Abstract
実質的な進歩は、トリパノソーマにおけるミトコンドリアRNA編集のメカニズムを決定する際になされたものである。同様に、かなりの進歩は、RNA編集を触媒editosome複合体の成分を同定してなされたもの。しかし、これらのタンパク質がどのように連携するか、まだ明らかではない。 editosomeに対するハイスループットスクリーニングから得られた化学化合物は、編集サイクルにおける1つ以上のステップをブロックするか、または影響を及ぼし得る。したがって、新規な化学化合物の同定はeditosome機能およびアセンブリを切開するための貴重な分子プローブを生成する。以前の研究において、 インビトロ編集アッセイは、放射標識RNAを用いて行った。これらのアッセイは、ハイスループット目的のために非効率的で時間のかかる不適当である。ここでは、均質な蛍光ベース「ミックスと測定」RNA編集を監視するためにハンマーヘッドリボザイムのin vitroレポーターアッセイを、提示されている。唯一のRNA編集の結果としてハンマーヘッド型リボザイム蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）オリゴリボヌクレオチド基質は、切断を受ける。これは、順番に、それによって信号を生成するクエンチャーからのフルオロフォアの分離をもたらす。 editosome機能が阻害されると対照的に、蛍光シグナルをクエンチする。これは、 インビトロ RNA編集またはeditosomeの機能を阻害することができる化学物質のハイスループットスクリーニングで監視することが一般的に適用可能であるべきで高感度かつ簡単なアッセイである。
Introduction
RNA編集、mRNAの転写後修飾のプロセスは、第1 trypanosomatidsに発見された。それ以来、かなりの作業がトリパノソーマ 2,3におけるRNA編集のメカニズムを研究してなされた。一連の酵素反応において、editosome、約20のタンパク質のコア複合体は、エネルギー発生の酸化的リン酸化系の複数のコンポーネントのための成熟したミトコンドリアmRNAを作成する。触媒のイベントの順序は、ガイドRNA（gRNAs）によって指示されるように、ヌクレオチド鎖切断、ウリジレート（U）追加や削除、および連結される4。
コアeditosome複合タンパク質に加えて、補因子の数も5-7同定されている。これらのタンパク質は、主に独立した複合体にグループ化が見られる。しかし、コアeditosome複合体におけるタンパク質集合の順序や小物とのコア複合体の相互作用パターン複合体は、まだ決定されている。 trypanosomatidsにおけるRNA編集処理をターゲットとすると、そのeditosome複合体の構築と機能を研究する際の補助化学解剖器具を提供することがあります。さらに、いくつかのeditosomeタンパク質に関する機能的研究は、薬剤が8月12日を対象として、その可能性を示す、様々なライフステージ全体の本質を示している。したがって、editosome見出さの阻害剤はまた、trypanosomatidsに対するリード化合物として作用することができる。トリパノソーマによって引き起こされる疾患に対して、現在利用可能な薬剤は、毒性が非効率的で13,14高価ですので、これは、タイムリーである。
効率的で便利なin vitroアッセイは、RNA編集をブロックする特異的阻害剤の化学の世界を探求することが必要である。 3つのアッセイが開発されeditosome活動を監視するために使用されている： インビトロ RNA編集アッセイ15（a） において 、フルラウンド、（b）は、 インビトロ RNA編集アッセイ16,17 に予め切断されND（C）ハンマーヘッドリボザイム（HHR）ベースのアッセイ18。最初の2つのアッセイは、放射能の助けを借りて編集された製品（ATPアーゼ6 mRNA）の直接可視化に依存しています。 HHRベースのアッセイは、編集時リボザイムとして動作するようにモデル化されているATPアーゼ6 mRNAの修正版を使用しています。機能的なリボザイムはその後、具体的レポーターとして、放射性標識されたRNA基質を切断する。最近、母子里らは、「ミックスおよび測定」を開発放射性標識RNA基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）基板19で置換されているRNA編集を監視するために、インビトロレポーターアッセイで HHR系。このアッセイの原理の利点は、（a）は、アクティブリボザイムと基質切断の生産が低量（ すなわち 20μL）で同一チューブ内で同時に発生すると、迅速かつ便利なミックスと分析の指標の一種で、（B ）は、放射性標識物質の使用を回避し、（c）の感度すなわち蛍光マイクロタイタープレート形式で計測、および（d）は高い信号対雑音比によってfforded。このアッセイを用いて、精製されたeditosomeに対する既知のRNA編集リガーゼ阻害剤の効果は、19を確認した。この実験は、主にTから全体editosomesに対して、RNA編集酵素阻害剤の迅速な同定のためのアッセイを検証ブルーセイ 。
