Abstract
Erhebliche Fortschritte bei der Bestimmung des Mechanismus der mitochondrialen RNA-Editing in Trypanosomen gemacht worden. Ebenso hat erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung der Komponenten des editosome Komplex, der RNA-Editing katalysieren gemacht worden. Es ist jedoch noch nicht klar, wie diese Proteine zusammen zu arbeiten. Von einem Hochdurchsatz-Screening gegen die editosome erhalten Chemische Verbindungen können blockieren oder beeinträchtigen einen oder mehrere Schritte im Bearbeitungszyklus. Daher wird die Identifizierung von neuen chemischen Verbindungen wertvolle molekulare Sonden zur Zerlegung der editosome Funktion und Anordnung zu erzeugen. In früheren Studien wurden in vitro-Assays unter Verwendung von Bearbeitungsradioaktiv markierten RNA durchgeführt. Diese Assays sind zeitaufwendig, ineffizient und für Hochdurchsatz-Zwecke ungeeignet. Hier eine homogene Fluoreszenz-basierten "zu mischen und zu messen" Hammerhead-Ribozym in-vitro-Reporter-Assay von RNA-Editing zu überwachen, wird vorgestellt. Nur als Folge von RNA-Editingdas Hammerhead-Ribozym ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Substrat Oligoribonukleotid Spaltung erfährt. Dies führt wiederum zu einer Trennung des Fluorophors vom Quencher, wodurch ein Signal erzeugt wird. Im Gegensatz dazu, wenn die editosome Funktion gesperrt ist, wird das Fluoreszenzsignal gelöscht werden. Dies ist eine sehr empfindliche und einfache Tests, der allgemein für in vitro-RNA-Editing oder Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien, die die editosome Funktion hemmen können überwacht werden sollte.
Introduction
Der Prozess der RNA-Editing, ein Post-Transkriptions mRNA Änderung, wurde zuerst in Trypanosomatiden 1 entdeckt. Seitdem hat umfangreiche Arbeit bei der Untersuchung der Mechanismus hinter RNA-Editing in Trypanosoma brucei 2,3 durchgeführt. In einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die editosome ein Kernkomplex von etwa 20 Proteinen, erstellt reifen mitochondrialen mRNAs für mehrere Komponenten der oxidativen Phosphorylierung Energieerzeugungssystems. Die Reihenfolge der Ereignisse ist endonukleolytische katalytische Spaltung Uridylat (U) Hinzufügen oder Löschen, und Ligation, wie durch Führungs RNAs (gRNAs) diktiert 4.
Neben den Kern editosome komplexe Proteine haben eine Reihe von Hilfsfaktoren auch identifiziert 5-7. Diese Proteine sind meist gesehen in unabhängigen Komplexen gruppiert. Jedoch ist die Reihenfolge der Proteinanordnung in den Kern editosome komplex und die Interaktionsmuster des Kernkomplex mit dem ZubehörKomplexe noch bestimmt werden. Targeting der RNA-Editing-Prozess in Trypanosomatiden können chemische Dissectoren sorgen, dass die Hilfe bei der Untersuchung der Montage und Funktion der editosome komplex. Darüber hinaus haben funktionelle Untersuchungen auf mehreren editosome Proteine Wesentlichkeit in verschiedenen Lebensphasen dargestellt, was auf ihr Potenzial als Medikament zielt 12.08. Daher kann die gefundenen Inhibitoren der editosome auch als Bleiverbindungen gegen Trypanosomatiden handeln. Dies ist an der Zeit, wie sie derzeit gegen Krankheiten, die durch Trypanosomatida verursacht verfügbaren Medikamente sind giftig, ineffizient und teuer 13,14.
