Abstract
Aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van het mechanisme van mitochondriale RNA editing in trypanosomen. Ook heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het identificeren van de onderdelen van de editosome complex dat RNA editing katalyseren. Het is echter nog niet duidelijk hoe deze eiwitten samenwerken. Chemische verbindingen die wordt verkregen uit een high-throughput-scherm tegen de editosome kunnen blokkeren of invloed hebben op een of meer stappen in de montage cyclus. Daarom zal de identificatie van nieuwe chemische verbindingen waardevolle moleculaire probes voor het ontleden van de editosome functie en assemblage. In eerdere studies, werden in vitro bewerken testen uitgevoerd met behulp van radio-gelabelde RNA. Deze testen zijn tijdrovend, inefficiënt en niet geschikt voor high-throughput doeleinden. Hier, een homogene fluorescentie-based "mix en meet" hammerhead ribozym in vitro reporter assay om RNA editing bewaken, wordt gepresenteerd. Slechts als gevolg van RNA editing vande hamerhaai ribozyme een fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) oligoribonucleotide substraat ondergaat decollete. Dit resulteert in scheiding van de fluorofoor door de quencher waardoor een signaal produceert. Wanneer daarentegen de editosome functie wordt geremd, het fluorescentie signaal wordt gedoofd. Dit is een zeer gevoelige en eenvoudige test die algemeen voor monitoring van in vitro RNA editing of hoge doorvoer screening van chemische stoffen die de editosome functie kan remmen moeten zijn.
Introduction
Het proces van RNA editing, een post-transcriptionele mRNA modificatie, werd voor het eerst ontdekt in trypanosomatids 1. Sindsdien is veel werk verricht bij het bestuderen van het mechanisme achter RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In een reeks enzymatische reacties, het editosome, een kerncomplex van ongeveer 20 eiwitten creëert rijpe mitochondriale mRNAs voor meerdere componenten van de energieopwekking oxidatieve fosforylering systeem. De volgorde van katalytische gebeurtenissen is endonucleolytische splitsing, uridylate (U) toevoegen of verwijderen, en ligatie, zoals gedicteerd door gids-RNA's (gRNAs) 4.
Naast de kern editosome complexe eiwitten, een aantal toebehoren factoren ook geïdentificeerd 5-7. Deze eiwitten worden meestal gezien gegroepeerd onafhankelijke complexen. De volgorde van de proteïne assemblage in de kern editosome complex en interactiepatronen van de kerncomplex de accessoirecomplexen moeten nog worden bepaald. Gericht op de RNA bewerkingsproces in trypanosomatids kan chemische dissectors bieden die helpen bij het bestuderen van de aanmaak en functie van de editosome complex. Bovendien, functionele studies op verschillende editosome eiwitten hebben aangetoond wezenlijkheid in verschillende levensfasen, met vermelding van hun potentieel als drug targets 8-12. Daarom kunnen de gevonden remmers van de editosome ook als lead verbindingen tegen trypanosomatids. Dit is tijdig, zoals thans beschikbare middelen tegen ziekten veroorzaakt door trypanosomatid zijn giftig, inefficiënt en duur 13,14.