図1は、蛍光ベースのインビトロ RNA編集アッセイでの詳細なステップバイステップの概略図である。このプロトコルは、 インビトロで監視RNA編集のために使用することができるいずれかまたは容易に様々なスケールの化合物ライブラリをスクリーニングするために適合され得る。
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Protocol
以下のプロトコルは、蛍光ベースのRNA編集アッセイを実施するための手順について説明します。アッセイは、96ウェルまたは384ウェルプレートを実験の範囲に応じて、単一PCRチューブで行うことができる。続いて、蛍光シグナルは、適切なリアルタイムPCR検出システムで読み取ることができる。ここでアッセイは、384ウェルプレートの文脈で説明されている。
1。培養T.トリパノソーマ細胞
- Tの増殖培地を準備しますトリパノソーマプロサイクリック型細胞。培地1Lの場合：
- 800ミリリットルミリQ水に25.4グラムSDM-79粉末を溶解。
- 10 M NaOHで7.3にNaHCO 3およびpHを2グラムを加える。
- 900ミリリットル、濾過滅菌の最終容量にナノ純水を追加します。
- 10％の最終濃度までウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン - ストレプトマイシン溶液及びヘミン（2.5 mg / mlで）を加える（v / v）で、100 U / mlおよび7.5 mg / Lであった。
- <Tの300ミリリットルを育てる1.5×10 7細胞/ mlの密度に70rpmで振盪em>のトリパノソーマ1.7A野生型（プロサイクリック型）28℃での細胞。注：これは600の編集反応に十分の全タンパク質の約0.5 mgのアクティブeditosomeの3ミリリットルを生成する必要があります。
- 4℃で10分間、6,000×gの遠心分離により細胞を収穫
- 冷却したPBSG緩衝液（10mMのNa 2 HPO 4、10mMのNaH 2 PO 4、145mMのNaCl、および6 mMグルコース）50mlでペレットを洗浄し、10分間10,000 xgでの遠心分離によって細胞を再度スピンダウン4℃
原油ミトコンドリアの2。分離
注：すべてのステップがeditosome活性を保つために氷の上で、または4℃で行われるべきである。
- DTE緩衝液（1mMのトリス-HCl、8.0および1mM EDTA）30ml中に回収した細胞を再懸濁する。アップなでる上下氷上に少なくとも10倍の細胞膜を破壊する40ミリリットルの無菌ダウンスホモジナイザー（予備冷却）を使用します。 優先的にミトコンドリアをダウンさせるために、4℃で10分間15800×gで0.25メートル遠心機の最終濃度にホモジネートに、すぐに4.3ミリリットル60％ショ糖（ すなわち 1.75 M W / V）を追加します。
- STM緩衝液（20mMトリス-HCl、pH8.0、250mMのスクロースおよび2mMのMgCl 2）4.6mlのミトコンドリアペレットを再懸濁。私はそれぞれ0.3mmであり、9 U / mlの、最終濃度を0.1MのCaCl 2の13.8μlのRNaseフリーのDNaseの4を添加する。氷上で1時間混合物をインキュベートする。
- 4℃で10分間15,800 xgで遠心I. DNアーゼを不活性化するSTE緩衝液（20mMのTris-HCl pH8.0、250 mMスクロースおよび2mM EDTA）4.6 mlを加え
- 400溶解緩衝液（10mMのトリス-HCl、pH7.2、10mMのMgCl 2、100mMのKCl、1μg/ mlのペプスタチン、1mMのDTT、および1×完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤）とへの転送中にペレットを再懸濁マイクロチューブ。
- 10％トリトンX-100、1％aの最終濃度に追加ndはチューブローテーター上、4℃で15分間、溶解物をインキュベートする。
- 4℃で15分間17000×gで2回遠心分離することにより、ミトコンドリアの溶解液をクリア。クリア上澄みを毎回保持。
3。Editosome精製
- ミリモルのMg（OAcを含む）20、2×HHE勾配緩衝液（40mMのHEPES pHが7.9を使用して、超遠心分離管中の10 mlの10％〜30％（v / v）の線形グリセロール勾配（ 表1）を注ぐ2、100mMのKCl、および2 mMのEDTA）および取扱説明書に従うことによって、勾配メーカー。
- 慎重にグリセロール勾配の上部から溶液500μlを除去し、静かにクリアされ、ミトコンドリア溶解物500μLをロードします。超遠心機を用いて、4℃で6時間178000×gでスピン。