Eine effiziente und bequeme in-vitro-Test ist notwendig, um die chemische Universum für spezifische Inhibitoren, RNA-Editing blockieren erkunden. Drei Tests wurden entwickelt und verwendet werden, um Aktivitäten zu überwachen editosome: (a) volle Runde in vitro RNA-Editing-Test 15, (b) in vitro RNA-Editing-Assay 16,17, vorge gespalten einnd (c) Hammerhead-Ribozym (HHR) basierenden Assay 18. Die ersten beiden Tests beruhen auf direkte Visualisierung des bearbeiteten Produktes (6 ATPase mRNA) mit Hilfe von Radioaktivität. Der HHR-basierten Assay verwendet eine modifizierte Version der ATPase 6 mRNA, die modelliert wird als ein Ribozym nach Bearbeitung verhalten. Die funktionelle Ribozym dann spaltet spezifisch eine radioaktiv markierte RNA-Substrat, als Reporter dient. Kürzlich Moshiri et al. Entwickelt ein "mischen und zu messen" In-vitro-Reporter-Assay HHR-Basis von RNA-Editing überwachen, wo das radioaktiv markierte RNA-Substrat mit einem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Substrat 19 ersetzt. Die prinzipiellen Vorteile dieses Tests sind: (a) es ist eine schnelle und bequeme Mischen und Messen Assaytyp, die Herstellung von aktiven Ribozym und Substratspaltung gleichzeitig erfolgen im gleichen Röhrchen in geringen Mengen (z. B. 20 ul), (b ) es die Verwendung von radioaktiv markierten Materialien vermeidet, (c) die Empfindlichkeit dass Adurch Fluoreszenz Instrumentierung in einem Mikrotiter-Plattenformat, und (d) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis fforded. Unter Verwendung dieses Tests wurde die Wirkung von bekannten RNA-Editing-Ligase Inhibitoren gegen gereinigtes editosome 19 bestätigt. Dieses Experiment bestätigt der Test für die schnelle Identifizierung von RNA-Editing-Hemmer, in erster Linie gegen ganze editosomes von T. brucei.
Fig. 1 ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Schema des fluoreszenzbasierten In-vitro-RNA-Editing-Assay. Dieses Protokoll kann entweder für die Überwachung der RNA-Editing in vitro oder einfach für das Screening von Substanzbibliotheken von verschiedenen Maßstäben angepasst werden verwendet werden.
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Protocol
Die folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zur Durchführung der fluoreszenzbasierten Assays RNA-Editierung. Der Assay kann in einem PCR-Röhrchen, 96-Well-oder 384-Well-Platten in Abhängigkeit von dem Umfang des Experiments durchgeführt werden. Anschließend wird das Fluoreszenzsignal kann auf einem geeigneten Echtzeit-PCR-Nachweissystem gelesen werden. Der Assay wird hier im Zusammenhang mit der 384-Well-Platten beschrieben.
1. Kultivierung T. brucei Cells
- Bereiten Sie ein Wachstumsmedium für T. brucei prozyklischen Form Zellen. Für 1 l Medium:
- Lösen 25,4 g SDM-79-Pulver in 800 ml MilliQ-Wasser.
- 2 g NaHCO 3 und pH-Wert auf 7,3 mit 10 M NaOH.
- In Nanopure-Wasser auf ein Volumen von 900 ml, Filter zu sterilisieren.
- Hinzufügen Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin-Streptomycin-Lösung und Hämin (2,5 mg / ml) bis zu Endkonzentrationen von 10% (v / v), 100 U / ml und 7,5 mg / l auf.
- Wachsen 300 ml T. <em> brucei 1.7A Wildtyp (prozyklischen Form)-Zellen bei 28 ° C, Schütteln bei 70 Umdrehungen pro Minute bis zu einer Dichte von 1,5 x 10 7 Zellen / ml. HINWEIS: Dies sollte 3 ml der aktiven editosome produzieren mit ~ 0,5 mg Gesamtprotein, ausreichend für 600 Bearbeitung Reaktionen.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Mit 50 ml gekühltem PBSG-Puffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl und 6 mM Glucose) Waschen des Pellets und Spin-down Zellen werden erneut durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
2. Isolierung von Mitochondrien Crude
HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis oder bei 4 ° C durchgeführt, um editosome Aktivität zu bewahren.