Een efficiënte en gemakkelijk in vitro test moet de chemische universe specifieke remmers die RNA editing blokkeren verkennen. Drie assays zijn ontwikkeld en gebruikt voor het bewaken editosome activiteiten: (a) volledig door in vitro RNA editing assay 15, (b) vooraf gesplitst in vitro RNA editing assay 16,17, eennd (c) hammerhead ribozyme (HHR)-gebaseerde test 18. De eerste twee assays afhankelijk directe visualisatie van het bewerkte product (ATPase 6 mRNA) met behulp van radioactiviteit. De HHR-gebaseerde test gebruikt een gewijzigde versie van de ATPase 6 mRNA dat wordt gemodelleerd te gedragen als een ribozym na bewerking. De functionele ribozym vervolgens splitst specifiek een radioactief gemerkt RNA substraat, die als verslaggever. Recentelijk Moshiri et al.. Ontwikkelde een "meng en meet" HHR-gebaseerde in vitro reporter assay te controleren RNA editing waarbij het radioactief gemerkte RNA-substraat wordt vervangen door een fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) substraat 19. Het principe voordelen van deze test zijn: (a) het een snelle en makkelijke mix en meet type assay, de productie van actieve ribozym en substraat splitsing plaatsvinden gelijktijdig in dezelfde buis klein volume (bijvoorbeeld 20 pi), (b ) vermijdt het gebruik van radioactief gemerkt materiaal, (c) gevoeligheid eenfforded door fluorescentie instrumenten in een micro-titer plaat formaat, en (d) een hoge signaal-ruisverhouding. Met deze test wordt het effect van bekende RNA editing ligase remmers tegen gezuiverd editosome bevestigd 19. Dit experiment gevalideerd assay voor de snelle identificatie van RNA editing remmers, vooral tegen hele editosomes van T. brucei.
Figuur 1 is een uitvoerige stap-voor-stap schema van de fluorescentie gebaseerde in vitro RNA editing assay. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bewaken RNA editing in vitro of gemakkelijk worden aangepast voor het screenen van bibliotheken van verbindingen van verschillende schalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderstaande protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van de fluorescentie gebaseerde RNA editing test. De test kan worden uitgevoerd in een PCR-buis, 96 putjes of 384 putjes afhankelijk van de omvang van het experiment. Vervolgens wordt de fluorescentie-signaal kan worden gelezen op een geschikte real-time PCR-detectie systeem. De test hier beschreven in de context van 384 putjes.
1. Kweken T. brucei Cellen
- Bereid een groeimedium voor T. brucei procyclische vorm cellen. Voor 1 liter medium:
- Los op 25,4 g SDM-79 poeder in 800 ml miliQ water.
- Voeg 2 g NaHCO3 en pH op 7,3 met 10 M NaOH.
- Voeg nanozuiver water tot een eindvolume van 900 ml, filter steriliseren.
- Voeg foetaal runderserum (FBS), penicilline-streptomycine-oplossing en hemine (2,5 mg / ml) tot eindconcentraties van 10% (v / v), 100 U / ml en 7,5 mg / L respectievelijk.
- Grow 300 ml T. <em> brucei 1,7 A wildtype (procyclische vorm) cellen bij 28 ° C, onder schudden bij 70 rpm tot een dichtheid van 1,5 x 10 7 cellen / ml. 0,5 mg totaal eiwit, voldoende voor 600 bewerken reacties Dit moet 3 ml actieve editosome produceren met ~: NOTE.
- Oogst de cellen door centrifugatie bij 6.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Was de pellet met 50 ml koud PBSG buffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2PO 4, 145 mM NaCI en 6 mM glucose) en spin down de cellen weer door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
2. Isolatie van ruwe Mitochondriën
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C tot editosome activiteit behouden.
- Resuspendeer de geoogste cellen in 30 ml DTE buffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 en 1 mM EDTA). Gebruik een 40 ml steriele Dounce homogenisator (voorgekoeld) aan het celmembraan verstoren door strijken en neer ten minste 10 keer op ijs. Voeg onmiddellijk 4.3 ml 60% sucrose (gew / vol, dwz 1,75 mol) aan het homogenaat tot een eindconcentratie van 0,25 M. Centrifugeer bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, om bij voorkeur neerhalen mitochondria.
- Resuspendeer de pellet in mitochondriale 4,6 ml STM-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM MgCl2). Voeg 13,8 ul van 0,1 M CaCl2 en 4 pi RNase-vrij DNase I tot eindconcentraties van 0,3 mM en 9 U / ml. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur op ijs.
- Voeg 4,6 ml STE-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM EDTA) aan de DNase I Centrifugeer inactiveren bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 400 ui lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 ug / ml pepstatine, 1 mM DTT, en 1 x volledige-EDTA-vrije proteaseremmer) en overbrengen in een microfugebuis.