- 4℃で、勾配の上から下へ順に500μlの画分を収集その後の使用まで-80℃で液体窒素とストアを使用して分画を凍結スナップ。
- 3分間90℃で加熱することにより、1:1のモル比でT7プロモーターオリゴヌクレオチド（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）を用いてT7プロモーター配列（ 表2）に相補的な配列を含有し、RTに冷却し、それぞれのDNA鋳型をアニール少なくとも10分間。
- 取扱説明書に従って、 インビトロ転写キットを用いてRNAを転写する。
- 7 M尿素染料（7 M尿素、0.05％キシレンCynol、および0.05％ブロモフェノールブルー）を等量加えることで転写反応を停止します。 9％のポリアクリルアミドゲル（10％アクリルアミド、7 M尿素、1X TBE）を変性滅菌フィルター上で実行されます。
- それぞれのRNAを見つけて切除する短波UVランプでシャドーイング紫外線（UV）を使用します。微量遠心チューブに切り出したゲル片を置き、ゲル溶出緩衝液（20mMトリス-HCl、pH7.5、250mMのNaOAcを、1mMのEDTAおよび0.25％SDS）400μlを添加する。チューブローテーター上で室温で一晩溶出する。
- PRECI冷100％エタノール1mlを添加し、30分間または-20°Cで一晩-80℃のいずれかでインキュベートすることによって溶出したRNAをpitate。
- RNAをダウンペレットを4℃で30分間16,000×gで遠心分離、。
- 75％エタノール1mlでペレットを洗浄。 4℃で20分間16,000 xgで遠心分離
- 表2に示すように、所望の濃度を達成するのRNaseフリー水で適宜RNAペレットを再懸濁する。
5。蛍光ベースのRNA編集アッセイ
- 単一反応のため、preA6Rbzやマイクロチューブ内gA6Rbz（1:2.5モル比）の2.5ピコモル（1μL）の1ピコモル（1μl）を組み合わせて、3分間70ºCでインキュベートし、時のために、それが室温で放置少なくとも10分。
- 一方、1×HHE緩衝液（25mM HEPES pH7.9の、10mMののMg（OAc）として保護2、50mMのKCl及び10mM EDTA）、1mMの含有校正反応のために、preA6RbzとgA6Rbzことなく、 表3を用いて、マスターミックスを調製ATP、5mMのCaCl 2、トルラ酵母RNA、0.1％トリトンX-100、および精製editosomeの16 ngの/μlの。
- マスターミックスを完成するためにアニールpreA6RbzとgA6Rbzを追加します。
- RNaseフリー水（無化合物を有するウェル）または200μMの化学化合物の2液の2液のいずれかを含むウェルにマスターミックス（ 表3）の18μLを分注すると、図5によると、プレート内のコントロールサンプルが含まれています。
- プレートシーラーでプレートをシールし、気泡を除去するために、下にプレートを回転。 4時間28℃でインキュベートする。
- 各ウェルにgA6Rbzのライバルの25ピコモル（2μL）を追加します。新鮮なシーラーを置き、下にプレートを回転し、リアルタイムPCR装置の上に置きます。以下の実験をプログラムする：
ステップ1：5分間85℃;ステップ2：10分間24℃;ステップ3：停止します。 - 23μLの最終容量に各ウェルに、FRET基質の15ピコモル（1μL）を追加します。新鮮なシーラーでプレートをシール。すぐにプレートを回転し、リアルタイムPCR装置の上に戻って配置します。
- プログラムは、以下の手順を使用して新しい実験：
ステップ1：1分間37°C;ステップ2：読み出し;ステップ3：1、40回に進み;ステップ4：停止します。 - 読書を必要とし、FAMフィルターを選択し、全てのウェルを選択することで設定プレート。入力23μL、ボリュームとファイル名を指定して実行を開始します。
- 分析のためのバーグラフに傾きをプロットすることによって動力学的測定値を得るために、各ウェル/試料から得られた値の傾きを算出する。 NOTE：運動読取サンプルと背景との間の信号対雑音比を改善する;バックグラウンドサンプルはゼロに近い傾斜を有する場合と同じです。終点の読みはより高いバックグラウンドノイズを有する。
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Representative Results
大型画面を設定するために必要な必要な手順を示すために、2〜5がアッセイの品質に関する代表対照実験である図 。これらは、スクリーニングの数日にわたって一貫性のあるアッセイのための、または異なる画面を比較するための不可欠な対照実験である。
蛍光信号対雑音比を評価すること
