivamente. Incubare la miscela per 1 ora su ghiaccio.
- Aggiungere 4,6 ml di tampone STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, saccarosio 250 mM e EDTA 2 mM) per inattivare la DNasi I. Centrifugare a 15.800 xg per 10 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in 400 ml di tampone di lisi (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM MgCl 2, KCl 100 mM, 1 mg / ml pepstatina, 1 mM DTT, e 1x completo inibitori della proteasi libero-EDTA) e trasferimento ad un provetta per microcentrifuga.
- Aggiungere 10% Triton X-100 ad una concentrazione finale di 1% and incubare il lisato per 15 min a 4 ° C su un rotatore tubo.
- Cancellare il lisato mitocondriale mediante centrifugazione due volte a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C; mantenendo il surnatante eliminato ogni volta.
3. Editosome Purificazione
- Versare 10 ml 10% -30% (v / v) di glicerolo gradiente lineare (Tabella 1) in un tubo un'ultracentrifuga utilizzando tampone gradiente HHE 2x (40 mM HEPES pH 7.9, 20 mM Mg (OAc) 2, KCl 100 mM, e 2 mM EDTA) e una macchinetta del gradiente seguendo il manuale di istruzioni.
- Rimuovere con cautela 500 ml di soluzione dalla parte superiore del gradiente di glicerolo e caricare delicatamente 500 ml di lisato mitocondriale eliminato. Spin a 178.000 xg per 6 ore a 4 ° C utilizzando un'ultracentrifuga.
- Raccogliere 500 microlitri frazioni sequenzialmente dall'alto verso il basso del gradiente a 4 ° C. Quindi far scattare congelare le frazioni utilizzando azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo.
- Ricuocere stampo di DNA contenente rispettiva sequenza complementare alla sequenza del promotore T7 (Tabella 2) con un oligonucleotide promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in rapporto molare 1:1 in riscaldamento a 90 ° C per 3 min e raffreddamento a temperatura ambiente per almeno 10 min.
- Trascrivere RNA utilizzando un kit di trascrizione in vitro seguendo il manuale di istruzioni.
- Fermare la reazione di trascrizione con l'aggiunta di volume uguale di 7 M urea colorante (7 M urea, 0.05% xilene Cynol, e lo 0,05% blu di bromofenolo). Eseguito su un filtro sterilizzato 9% gel di poliacrilammide denaturante (9% acrilammide, 7 M urea, 1x TBE).
- Utilizzare il pedinamento raggi ultravioletti (UV) con una lampada UV ad onde corte per individuare e accise rispettivi RNA. Posizionare il pezzo gel asportata in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 400 ml di tampone di eluizione gel (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 NaOAc mM, EDTA 1 mM e 0,25% SDS). Eluire notte a RT su un rotatore tubo.
- Precipitate l'RNA eluito aggiungendo 1 ml di etanolo 100% freddo e incubando sia a -80 ° C per 30 minuti oa -20 ° C per una notte.
- Centrifugare a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C, per far sedimentare per RNA.
- Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet di RNA opportunamente in acqua RNasi libero per ottenere le concentrazioni desiderate, come illustrato nella Tabella 2.
5. Sede a fluorescenza RNA Editing Assay
- Per una singola reazione, unire 1 pmol (1 ml) di preA6Rbz e 2,5 pmol (1 ml) di gA6Rbz (rapporto molare 1:2.5) in una provetta per microcentrifuga, incubare a 70 º C per 3 minuti e lasciate riposare a temperatura ambiente per almeno 10 min.
- Nel frattempo preparare un master mix utilizzando la Tabella 3, senza preA6Rbz e gA6Rbz, per la reazione di modifica contenente tampone 1x HHE (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl e EDTA 10 mM), 1 mMATP, 5 mM CaCl 2, 16 ng / ml di RNA Torula lievito, 0,1% Triton X-100, e il editosome purificata.
- Aggiungi ricotto preA6Rbz e gA6Rbz per completare il master mix.