- Voeg 10% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 1% pernd incubeer het lysaat gedurende 15 minuten bij 4 ° C op een buis rotator.
- Schakel de mitochondriale lysaat met tweemaal centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C; behoud van de heldere supernatant telkens.
3. Editosome Zuivering
- Giet 10 ml 10% -30% (v / v) glycerol lineaire gradiënt (tabel 1) in een ultracentrifuge buis met 2x HHE gradiënt buffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, en 2 mM EDTA) en een gradiënt maker door het volgen van de handleiding.
- Verwijder voorzichtig 500 pi oplossing van de bovenkant van de glycerol gradiënt en voorzichtig laden 500 ul van de geklaarde lysaat mitochondriale. Spin bij 178.000 xg gedurende 6 uur bij 4 ° C met behulp van een ultracentrifuge.
- Verzamel 500 pi fracties achtereenvolgens van boven tot onderaan de helling bij 4 ° C. Snap dan bevriezen de fracties met vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Gloeien de respectieve DNA-matrijs die sequentie complementair aan T7 promotersequentie (tabel 2) met een T7 promoter-oligonucleotide (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in een 1:1 molverhouding door verwarming bij 90 ° C gedurende 3 minuten en afkoelen bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten.
- Transcriberen RNA met behulp van een in vitro transcriptie kit door het volgen van de handleiding.
- Stop de transcriptie reactie door het toevoegen van een gelijk volume van 7 M ureum kleurstof (7 M ureum, 0,05% Xyleen Cynol, en 0,05% Broomfenolblauw). Voer een filter gesteriliseerde 9% denaturerende polyacrylamidegel (9% acrylamide, 7 M ureum, 1x TBE).
- Gebruik de ultraviolette (UV) schaduwen met een kortegolf UV-lamp op te sporen en accijnzen respectieve RNA. Plaats de uitgesneden gelstuk in een microcentrifugebuis en voeg 400 ul gel elutiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA en 0,25% SDS). Elueren nacht bij kamertemperatuur op een buis rotator.
- Precipitate de geëlueerde RNA door toevoeging van 1 ml van koude 100% ethanol en incubatie hetzij bij -80 ° C gedurende 30 minuten of -20 ° C overnacht.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C, tot pellet door het RNA.
- Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de RNA pellet adequate wijze RNase-free water om de gewenste concentraties te bereiken, zoals getoond in Tabel 2.
5. Fluorescentie-gebaseerde RNA bewerken Assay
- Voor een enkele reactie, combineer 1 pmol (1 pl) van preA6Rbz en 2,5 pmol (1 pl) van gA6Rbz (molaire verhouding 1:2,5) in een microfuge buis, incubeer bij 70 ° C gedurende 3 minuten en laat het zitten bij kamertemperatuur gedurende minste 10 minuten.
- Maak ondertussen een master mix met behulp van tabel 3, zonder de preA6Rbz en gA6Rbz, voor het bewerken reactie die 1x HHE buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl en 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl2, 16 ng / ul Torula gist RNA, 0,1% Triton X-100, en de gezuiverde editosome.
- Voeg getemperd preA6Rbz en gA6Rbz aan de master mix te voltooien.
- Pipetteer 18 ul van de master mix (tabel 3) in putjes bestaande uit 2 pl RNase-vrij water (putjes zonder verbindingen) of 2 ui 200 uM chemische verbindingen bevatten controlemonsters in de plaat volgens figuur 5.
- Dicht de plaat met een plaatafdichter en draai de plaat naar beneden, om eventuele luchtbellen te verwijderen. Incubeer bij 28 ° C gedurende 4 uur.