- Resuspendieren der geernteten Zellen in 30 ml DEE-Puffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA). Verwenden Sie eine 40 ml sterile Dounce Homogenisator (vorgekühlte), um die Zellmembran durch Streicheln auf und ab mindestens 10-mal auf Eis zu stören. 4,3 ml 60% Saccharose (w / v, dh 1,75 M) unmittelbar in den Homogenat zu einer Endkonzentration von 0,25 M Zentrifugieren bei 15.800 × g für 10 min bei 4 ° C, bevorzugt zu bringen Mitochondrien.
- Resuspendieren des Mitochondrienpellet in 4,6 ml STM-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose und 2 mM MgCl 2). Hinzufügen 13,8 ul 0,1 M CaCl 2 und 4 &mgr; l RNase-freier DNase I, um Endkonzentrationen von 0,3 mM und 9 U / ml. Inkubieren der Mischung für 1 Stunde auf Eis.
- Hinzufügen von 4,6 ml STE-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose und 2 mM EDTA), um das DNase I. Zentrifugieren bei 15.800 × g für 10 min bei 4 ° C inaktiviert
- Das Pellet in 400 ul Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl 2, 100 mM KCl, 1 ug / ml Pepstatin, 1 mM DTT und 1x komplett EDTA-freie Protease-Inhibitor) und Übertragung auf eine Mikrozentrifugenröhrchen.
- Hinzufügen von 10% Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 1%nd bebrüten das Lysat für 15 min bei 4 ° C auf einem Schwenker.
- Deaktivieren des mitochondrialen Lysat durch Zentrifugieren zweimal bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C; Beibehaltung der geklärte Überstand jeder Zeit.
3. Editosome Reinigung
- Pour à 10 ml 10% -30% (v / v) Glycerin linearen Gradienten (Tabelle 1) in ein Ultrazentrifugenröhrchen mit 2x HHE Gradienten-Puffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, und 2 mM EDTA) und ein Gradient Maker, indem Sie die Gebrauchsanleitung.
- Entfernen Sie vorsichtig 500 ul Lösung von der Spitze der Glycerin-Gradienten und schonend geladen werden 500 ul der mitochondrialen Lysat gelöscht. Schleudern bei 178.000 × g für 6 Stunden bei 4 º C unter Verwendung einer Ultrazentrifuge.
- Sequentielles Sammeln 500 ul-Fraktionen von der Oberseite zum Boden des Gradienten bei 4 ° C. Dann schnappen Einfrieren der Fraktionen mit flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Nutzung.
- Annealing der jeweiligen DNA-Matrize, die komplementäre Sequenz T7-Promotorsequenz (Tabelle 2) mit einem T7-Promotor-Oligonukleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in einem Molverhältnis von 1:1 durch Erhitzen bei 90 ° C für 3 Minuten und Abkühlen auf RT für mindestens 10 min.
- Transkribieren RNA mit Hilfe eines in-vitro-Transkription-Kit, indem Sie die Gebrauchsanleitung.
- Stoppen Sie die Transkription Reaktion durch Zugabe von gleichen Volumen von 7 M Harnstoff-Farbstoff (7 M Harnstoff, 0,05% Xylol Cynol und 0,05% Bromphenolblau). Führen Sie auf einem Filter sterilisiert 9% denaturierenden Polyacrylamid-Gel (9% Acrylamid, 7 M Harnstoff, 1x TBE).
- Verwenden Sie die Ultraviolett (UV)-Shadowing mit einem kurzwelligen UV-Lampe zu finden und Verbrauch jeweiligen RNA. Platzieren der ausgeschnittenen Gelstück in ein Mikrozentrifugenröhrchen und füge 400 ul Gel Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA und 0,25% SDS). Eluiere über Nacht bei RT auf einem Schwenker.
- PreciPitate der eluierten RNA durch Zugabe von 1 ml kaltem 100% Ethanol und Inkubation entweder bei -80 ° C für 30 min und 20 ° C über Nacht.
- Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um die RNA zu pelletieren unten.