- Pipettare 18 microlitri della miscela master (Tabella 3) in pozzetti contenente 2 ml di acqua priva di RNasi (pozzetti che non composti) o 2 ml di 200 mM composti chimici e comprendono campioni di controllo nella piastra di figura 5.
- Sigillare la piastra con un sigillante piastra e girare il piatto, per eliminare eventuali bolle d'aria. Incubare a 28 ° C per 4 ore.
- Aggiungere 25 pmol (2 microlitri) di gA6Rbz concorrente di ogni bene. Posizionare un sigillante fresco, girare il piatto e posizionarlo su una macchina PCR real-time. Programmare il seguente esperimento:
Passo 1: 85 ° C per 5 min; Passo 2: 24 ° C per 10 min; Passo 3: Stop. - Aggiungere 15 pmol (1 mL) di substrato FRET a ciascun pozzetto per un volume finale di 23 microlitri. Sigillare la piastra con un nuovo sigillante.Girare velocemente la piastra e rimetterlo sulla macchina PCR real-time.
- Programmare un nuovo esperimento con le seguenti operazioni:
Passo 1: 37 ° C per 1 min; Fase 2: Leggi; Fase 3: Andare al passo 1, 40 volte; Fase 4: Stop. - Installazione della piastra selezionando tutti i pozzi che richiedono la lettura e scegliere il filtro FAM. Volume d'ingresso come 23 microlitri e iniziare la corsa.
- Calcolare la pendenza dei valori ottenuti da ciascun / pozzetto per ottenere una misurazione cinetica riportando le piste su un grafico a barre per l'analisi. NOTA: Una lettura cinetica di migliorare il rapporto segnale-rumore tra il campione e lo sfondo; come il campione sfondo avrebbe una pendenza prossima allo zero. Un punto di lettura finale ha una maggiore rumore di fondo.
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Representative Results
Per dimostrare i passi necessari per la creazione di uno schermo di grandi dimensioni, le figure 2-5 sono gli esperimenti rappresentativi di controllo relative alla qualità del test. Questi sono esperimenti di controllo essenziali per un dosaggio costante per diversi giorni di screening o per il confronto di diversi schermi.
Valutare il segnale-rumore rapporto fluorescenza
Per garantire la stabilità e la qualità del substrato oligoribonucleotide marcato con fluoresceina in una configurazione su larga scala, Z'-fattore, definito come la differenza tra lo sfondo dosaggio e il segnale massimo è stato calcolato utilizzando il ribozima molecola attiva (A6Rbz). . Saggi con Z'-factor> 0.5 sono considerati accettabili per schermo ad alta velocità La Figura 2 mostra i dati rappresentativi utilizzando il substrato FRET etichettato con 5 'fluoresceina (FAM; emettitore) e 3' N, N '-tetramethylrhodamine (TAMRA, quencher) (A6Rbz_F / T). Questo substrato prodotto un Z'-fattore di 0,64 quando calcolato utilizzando 72 replicati in presenza e assenza di A6Rbz.
In questo test un substrato alternativo utilizzando Iowa nero scuro quencher (A6Rbz_F/Ib) può produrre un miglior rapporto segnale-rumore rispetto a TAMRA. Questo perché Iowa nero, a differenza TAMRA, emette energia assorbita come calore e non luce. Il Z'-fattore ottenuto usando l'FAM / Iowa nero (F / Ib)-substrato marcato era 0,68. Il miglioramento del Z'-fattore per il substrato F / Ib-marcato su un substrato TAMRA marcato è a causa della sua bassa relativamente basso. Questi risultati rappresentativi mostrano che entrambi i substrati sono opzioni valide per l'utilizzo di uno schermo ad alta produttività.
Determinazione delle Attività Modifica del glicerolo Gradient Frazioni
Per determinare e selezionare le frazioni editosome più attivi per gli esperimenti, la glycerofrazioni l gradiente sono stati testati per la modifica in vitro usando il saggio basato sulla fluorescenza (Fase V). Questi dati mostrano (figura 3) le frazioni 7-12 come frazioni più attive (≥ 50% dell'attività editing, con la frazione più attivo come 100%). Queste frazioni possono essere combinate quando è necessaria più editosome.