- Voeg 25 pmol (2 pl) van gA6Rbz concurrent aan elk putje. Zet een nieuwe sealer, draai de plaat naar beneden en leg hem op een real-time PCR machine. Programmeer het volgende experiment:
Stap 1: 85 ° C gedurende 5 minuten; Stap 2: 24 ° C gedurende 10 min; Stap 3: Stop. - Voeg 15 pmol (1 pl) van FRET substraat aan elk putje tot een eindvolume van 23 pi. Dicht de plaat met een frisse sealer.Snel draaien de plaat en plaats het terug op de real-time PCR machine.
- Programmeer een nieuw experiment met de volgende stappen:
Stap 1: 37 ° C gedurende 1 min; Stap 2: Lees; Stap 3: Ga naar 1, 40 maal Stap; Stap 4: Stop. - Setup de plaat door het selecteren van alle putten die het lezen nodig hebben en kiezen voor de FAM filter. Volume input 23 ul en start de run.
- Bereken de helling van de verkregen uit elk putje / monster een kinetische meting te verkrijgen door het uitzetten van de hellingen op een staafdiagram voor analyse waarden. OPMERKING: Een kinetisch gelezen verbetert de signaal-ruisverhouding tussen het monster en de achtergrond; als de achtergrond monster een helling dicht bij nul zou hebben. Een eindpunt lezing heeft een hogere achtergrondgeluiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De nodige stappen voor het opzetten van een grootschalige scherm tonen, figuren 2-5 zijn representatief controle-experimenten betreffende de kwaliteit van de assay. Deze zijn essentieel controleproeven voor een consistente bepaling meerdaagse screening of vergelijking van verschillende schermen.
Het beoordelen van de fluorescentie-signaal-ruis verhouding
Om de stabiliteit en kwaliteit van de met fluoresceïne gemerkte oligoribonucleotide substraat in een grootschalige installatie te waarborgen, Z'-factor, gedefinieerd als het verschil tussen de test en de maximale achtergrond signaal werd berekend met de actieve ribozyme molecule (A6Rbz). . Assays met Z'-factor> 0,5 aanvaardbaar geacht voor high-throughput screen Figuur 2 toont representatieve gegevens met behulp van de FRET substraat gelabeld met 5 'fluoresceïne (FAM, emitter) en 3' N, N'-tetramethylrhodamine (TAMRA; quencher) (A6Rbz_F / T). Dit substraat produceerde een Z'-factor van 0,64, berekend met behulp 72 herhalingen in de aanwezigheid en afwezigheid van A6Rbz.
In deze assay een alternatief substraat middels Iowa donker quencher (A6Rbz_F/Ib) een betere signaal-ruisverhouding geven opzichte TAMRA. Dit komt omdat Iowa Black, in tegenstelling tot TAMRA, emitteert geabsorbeerde energie als warmte en geen licht. De Z'-factor verkregen met de FAM / Iowa zwart (F / Ib)-gemerkte substraat was 0,68. De verbetering van de Z'-factor voor de F / Ib-gemerkt substraat via TAMRA-gemerkt substraat is vanwege de relatief lage achtergrond. Deze representatieve resultaten tonen dat beide substraten haalbare opties voor gebruik in een high-throughput screen.
Het bepalen van de bewerken Activiteiten van Glycerol gradiëntfracties
Om te bepalen en kies de meest actieve editosome fracties voor experimenten, de glycerol gradiënt fracties werden getest op in vitro-bewerking op de fluorescentie-gebaseerde test (stap V). Deze gegevens tonen (figuur 3) fracties 7-12 als de meest actieve fracties (≥ 50% bewerking activiteit, met de actieve fractie als 100%). Deze fracties kunnen worden gecombineerd wanneer meer editosome nodig.