大規模なセットアップのフルオレセイン標識オリゴリボヌクレオチド基質の安定性と品質を確保するために、アッセイバックグラウンドおよび最大シグナルの差として定義Z'-因子は、活性リボザイム分子（A6Rbz）を用いて計算した。 0.5は、ハイスループットスクリーニングのために許容できると考えている> Z '因子を用いたアッセイ図2 5'フルオレセイン（FAM、エミッタ）および3 'で標識したFRET基質を用いて代表的なデータを示しています。 のN、N' -テトラローダミンイソ（TAMRA、クエンチャー）（A6Rbz_F / T）。この基板は、A6Rbzの存在下および非存在下で72回の反復を用いて算出0.64のZ '因子を産生した。
このアッセイにおいて、アイオワブラックダーククエンチャー（A6Rbz_F/Ib）を使用して別の基板は、TAMRAと比較してより良好な信号対雑音比を得ることができる。アイオワ州ブラック、TAMRAとは異なり、発光する光エネルギーを熱として吸収されていないためです。 FAM /アイオワ州ブラック（F / IB）で標識された基質を用いて得られたZ '因子は0.68だった。 TAMRAで標識された基板上に、F / IB-標識基質のためのZ '因子の改善は、その比較的低いバックグラウンドである。これらの代表的な結果は、両方の基板は、高スループットスクリーニングにおいて使用するための実行可能な選択肢であることを示している。
グリセロール勾配分画の編集活動を決定する
、グリセロを実験するための最も活発なeditosome分率を決定し、選択するにはLの勾配画分を、蛍光ベースのアッセイ（ステップV）を用いてインビトロで編集するために試験した。これらのデータは、最も活性の高い画分（; 100％と最も活性画分との≥50％編集活動）として（ 図3）画分7月12日を示しています。よりeditosomeが必要な場合にこれらの画分を組み合わせることができる。
Editosome画分を合わせたときにZ '因子を計算する
最も活性の高い画分（F8キー+ F9キー+ F10キー）をeditosomeの供給源として使用したときeditosome分率をcombinigの効果を決定するために、0.6のZ '因子の値を算出した。 Z'-ファクターを計算するために72回の反復をeditosome（ 図4）の存在下および非存在下で試験した。 F / Ibの基板はこの実験で使用した。これらのデータは、グリセロールグラジエント画分を組み合わせるZ'-因子に基づくアッセイの品質に対して最小限の影響を有することを示す。
お尻= "jove_content"> アッセイのための代表的な制御実験
別の対照試料と比較する代表的なデータをこのアッセイ中の変数を分析した。 図5に示すように、任意のRNA編集成分（反応1-4）欠落反応は基質を切断しない。蛍光および相対編集活性によって測定される基質の切断のみ阻害剤（反応5）の非存在下での、またはすべての編集コンポーネントの存在および不活性な化合物（反応における編集の反応のすべての成分の存在下で観察される6）。対照的に、阻害性化合物は、RNA編集をブロックすることができ、陽性対照（反応7）として使用される。ここで、モーダントブラック（MRB）とC53化合物は、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
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図1。ハンマーヘッドリボザイムベースのインビトロ RNA編集アッセイで 。 A）ステップバイステップ蛍光ベースの体外編集アッセイでの模式図：そのガイドRNA（gA6Rbz）と編集前のハンマーヘッド型リボザイム（編集前のA6Rbz）の（a）のハイブリダイゼーションを。 （b）の認識と、精製editosome複合体によるRNA二重鎖との相互作用。 editosomeによって触媒（C）の削除RNA編集。 （D）85℃で加熱し、ガイドRNAのライバル（gA6Rbz_comp）の添加によりeditosomeとgA6Rbzから編集されたA6Rbzの解離。 （E）アクティブA6のハンマーヘッド型リボザイム（アクティブA6Rbz）でのFRET基質のハイブリダイゼーション。 （F）アクティブリボザイム。B）編集前のハンマーヘッド型リボザイム（A6Rbz編集前）でのFRET基質の切断を次のFAM信号の検出は、3会社の削除（双頭arroを指定gA6Rbzに関連して示されている編集部位（ES）からW）。機能editosomeの存在下でRNA編集の結果、非アクティブなリボザイムは、現在、FRET基質（矢印で示した切断部位）を切断することができる（A6Rbzを編集した）活性型に編集されている。保存された5'-CUGA-3 '、編集A6Rbzのリボザイム活性（編集されたサイト）に不可欠な触媒コアがハイライトされている中で（この図は母子里19から変更されている）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2の異なるクエンチャーを保有するFRET基質との間の信号対雑音比の比較 。 FAM / TAMRA（F / T）を用いて、リボザイム（A6Rbz）活性およびFAM /アイオワブラックFQ（F / Ib）の基質。 Y軸represe毎分NTS蛍光任意単位（FAU）。