Calcolo del Z'-fattore quando le Frazioni Editosome sono state combinate
Per determinare l'effetto della combinig frazione editosome, il valore Z'-fattore di 0,6 è stato calcolato quando frazioni più attive (F8 + F9 + F10) sono stati usati come sorgente di editosome. Per calcolare il fattore Z'-72 replicati sono stati testati in presenza e in assenza del editosome (Figura 4). Il substrato F / Ib è stato utilizzato in questo esperimento. Questi dati mostrano che in base al Z'-fattore, combinando le frazioni gradiente di glicerolo hanno un effetto minimo sulla qualità del saggio.
ass = "jove_content"> esperimento di controllo Rappresentante per la Assay
Dati rappresentativi a confronto diversi campioni di controllo sono stati utilizzati per analizzare le variabili nel saggio. Come mostrato in Figura 5, reazioni mancanti qualsiasi componente RNA editing (reazioni 1-4) non fendere il substrato. Clivaggio del substrato misurata dalla fluorescenza e attività relativa modifica è stata osservata solo in presenza di tutti i componenti delle reazioni di modifica in assenza di un inibitore (reazione 5) o in presenza di tutti i componenti di editing e un composto inattivo (reazione 6). Al contrario, un composto inibitorio può bloccare RNA editing e viene usato come controllo positivo (reazione 7). Qui, nero Mordente (MrB) ei composti C53 sono stati utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.
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Figura 1. Hammerhead in vitro RNA editing basato ribozyme. A) Rappresentazione passo-passo schematica in editing vitro basato sulla fluorescenza: (a) ibridazione del martello ribozima premontato (pre-modifica A6Rbz) con la relativa guida RNA (gA6Rbz). (B) rilevazione e l'interazione del duplex RNA dal complesso editosome purificata. (C) Soppressione RNA editing catalizzata dalla editosome. (D) La dissociazione del A6Rbz modificato dal editosome e gA6Rbz mediante riscaldamento a 85 ° C e aggiunta di guida RNA concorrente (gA6Rbz_comp). (E) Ibridazione del substrato FRET con l'attiva martello ribozima A6 (A6Rbz attiva). (F) rilevazione dei segnali FAM seguito scissione del substrato FRET dal ribozyme attivo. B) Il ribozima martello pre-modificato (pre-cura A6Rbz) è mostrato in associazione con gA6Rbz che specifica la soppressione di tre Us (a due punte Arrow) dal sito editing (ES). Come risultato di editing RNA in presenza di editosome funzionale nella sua forma attiva (edited A6Rbz) che ora può scindere il substrato FRET (sito di taglio indicata da una freccia) ribozima inattivo viene modificato. La conservato è evidenziato 5'-CUGA-3 'del A6Rbz modificato nel nucleo catalitico essenziale per l'attività ribozyme (sito a cura) (Questo dato è stato modificato da Moshiri 19). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Segnale-rumore confronto rapporto tra substrati FRET ospitano diversi quenchers. Ribozyme (A6Rbz) all'attività utilizzando FAM / TAMRA (F / T) e FAM / Iowa Nero FQ (F / Ib) substrati. Il represe asse ynti fluorescenza unità arbitrarie (FAU) al minuto.
RNA attività Figura 3. Editing di selezionare frazioni ottenute dal glicerolo centrifugazione in gradiente del lisato mitocondriale. Frazione # 9 (F9) ha la più alta attività. L'asse y rappresenta l'attività di modifica relativa in percentuale, considerando F9 come 100%.
Variazione sperimentale Figura 4. Calcolo Z'-factor utilizzando frazioni più attive (F8 + F9 + F10) come sorgente editosome. Stato ottenuto da 72 replicati di ciascun tipo di reazione. Z'-fattore è stato calcolato come 0,6. L'asse y rappresenta l'attività di modifica relativa.