Het berekenen van de Z'-factor bij de Editosome fracties werden gecombineerd
Om het effect van de combinig editosome wordt bepaald, de Z'-factor waarde van 0,6 werd berekend als de meest actieve fracties (F8 + F9 + F10) werden gebruikt als bron van editosome. De Z'-factor 72 replica werden getest in de aanwezigheid en afwezigheid van de editosome (figuur 4) te berekenen. De F / Ib substraat werd gebruikt in dit experiment. Deze gegevens tonen dat op basis van de Z'-factor, gecombineerd glycerol gradiënt fracties hebben minimaal effect op de kwaliteit van de assay.
ass = "jove_content"> Vertegenwoordiger controle-experiment voor de Assay
Representatieve gegevens vergelijken van verschillende controlemonsters werden gebruikt om de variabelen in de assay geanalyseerd. Zoals getoond in figuur 5, heeft reacties ontbreekt elk RNA editing componenten (reacties 1-4) niet hechten het substraat. Splitsing van het substraat gemeten door de fluorescentie en relatieve bewerking activiteit alleen waargenomen in aanwezigheid van alle componenten van de bewerking reacties in de afwezigheid van een remmer (reactie 5) of in aanwezigheid van alle bewerkingen componenten en een inactieve (reactie 6). Daarentegen kan een remmende verbinding RNA editing blokkeren en wordt gebruikt als een positieve controle (reactie 7). Hier, Mordant Zwart (MrB) en C53 verbindingen werden gebruikt als positieve en negatieve controles, respectievelijk.
ghres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Hammerhead ribozym gebaseerde in vitro RNA editing assay. A) stap voor stap schematische voorstelling van de fluorescentie gebaseerde in vitro assay bewerking: (a) Hybridisatie van vooraf bewerkte hammerhead ribozym (vooraf bewerkte A6Rbz) met gids RNA (gA6Rbz). (B) Erkenning en interactie van de RNA duplex door het gezuiverde editosome complex. (C) Verwijdering RNA editing gekatalyseerd door het editosome. (D) Dissociatie van het geredigeerde A6Rbz de editosome en gA6Rbz door verwarming bij 85 ° C en toevoeging van een lijst RNA concurrent (gA6Rbz_comp). (E) Hybridisatie van de FRET substraat met de actieve A6 hammerhead ribozyme (actieve A6Rbz). (F) detectie van FAM signalen na splitsing van de FRET substraat door de actieve ribozyme. B) De pre-bewerkte hammerhead ribozym (vooraf bewerkte A6Rbz) wordt getoond in samenwerking met gA6Rbz dat het schrappen van drie ons (tweekoppige arro specificeertw) van de redactie website (ES). Door RNA editing in aanwezigheid van functionele editosome de inactieve ribozym wordt uitgegeven in zijn actieve vorm (aangepast A6Rbz) dat nu kan splitsen de FRET substraat (splitsingsplaats aangegeven door een pijl). De geconserveerde 5'-CUGA-3 'van de bewerkte A6Rbz in de katalytische kern van essentieel belang voor ribozymactiviteit (bewerkt website) is gemarkeerd (Dit cijfer is aangepast Moshiri 19). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Signaal-ruisverhouding vergelijking tussen FRET substraten herbergen verschillende quenchers. Ribozyme (A6Rbz) activiteit met behulp van FAM / TAMRA (F / T) en FAM / Iowa Black FQ (F / Ib) substraten. De y-as represents fluorescentie willekeurige eenheid (FAU) per minuut.
Figuur 3. RNA editing activiteit van geselecteerde fracties verkregen uit glycerol gradiëntcentrifugering van de mitochondriale lysaat. Fraction # 9 (F9) heeft de hoogste activiteit. De y-as geeft de relatieve bewerking activiteit in procenten, gezien F9 als 100%.
Figuur 4. Z'-factor berekend met de meest actieve fracties (F8 + F9 + F10) als editosome bron. Experimentele variant werd verkregen uit 72 herhalingen van elk type reactie. Z'-factor werd berekend als 0,6. De y-as geeft de relatieve bewerking activiteit.