- Mit 1 ml 75% Ethanol Waschen des Pellets. Zentrifugieren bei 16000 × g für 20 min bei 4 ° C
- Die RNA-Pellet in geeigneter Weise in RNase-freiem Wasser auf die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
5. Fluoreszenz-basierte RNA-Editing-Assay
- Für einen Reaktions kombinieren 1 pmol (1 ul) preA6Rbz und 2,5 pmol (1 ul) gA6Rbz (Molverhältnis 1:2,5) in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Inkubation bei 70 º C für 3 min und lassen Sie es bei RT sitzen an mindestens 10 min.
- Unterdessen bereiten einen Master-Mix unter Verwendung von Tabelle 3, ohne preA6Rbz und gA6Rbz, für die Bearbeitung aus 1x HHE Reaktionspuffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl und 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl 2, 16 ng / ul Torula-Hefe-RNA, 0,1% Triton X-100, und das gereinigte editosome.
- In geglüht preA6Rbz und gA6Rbz, um den Master-Mix zu vervollständigen.
- Verzichten 18 &mgr; l der Mastermischung (Tabelle 3) in die Vertiefungen, die entweder 2 &mgr; l RNase-freies Wasser (Vertiefungen ohne Verbindungen) oder 2 &mgr; l 200 &mgr; M chemischen Verbindungen und umfassen Kontrollproben in der Platte nach Fig. 5.
- Verschließen Sie die Platte mit einem Plattenabdeckung und drehen Sie die Platte nach unten, um die Luftblasen zu entfernen. Inkubieren bei 28 ° C für 4 Stunden.
- In 25 pmol (2 ul) gA6Rbz Wettbewerber in jede Vertiefung. Legen Sie eine frische Versiegelung, drehen Sie die Platte um und legen Sie es auf einer Echtzeit-PCR-Maschine. Programmieren Sie das folgende Experiment:
Schritt 1: 85 ° C für 5 min; Schritt 2: 24 ° C für 10 min; Schritt 3: Stop. - Werden 15 pmol (1 ul) des FRET-Substrat zu jeder Vertiefung bis zu einem Endvolumen von 23 ul. Verschließen Sie die Platte mit einem frischen Versiegelung.Schnell drehen die Platte und legen Sie sie wieder auf die Echtzeit-PCR-Maschine.
- Programmieren Sie einen neuen Versuch mit den folgenden Schritten:
Schritt 1: 37 ° C für 1 min; Schritt 2: Lesen; Schritt 3: Gehen Sie auf 1, 40 mal Schritt; Schritt 4: Stop. - Setup die Platte, indem Sie alle Brunnen, die Lektüre erfordern, und wählen Sie den FAM-Filter. Eingangsvolumen 23 ul und den Lauf starten.
- Berechnen Sie die Steigung der von jedem gut / Probe erhalten, um eine kinetische Messung durch Auftragen der Pisten auf einem Balkendiagramm für die Analyse zu erhalten Werte. HINWEIS: Eine kinetische Lese verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis zwischen der Probe und dem Hintergrund; als der Hintergrund Probe würde eine Steigung nahe Null haben. Ein Endpunkt Lesen hat eine höhere Hintergrundgeräusche.
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Representative Results
Um die notwendigen Schritte für den Aufbau einer großen Leinwand zeigen, erforderlich, Fig. 2-5 sind repräsentative Kontrollexperimenten auf die Qualität des Tests zusammen. Dies sind wesentliche Kontrollversuche für eine konsistente Assay über mehrere Tage zum Screenen oder zum Vergleich von verschiedenen Bildschirmen.
Die Bewertung der Fluoreszenz-Signal-zu-Rausch-Verhältnis
Um die Stabilität und die Qualität der Fluorescein-markierten Oligoribonukleotid Substrat in einer großen Einrichtung zu gewährleisten, wurde Z'-Faktor, definiert als die Differenz zwischen der Test-und der maximalen Hintergrundsignal mit der aktiven Ribozym-Molekül (A6Rbz) berechnet. . Assays mit Z'-Faktor> 0,5 für Hochdurchsatz-Bildschirm als akzeptabel Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten mit Hilfe der FRET-Substrats mit 5 Bezeichnung "Fluorescein (FAM; Emitter) und 3 'N, N'-Tetrathylrhodamine (TAMRA; Quencher) (A6Rbz_F / T). Dieses Substrat erzeugt eine Z'-Faktor von 0,64, berechnet unter Verwendung von 72 Wiederholungen in Gegenwart und Abwesenheit von A6Rbz.