図3。ミトコンドリア溶解物、グリセロール勾配遠心分離から得られた選択画分のRNA編集活動。画分＃9（F9）が最も高い活性を有する。 y軸は、100％とF9を考慮した、相対的なパーセンテージで編集活動を表す。
図4。editosomeソースとして最も活性の高い画分（F8キー+ F9キー+ F10キー）を使用して、Z '因子の計算。実験変動は、反応の各タイプの72の複製物から得られた。 Z'-ファクターは0.6と計算された。 y軸は、相対的な編集活動を表す。
図5蛍光ベースのRNA編集アッセイのための代表的実験。反応は、ウェル当たり20μlの最終体積で実施し、CFX384 TouchTMリアルタイムPCR検出システムは、蛍光シグナルを測定するために使用した。グラフは、アッセイ（＃5）のためのすべてのコンポーネントが含まれ、完全な編集の反応に加えて、様々な制御を提供します。蛍光は、基板の完全性を評価するために単独でFRET基質（＃1）の存在下で測定した。試料＃2は編集前の任意のリボザイム活性をモニターするためにeditosomeの非存在下で行った。基板上の変性editosomeの効果を評価するために、蛍光がeditosomeのみFRET基質（＃3）の存在下で測定した。ガイド指向編集特異性、SAMをテストするにはPLE gA6Rbzが存在しない場合に（＃4）を使用した。 （C53、＃6）非阻害し、阻害化合物（MRB、＃7）が編集検定への影響をテストするために使用された。 RNA編集はMRBにより有意に抑制されている間、C53は無視できる効果があります。エラーバーは10回の反復間の実験変動（標準偏差）に対応しています。 y軸は、100％完全な反応（＃5）を考慮し、相対的なパーセンテージで編集活動を表す。
| 10パーセント | 30％ | |
| 2X HHE勾配バッファ | 5ミリリットル | 5ミリリットル |
| グリセロール | 1ミリリットル | 3ミリリットル |
| DEPC H 2 O | 4ミリリットル | 2ミリリットル |
| 1 M DTT | 10μL | 10μL |
表1 10％＆30％グリセロール溶液（10ミリリットルずつ）。
| 事前に編集されたA6リボザイム（preA6Rbz） | |
| preA6Rbz DNAテンプレート | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNAストック濃 | 1μM |
| ガイドA6リボザイム（gA6Rbz） | |
| gA6RBz DNAテンプレート | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNAストック濃 | 2.5μM |
| ガイドA6リボザイム他社（gA6RBz_comp） | |
| gA6Rbz_comp DNAテンプレート | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNAストック濃 | 12.5μM |
| アクティブA6リボザイム（A6RBz） | |
| A6Rbz DNAテンプレート | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNAストック濃 | 1μM |
| 基板をFRET | |
| TAMRAクエンチャー | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '（ユーロジェンテック） |
| アイオワ州ブラッククエンチャー | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA - アイオワ州ブラック-3 '（IDT） |
| RNAストック濃 | 15μMの（両方） |
表2。のDNAテンプレートとRNA基質。
| 合成 | 編集反応（μL） |
| 10倍HHE | 1.5 |
| 0.1Mの塩化カルシウム | 1 |
| 100のATP | 0.2 |
| 10％トリトンX-100 | 0.2 |
| 500 NG /トルラ酵母RNAμL | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNaseを含まないH 2 O | 7.1 |
| 1μMpreA6Rbz | 1 |
| 2.5μMgA6Rbz | 1 |
| 合計 | 18 |
表3。反応組成物およびマスターミックス。
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Discussion