Werden Figuur 5. Representatief experiment voor fluorescentie gebaseerde RNA editing test. Reacties uitgevoerd in een eindvolume van 20 pl per putje en CFX384 TouchTM real-time PCR detectiesysteem werd gebruikt voor het meten van het fluorescentiesignaal. De grafiek toont diverse controles naast een volledige bewerking reactie die alle onderdelen van de test (# 5) bevat. De fluorescentie werd gemeten in aanwezigheid van FRET substraat alleen (# 1) om de integriteit van het substraat te beoordelen. Monster # 2 werd uitgevoerd in afwezigheid van de editosome elk ribozyme activiteit vóór bewerking te controleren. Om het effect van gedenatureerd editosome op het substraat te beoordelen, werd de fluorescentie gemeten in aanwezigheid van de editosome en FRET substraat alleen (# 3). Om de gids gericht bewerken specificiteit, een sam testenPLE bij afwezigheid van gA6Rbz gebruikt (# 4). Een niet-remmende (C53, nr. 6) en een remmende verbinding (MrB, # 7) werden gebruikt om het effect op de bewerking assay. Terwijl RNA editing sterk wordt geremd door MrB, C53 heeft een verwaarloosbaar effect. De fout corresponderen met een experimentele variatie (standaardafwijking) van 10 duplo's. De y-as geeft de relatieve bewerking activiteit in procenten, gezien de volledige reactie (# 5) als 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE gradiëntbuffer | 5 ml | 5 ml |
| Glycerol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H2O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 gl | 10 gl |
Tabel 1. 10% en 30% glycerol oplossing (10 ml per stuk).
| Vooraf bewerkte A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz DNA template | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA voorraad conc. | 1 uM |
| Gids A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| gA6RBz DNA template | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA voorraad conc. | 2,5 uM |
| Gids A6 Ribozyme Concurrent (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp DNA template | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA voorraad conc. | 12,5 uM |
| Actieve A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA template | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA voorraad conc. | 1 uM |
| FRET substraat | |
| TAMRA quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Black quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA voorraad conc. | 15 uM (voor) |
Tabel 2. DNA sjablonen en RNA Substrates.
| Samenstelling | Reactie bewerken (pl) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0,1 M CaCl2 | 1 |
| 100 mM ATP | 0.2 |
| 10% Triton X-100 | 0.2 |
| 500 ng / ul Torula gist RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNase-free H2O | 7.1 |
| 1 uM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 uM gA6Rbz | 1 |
| Totaal | 18 |
Tabel 3. Reaction Samenstelling en Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een nieuwe high-throughput screening methode om remmers tegen de RNA editing complex van Trypanosomen identificeren werd gepresenteerd, het verstrekken van een nieuw instrument voor drug discovery aan ziekten veroorzaakt door trypanosomatids tegen te gaan. FRET-gebaseerde ribozym test wordt veelvuldig gebruikt voor verschillende doeleinden 20-22; echter, hebben we de capaciteit van FRET-gebaseerde ribozym assay in vitro volgen van RNA editing activiteit 19 gebruikt. Deze assay zou kunnen worden aangepast aan andere typen RNA editing in eukaryoten, zoals nucleotidesubstitutie bewerken van kern gecodeerde RNA's van zoogdieren 23.
De nieuwheid van deze test is het vaststellen FRET-gebaseerde assays ribozym zichzelf, maar de ontwikkeling van een methode die deze techniek verwerkt in een RNA editing test die vatbaar is voor hoge doorvoer screening van chemische stoffen tegen editosome. De ribozym-assay gebaseerde methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere schermen en kontegen momenteel gebruikt voor dit doel. Met name de techniek biedt een gevoelige en reproduceerbare "mix-and-maat" assay vertrouwen op een fluorescent substraat in plaats van een radioactief is, waardoor het geschikt voor hoge-doorvoer screening 19. Real-time monitoring van een fluorescentiesignaal na toevoeging van het substraat in plaats van een eenvoudige eindpunt signaal maakt het mogelijk om nauwkeuriger te bepalen IC 50-waarden van verbindingen getest 19. Bovendien maakt het testen van de remmende effecten van verbindingen op de gehele editosome complex in tegenstelling tot individuele recombinante eiwitten. Gezien de dynamische aard van interacties binnen eiwitcomplexen kan worden gesuggereerd dat deze werkwijze maakt de identificatie van remmers tegen editosome eiwitten in een biologisch representatieve instelling 24. Bovendien, gericht op de hele-editosome complex biedt een mogelijkheid om potentieel arresteren de progressie van RNA editingop verschillende transiënte stappen die niet eerder geïdentificeerd. Zo zal de techniek mogelijk om een beter perspectief interacties en activiteiten die cruciaal zijn voor het proces van RNA editing zijn. Deze benadering is gebleken succesvol te zijn in het verleden zoals bijvoorbeeld de opheldering van prokaryote ribosomen complexe assemblage en functie die antibiotica, zoals erythromycine en viomycine, als remmers van het complex 24,25.