In diesem Test eine Alternative Substrat mit Iowa Schwarz Dark Quencher (A6Rbz_F/Ib) ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten, verglichen mit TAMRA. Dies liegt daran, Iowa Schwarz, im Gegensatz zu TAMRA, absorbiert emittiert Energie als Wärme und nicht Licht. Der Z'-Faktor mit dem FAM / Iowa Black (F / Ib)-markierten Substrat erhalten 0,68. Die Verbesserung in der Z'-Faktor für die F / Ib-markierten Substrats über TAMRA-markierte Substrat ist wegen seiner relativ niedrigeren Hintergrund. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass beide Substrate praktikable Möglichkeiten für den Einsatz in einem Hochdurchsatz-Screening.
Die Bestimmung der Aktivitäten Bearbeiten von Glycerol Gradientenfraktionen
Um für Experimente zu bestimmen, und wählen Sie die aktivsten editosome Fraktionen, die glycerol Gradienten-Fraktionen wurden in vitro unter Verwendung der Bearbeitungs Fluoreszenz basierenden Assay (Schritt V) getestet. Diese Daten zeigen (Abbildung 3) als Fraktionen 7-12 der aktivsten Fraktionen (≥ 50% Bearbeitungs Aktivität; mit den meisten aktiven Fraktion als 100%). Diese Fraktionen können kombiniert werden, wenn mehr editosome erforderlich ist.
Berechnung der Z'-Faktor, wenn die Editosome Fraktionen wurden vereinigt
Um die Wirkung der combinig die editosome Fraktion zu bestimmen, wurde die Z'-Faktor-Wert von 0,6 berechnet, wenn die aktivsten Fraktionen (F8 + F9 + F10) wurden als Quelle für editosome verwendet. Um die Z'-Faktor 72 Wiederholungen wurden in Gegenwart und Abwesenheit des editosome (Fig. 4) getestet berechnen. Die F / Ib Substrat wurde in diesem Experiment verwendet. Diese Daten zeigen, daß bezogen auf die Z'-Faktor kombiniert die Glycerin-Gradienten-Fraktionen haben eine minimale Auswirkung auf die Qualität des Assays.
ass = "jove_content"> Repräsentative Kontrollexperiment für den Assay
Repräsentative Daten Vergleich verschiedener Kontrollproben wurden verwendet, um die Variablen in dem Test zu analysieren. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, nicht fehlen jegliche RNA-Editing Komponenten (Reaktionen 1-4)-Reaktionen nicht spaltet das Substrat. Spaltung des Substrats durch das Fluoreszenz-und relativen Bearbeitungsaktivität gemessen wird nur in Anwesenheit aller Komponenten der Bearbeitungs Reaktionen in Abwesenheit von Inhibitor (Reaktion 5) oder in Gegenwart von allen Bearbeitungskomponenten und einer inaktiven Verbindung (Reaktion beobachtet 6). Im Gegensatz dazu kann eine hemmende Verbindung RNA-Editing zu blockieren und wird als positive Kontrolle (Reaktion 7) eingesetzt. Hier wurden Mordant schwarz (MrB) und C53-Verbindungen als die positive und negative Kontrollen verwendet.