Figura 5. Esperimento rappresentativo per la RNA editing saggio basato sulla fluorescenza. Reazioni sono state eseguite in un volume finale di 20 microlitri per pozzetto e in tempo reale sistema di rilevamento CFX384 TouchTM PCR è stato utilizzato per misurare il segnale di fluorescenza. Il grafico presenta vari controlli in aggiunta a una reazione editing completo che contiene tutti i componenti per il saggio (# 5). La fluorescenza è stata misurata in presenza di substrato FRET solo (# 1) per valutare l'integrità del substrato. Esempio # 2 è stata eseguita in assenza del editosome di monitorare qualsiasi attività di ribozima prima dell'editing. Per valutare l'effetto di editosome denaturato sul substrato, la fluorescenza è stata misurata in presenza del substrato editosome e FRET solo (# 3). Per testare la specificità editing diretto da guida, un samPLE in assenza di gA6Rbz stato (# 4) usato. Un non-inibente (C53, # 6) e un composto inibente (MrB, # 7) sono stati usati per testare l'effetto sul dosaggio editing. Mentre RNA editing è inibita significativamente da MrB, C53 ha un effetto trascurabile. Le barre di errore corrispondono ad una variazione sperimentale (deviazione standard) tra 10 replicati. L'asse y rappresenta l'attività di modifica relativa in percentuale, considerando la reazione completa (# 5) come 100%.
| 10% | 30% | |
| Buffer di gradiente 2x HHE | 5 ml | 5 ml |
| Glicerina | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H 2 O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 microlitri | 10 microlitri |
Tabella 1. del 10% e 30% glicerolo Solution (10ml ciascuno).
| Pre-cura A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| Modello di DNA preA6Rbz | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA azione conc. | 1 pM |
| Guida A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| Modello di DNA gA6RBz | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA azione conc. | 2,5 micron |
| Guida A6 Ribozyme Competitor (gA6RBz_comp) | |
| Modello di DNA gA6Rbz_comp | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA azione conc. | 12.5 micron |
| Attivo A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz modello di DNA | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA azione conc. | 1 pM |
| FRET substrato | |
| TAMRA quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Nero quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA azione conc. | 15 mM (per entrambi) |
Tabella 2. Modelli di DNA e RNA substrati.
| Composizione | Reazione Editing (pl) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M CaCl 2 | 1 |
| ATP 100 mM | 0.2 |
| 10% TritonX-100 | 0.2 |
| 500 ng / mL torula RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNasi libero H 2 O | 7.1 |
| 1 micron preA6Rbz | 1 |
| 2,5 micron gA6Rbz | 1 |
| Totale | 18 |
Tabella 3. Composizione reazione e Master Mix.
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Discussion
Un metodo di screening high-throughput romanzo per identificare inibitori contro il complesso RNA editing dei tripanosomi è stato presentato, fornendo un nuovo strumento per la scoperta di farmaci per combattere malattie causate da trypanosomatids. Test ribozyme-based FRET è stato ampiamente utilizzato per diversi scopi 20-22; Tuttavia, abbiamo utilizzato la capacità di dosaggio ribozima basato FRET per il monitoraggio di attività in vitro editing dell'RNA 19. Questa analisi potrebbe potenzialmente essere adattato ad altri tipi di RNA editing in eucarioti, quali modifica sostituzione nucleotidica di RNA nucleo codifica di mammiferi 23.