Om de succesvolle afronding van de methode te waarborgen, kunnen bepaalde aanpassingen in protocollen nodig zijn. Eerste selectie van de echte glycerol gradiënt mitochondriale extractfractie cruciaal. Hier fracties 7 tot 11, overeenkomend met de ~ 20S gebied van de gradiënt, toonde de hoogste activiteit bewerken met fractie 9 vertonen maximale activiteit. Hoewel deze fractie werd geselecteerd voor elk van de gepresenteerde proeven, is het essentieel om alle fracties vooraf testen om te bepalen waarin fractie de editing activiteit pieken. Ten tweede, fractie selectie bevestigen, is het essentieel om inleidende tests uitvoeren om de signaal-ruisverhouding bepalen door het berekenen van de Z'-factor waarde. Als de juiste mitochondriale extract glycerol gradiënt fractionering is voltooid, kan een Z'-waarde van 0,6 bereikt. Vervolgens is het raadzaam om opnieuw te evalueren de reactie volume van mitochondriale extract nodig is om maximale bewerken activiteit te bereiken via titratie 19.
Een belangrijke beperking van de in dit document techniek betreft het moeizame en tijdrovende mitochondriale extract glycerol gradiënt fractionering waarbij de editosome complex wordt 19 gezuiverd. Ondanks deze nadelen, is deze techniek bij voorkeur voorgesteld om ruwe editosome fracties gezien de lage kosten versus opbrengst potentieel te verkrijgen, waardoor de kwalificatie voor toepassing op high-throughput screening. Daarentegen, andere methoden, zoals TAP-tag puhet zuiveren, die in staat zijn om meer gezuiverde editosome fracties geven zijn, zijn aan te raden voor lage tot gemiddelde throughput testen zoals in het geval van secundaire analyses. Bovendien, teneinde specifieke remmende effect van verbindingen garanderen, is het noodzakelijk om controles te toetsen aan de activiteit van ribozyme (A6Rbz) bij afwezigheid van de editosome omvatten. Opgemerkt moet worden dat eerdere studies hebben aangetoond dat deze methode niet effectief bij het berekenen IC50 waarden voor kleurstof-achtige verbindingen vanwege de mogelijke interferentie bij hoge concentraties verbinding 19 kan zijn.
Om verder de gevoeligheid van de HTS techniek voorgesteld, ontwikkelen een vergelijkbare fluorescentie gebaseerde assay waarbij pre-gesplitst vooraf bewerkte ribozym is gunstig. Dit zou het omzeilen van de snelheidsbeperkende endonucleolytische splitsing stap gekatalyseerd door endonucleases in de editosome complex. Een ander voordeel van deze gewijzigde bepaling zou de toepassing als secundaire screening toolhet effect van de remmers die door de primaire scherm ExoUase, TUTase en ligatie katalytische activiteiten te controleren. De voorgestelde bepaling is beperkt tot de detectie van remmers tegen deletie type RNA editing. Derhalve zou een andere weg verkennen de wijziging van de gepresenteerde assay monitoring van verbinding effecten op het inbrengen type RNA editing mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