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Abbildung 1. Hammerhead-Ribozym-basierte in vitro RNA-Editing-Assay. A) Schritt-für-Schritt schematische Darstellung der Fluoreszenz-basierten in vitro-Assay Bearbeitung: (a) Hybridisierung des vorge bearbeitet Hammerhead-Ribozym (vor der Bearbeitung A6Rbz) mit seinem Führungs RNA (gA6Rbz). (B) Anerkennung und Interaktion der RNA Duplex durch das gereinigte editosome komplex. (C) Streichung von der RNA-Editing editosome katalysiert. (D) Dissoziation des bearbeiteten A6Rbz vom editosome gA6Rbz und durch Erhitzen bei 85 ° C und Zugabe von Führungs RNA Konkurrent (gA6Rbz_comp). (E) Hybridisierung des FRET-Substrat mit der aktiven A6 Hammerhead-Ribozym (aktiv A6Rbz). (F) Nachweis von FAM-Signale nach der Spaltung des FRET-Substrat durch die aktive Ribozym. B) Die vor der Bearbeitung Hammerhead-Ribozym (vor der Bearbeitung A6Rbz) wird in Verbindung mit gA6Rbz, die die Streichung von drei uns (Doppel Arro gibt gezeigtw) aus dem Schnittstelle (ES). Als Ergebnis der RNA-Editing in Gegenwart von funktionellen editosome die inaktive Ribozym in seine aktive Form (herausgegeben A6Rbz), die jetzt spalten kann das FRET-Substrat (Spaltungsstelle durch einen Pfeil angedeutet) bearbeitet. Die konservierte 5'-CUGA-3 'des bearbeiteten A6Rbz in der katalytischen Kern wesentlich für Ribozym-Aktivität (bearbeitet Ort) ist markiert (Diese Zahl hat sich von Moshiri 19 geändert wurde). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Signal-zu-Rausch-Verhältnis Vergleich zwischen FRET Substrate beherbergt verschiedene Quencher. Ribozyme (A6Rbz)-Aktivität mit FAM / TAMRA (F / T) und FAM / Iowa Schwarz FQ (F / Ib) Substraten. Die y-Achse represents Fluoreszenz beliebigen Einheit (FAU) pro Minute.
Abbildung 3. RNA-Editing-Aktivität ausgewählter Fraktionen aus Glycerin-Zentrifugation der mitochondrialen Lysat. Fraktion # 9 (F9) erhalten wird, hat die höchste Aktivität. Die y-Achse stellt die relativen Bearbeitungs Aktivität in Prozent, gemessen an F9 als 100%.
Abbildung 4. Z'-Faktor-Berechnung unter Verwendung der aktivsten Fraktionen (F8 + F9 + F10) als editosome Quelle. Experimental-Variation wurde von 72 Wiederholungen für jede Art von Reaktion erhalten. Z'-Faktor wurde als 0,6 berechnet. Die y-Achse stellt die relativen Bearbeitungstätigkeit.
5. Repräsentatives Experiment für die Fluoreszenz-basierten Assays RNA-Editing. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 20 ul pro Vertiefung und CFX384 TouchTM Echtzeit-PCR-Nachweissystem durchgeführt wurde für die Messung des Fluoreszenzsignals verwendet. Die Grafik zeigt verschiedene Steuerungen in Zusätzlich zu einer vollständigen Bearbeitung Reaktion, die alle Komponenten für den Test (# 5) enthält. Die Fluoreszenz wurde in Gegenwart von FRET-Substrat alleine (# 1), um die Integrität des Substrats gemessen wurde. Probe # 2 wurde in der Abwesenheit des editosome durchgeführt, um jede Ribozym-Aktivität vor der Bearbeitung überwachen. Um die Wirkung der denaturierten editosome auf dem Substrat zu bewerten, wurde die Fluoreszenz in Gegenwart des editosome und FRET-Substrat nur gemessen (# 3). Um die Führung gerichteten Bearbeitung Spezifität, ein sam testenweise in Abwesenheit von gA6Rbz verwendet wurde (Nr. 4). Ein nicht-inhibitorische (C53, # 6) und eine hemmende Verbindung (MrB, # 7) wurden verwendet, um die Auswirkung auf die Bearbeitungs Assay zu testen. Während RNA-Editing wird maßgeblich durch MrB gehemmt wird, hat C53 vernachlässigbaren Effekt. Die Fehlerbalken entsprechen einer experimentellen Variation (Standardabweichung) zwischen 10 Wiederholungen. Die y-Achse stellt die relativen Bearbeitungs Aktivität in Prozent, wenn man die vollständige Umsetzung (# 5) von 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE Gradientenpuffer | 5 ml | 5 ml |
| Glycerol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC-H 2 O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 ul | 10 ul |
Tabelle 1. 10% & 30% Glycerin-Lösung (10 ml jeweils).