La novità di questo saggio non è nello stabilire ribozimi saggi basati FRET per sé, ma nello sviluppo di un metodo che incorpora questa tecnica in un RNA editing saggio che è suscettibile di alto-capacità di composti chimici contro editosome. Il metodo di analisi basato su ribozyme ha diversi vantaggi rispetto ad altri schermi e culoays attualmente utilizzati per questo scopo. In particolare, la tecnica offre un saggio sensibile e riproducibile "mix-and-misura" basandosi su un substrato fluorescente al contrario di un uno radiomarcato, rendendo così adatta per lo screening ad alta produttività 19. Monitoraggio in tempo reale di un segnale di fluorescenza dopo l'aggiunta del substrato invece di un segnale end-point semplice consente di determinare con maggiore precisione valori di IC 50 di composti dosati 19. Inoltre, esso permette di controllare gli effetti inibitori dei composti sul complesso intero editosome rispetto a singole proteine ricombinanti. Data la natura dinamica di interazioni all'interno di complessi proteici, si può suggerire che questo metodo consente l'identificazione di inibitori contro editosome proteine in un rappresentante più biologicamente impostazione 24. Inoltre, mira il complesso intero editosome offre l'opportunità di arrestare potenzialmente la progressione della RNA editingin varie fasi transitorie che non sono stati precedentemente individuati. Pertanto, la tecnica permetterà guadagnando una migliore prospettiva da interazioni e attività che sono cruciali per il processo di editing dell'RNA. Questo approccio è stato trovato per avere successo nel passato come esemplificato dalla delucidazione procariotica assemblaggio e la funzione utilizzando antibiotici, come eritromicina e viomicina complesso ribosoma, agendo come inibitori del complesso 24,25.
Per garantire il completamento con successo del metodo, alcuni adeguamenti nei protocolli possono essere necessari. Primo, selezione del glicerolo gradiente frazione dell'estratto mitocondriale adeguato è essenziale. Qui, frazioni da 7 a 11, corrispondente alla regione ~ 20S del gradiente, ha mostrato la più alta attività di editing, con frazione 9 esibendo massima attività. Anche se questa frazione è stata selezionata per tutti i test presentati, è essenziale per testare tutte le frazioni anticipo per valutare in cui fraZIONI i picchi di attività di editing. In secondo luogo, per convalidare la selezione frazione, è fondamentale effettuare prove preliminari per valutare il rapporto segnale-rumore calcolando il valore Z'-fattore. Se corretta mitocondriale estratto glicerolo gradiente di frazionamento è stato completato, un Z'-valore di 0,6 può essere raggiunto. Successivamente, si consiglia di rivalutare il volume di reazione di estratto mitocondriale necessario per raggiungere l'attività di editing massima tramite titolazione 19.
Una importante limitazione della tecnica qui presentato riguarda il processo laborioso e richiede tempo di frazionamento mitocondriale estratto glicerolo pendenza con cui il complesso editosome viene purificato 19. Nonostante questi inconvenienti, questa tecnica è preferenzialmente consigliata per ottenere frazioni editosome greggio dato il suo basso costo rispetto al potenziale di rendimento, qualificandosi in tal modo per l'applicazione dello screening high-throughput. In contrasto, altri metodi come la TAP-tag purification, che sono in grado di dare più editosome frazioni purificate, sono consigliabili per bassi dosaggi di throughput medio come nel caso di saggi secondarie. Inoltre, al fine di garantire specifico effetto inibitorio dei composti, è necessario includere controlli testarle contro l'attività di ribozima (A6Rbz) in assenza del editosome. Va notato che gli studi precedenti hanno evidenziato che questo metodo può essere inefficace a calcolare i valori di IC50 per i composti di colorante come causa della possibile interferenza a concentrazioni elevate composti 19.
Per aumentare ulteriormente la sensibilità della tecnica HTS presentato, lo sviluppo di un simile test basato sulla fluorescenza coinvolge pre-spaccati ribozima pre-modifica è vantaggiosa. Ciò consentirebbe bypassando il taglio endonucleolitico fattore limitante catalizzata dalla endonucleasi nel complesso editosome. Un altro vantaggio di questo test modificato sarebbe l'applicazione come strumento di screening secondarioper monitorare l'effetto degli inibitori identificati attraverso lo schermo primario su ExoUase, TUTase e attività catalitiche legatura. Il dosaggio attualmente proposta è limitata alla rilevazione di inibitori contro il tipo soppressione di editing dell'RNA. Pertanto, un'altra strada per esplorare sarebbe la modifica del saggio presentato per consentire il monitoraggio di effetti composti sul tipo di inserimento di editing dell'RNA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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