| Pre-Ribozym bearbeitet A6 (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz DNA-Vorlage | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA Lager konz. | 1 uM |
| Leitfaden A6 Ribozym (gA6Rbz) | |
| gA6RBz DNA-Vorlage | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA Lager konz. | 2,5 uM |
| Leitfaden A6 Ribozym Wettbewerber (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp DNA-Vorlage | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA Lager konz. | 12,5 uM |
| Aktive A6 Ribozym (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA-Vorlage | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA Lager konz. | 1 uM |
| FRET-Substrat | |
| TAMRA Quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Schwarz Löscher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Schwarz-3 '(IDT) |
| RNA Lager konz. | 15 &mgr; M (für beide) |
Tabelle 2. DNA-und RNA-Substrate Vorlagen.
| Zusammensetzung | Bearbeiten Reaktion (ul) |
| 10x HHE | 1,5 |
| 0,1 M CaCl 2 | 1 |
| 100 mM ATP | 0,2 |
| 10% Triton X-100 | 0,2 |
| 500 ng / ul Torula Hefe-RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNase freiem H 2 O | 7.1 |
| 1 uM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 uM gA6Rbz | 1 |
| Gesamt | 18 |
Tabelle 3. Reaktion Zusammensetzung und Master Mix.
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Discussion
Ein neuartiges Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, um Inhibitoren gegen die RNA-Editing-Komplex von Trypanosomen identifizieren vorgestellt wurde, bietet ein neues Werkzeug für die Wirkstoffforschung an Krankheiten, die durch Trypanosomatiden verursacht zu begegnen. FRET-basierten Ribozym Assay wurde ausgiebig für verschiedene Zwecke verwendet, 20-22; Jedoch haben wir die Fähigkeit von FRET-Ribozym-Assay für die in vitro Überwachung der RNA-Editing Aktivität 19 verwendet. Dieser Test könnte auf andere Arten von RNA-Editing in Eukaryonten, wie Nukleotid-Substitution Bearbeitung von Kern-RNAs codiert Säugetier 23 angepasst werden.
Die Neuheit dieses Assay ist nicht gelungen, FRET-Assays Ribozym an sich, sondern in der Entwicklung eines Verfahrens, das diese Technik in ein RNA-Editing-Assay, der offen für Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien gegen editosome integriert ist. Das Ribozym Assay-basierte Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Bildschirmen und Eselays derzeit für diesen Zweck verwendet. Insbesondere bietet das Verfahren eine empfindliche und reproduzierbare "Mix-and-Measure"-Test sich auf einem fluoreszierenden Substrat im Gegensatz zu einem radiomarkierten ein, wodurch es für die Hochdurchsatz-Screening-19 passen. Echtzeitüberwachung eines Fluoreszenzsignals nach der Zugabe des Substrats anstelle eines einfachen Endpunktsignals macht es möglich, IC 50-Werte der Verbindungen untersucht 19 genauer zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht es Testung der inhibitorischen Wirkungen von Verbindungen auf den ganzen editosome-Komplex im Gegensatz zu einzelnen rekombinanten Proteinen. Aufgrund der Dynamik der Wechselwirkungen innerhalb Proteinkomplexen, kann es vorgeschlagen werden, daß dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Inhibitoren gegen editosome Proteine in einer biologisch repräsentativen Rahmen 24. Darüber hinaus, die auf das ganze editosome-Komplex bietet die Möglichkeit, potentiell verhaften das Fortschreiten der RNA-Editingbei verschiedenen Übergangsschritte, die bisher nicht identifiziert worden sind. So wird die Technik ermöglichen ein besseres Perspektive als die Interaktionen und Aktivitäten, die von entscheidender Bedeutung für den Prozess der RNA-Editing sind. Dieser Ansatz hat sich als erfolgreich zu sein, wie in der Vergangenheit durch die Aufklärung der prokaryotischen Ribosom komplexen Aufbau und die Funktion unter Verwendung von Antibiotika, wie Erythromycin und Viomycin Beispiel als Inhibitoren des Komplexes 24,25 wirkt.
Um den erfolgreichen Abschluss der Verfahren zu gewährleisten, kann bestimmte Anpassungen in Protokollen notwendig sein. Erstens ist die Wahl der richtigen Glyceringradienten mitochondrialen Extraktfraktion von entscheidender Bedeutung. Hier Fraktionen 7 bis 11, entsprechend dem ~ 20S-Region des Gradienten, zeigte die höchste Aktivität Bearbeitung mit Fraktion 9 maximale Aktivität zeigt. Zwar wurde dieser Anteil für alle der vorgestellten Tests ausgewählt, ist es wichtig, alle Fraktionen im Vorfeld zu testen, um zu beurteilen, in welchem fraction die Bearbeitungsaktivitätsspitzen. Zweitens Fraktion Auswahl zu bestätigen, ist es kritisch, Vorversuche durchzuführen, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Berechnung der Z'-Faktor-Wert zu beurteilen. Wenn die entsprechenden Mitochondrienextrakt Glycerin Gradientenfraktionierung abgeschlossen ist, kann eine Z'-Wert von 0,6 erreicht werden. Als nächstes empfiehlt es sich, neu zu bewerten, das Reaktionsvolumen der mitochondrialen Extrakt notwendig, um eine maximale Bearbeitungs Aktivität durch Titration 19 zu erreichen.
Eine wichtige Einschränkung der Technik in diesem Papier betrifft die mühsame und zeitraubenden Prozess der mitochondrialen Extrakt Glycerin-Fraktionierung, durch die der editosome Komplex wird 19 gereinigt. Trotz dieser Nachteile wird diese Technik bevorzugt vorgeschlagen, um rohes editosome Fraktionen aufgrund seiner geringen Kosten im Vergleich zu Ertragspotenzial zu erhalten, wodurch für die Anwendung auf Hochdurchsatz-Screening-Qualifying. Im Gegensatz dazu andere Methoden wie TAP-Tag purification, die um mehr editosome gereinigte Fraktionen erhalten werden, sind empfehlenswert für niedrige bis mittlere Durchsatzassays, wie in dem Fall von sekundären Assays. Darüber hinaus, um spezifische Hemmwirkung von Verbindungen zu gewährleisten, ist es notwendig, steuert, um sie gegen die Aktivität des Ribozyms (A6Rbz) in Abwesenheit des editosome testen umfassen. Es sei darauf hingewiesen, dass frühere Studien haben gezeigt, dass dieses Verfahren unwirksam Berechnung IC50-Werte für Farbstoff-ähnlichen Verbindungen aufgrund der möglichen Interferenzen bei hohen Konzentrationen der Verbindung 19 sein kann.
Um die Empfindlichkeit des HTS-Technik vorgestellt, die Entwicklung einer ähnlichen Fluoreszenz-basierten Assay, der pre-pre-gespalten bearbeitet Ribozym weiter zu erhöhen, ist von Vorteil. Dies würde es ermöglichen Umgehung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritt endonukleolytische Spaltung durch Endo in der editosome komplexe katalysiert. Ein weiterer Vorteil dieser modifizierten Assay würde die Anwendung als sekundäre Screening-Werkzeug, um den Effekt der durch die Primär Bildschirm auf ExoUase, TUTase und katalytische Aktivitäten Ligation identifizierten Inhibitoren überwachen. Die derzeit vorgeschlagenen Assay zum Nachweis von Hemmstoffen gegen die Deletion der Aktivität von RNA-Editing beschränkt. Daher wäre ein weiterer Weg zur Entdeckung der Änderung des dargestellten Assays, um die Überwachung der Wirkungen der Verbindung auf die Aktivität der RNA-Insertion Bearbeitung zu aktivieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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