トリパノソーマのRNA編集複合体に対する阻害剤を同定するための新規のハイスループットスクリーニング方法はtrypanosomatidsによって引き起こされる疾患に対抗する創薬のための新しいツールを提供し、提示された。 FRETベースのリボザイムアッセイは広範囲に異なる目的のために20〜22に使用されている;しかしながら、我々は、RNA編集アクティビティ19 のインビトロ監視のためのFRET-ベースのリボザイムアッセイの能力を利用している。このアッセイは、潜在的に、哺乳類23の核コードされるRNAのヌクレオチド置換編集などの真核生物のRNA編集の他のタイプに適合させることができる。
このアッセイの新規性は、それ自体FRETベースのリボザイムアッセイを確立していないが、editosomeに対する化学物質のハイスループットスクリーニングに適しているRNA編集アッセイにこの技術を組み込む方法を開発する。リボザイムアッセイに基づく方法は、他の画面とお尻に比べていくつかの利点がありますAYSは、現在、この目的のために利用。具体的には、技術はそれにより、ハイスループットスクリーニング19のために合うこと、放射性標識された1とは対照的に、蛍光基質に依存する高感度かつ再現性のある「ミックス·アンド·メジャー」アッセイを提供しています。代わりに、単純なエンドポイント信号の基質の添加後の蛍光シグナルをリアルタイムで監視することにより、より正確なアッセイ化合物19のIC 50値を決定することができる。また、個々の組換えタンパク質とは対照的に、全体editosome複合体に対する化合物の阻害効果の試験を可能にする。タンパク質複合体中の相互作用の動的性質を考えると、この方法は24を設定し 、より生物学的に代表的にeditosomeタンパク質に対する阻害剤の同定を可能にすることを示唆することができる。また、全体editosome複合体を標的化することは、潜在的RNA編集の進行を阻止する機会を提供以前に同定されていない様々な過渡段階で。このように、技術はRNA編集のプロセスに重要である相互作用や活動などのより良い理解を得ることができます。このアプローチは、複雑24,25の阻害剤として作用するこのようなバイオマイシンおよびエリスロマイシンなどの抗生物質を利用し原核リボソーム複合体のアセンブリおよび機能の解明によって例示されるように、過去に成功したことが見出されている。
メソッドが正常に完了したことを確実にするために、プロトコルの特定の調整が必要になることがあります。まず、適切なグリセロール勾配ミトコンドリア抽出画の選択が非常に重要です。ここで、7〜11の画分は、勾配の〜20S領域に対応する、画分9が最大活性を示すとともに、編集最高活性を示した。この画分が提示全ての試験のために選択したが、それは、FRAに評価するために、事前に全ての画分を試験するために不可欠である編集活動ピークをction。第二に、分数選択を検証するためには、Z'-ファクター値を計算することによって信号対雑音比を評価するために予備試験を行うことが重要である。適切なミトコンドリア抽出物、グリセロールグラジエント画が完了した場合、0.6のZ '値を達成することができる。次に、滴定19を介して、最大の編集活動を達成するために必要なミトコンドリア抽出物の再評価反応容積をお勧めします。
本稿の手法の重要な制限は、editosome複合体19を精製することにより、ミトコンドリアのエキスグリセロール勾配分画の手間と時間のかかるプロセスに関係する。これらの欠点にもかかわらず、この技術は、優先的に、これによりハイスループットスクリーニングへの適用のためにそれを修飾し、降伏電位対低コストeditosome所与の粗分画を得ることが提案されている。水道タグPUなどとは対照的に、他の方法より精製editosomeフラクションを与えることができますrificationは、このような二次アッセイの場合のようにメディアスループットアッセイに低いためにお勧めです。また、化合物の特異的な阻害効果を確実にするためには、editosomeの非存在下でリボザイム（A6Rbz）の活性に対してそれらをテストするためのコントロールを含むことが必要である。それは、これまでの研究は、この方法は、高い化合物濃度19で可能な干渉のために、色素のような化合物に対するIC50値を計算することで、効果がないことが強調していることに留意すべきである。
さらに提示HTS技術の感度を高めるためには、事前に切断された編集前のリボザイムを含む同様の蛍光ベースのアッセイを開発することは有益である。これはeditosome複合体におけるエンドヌクレアーゼによって触媒律速ヌクレオチド鎖切断のステップをバイパスできるようになる。本変形アッセイの別の利点は、二次スクリーニングツールとしての用途であろうExoUase、TUTase及び連結触媒活性に関する一次スクリーンを通して識別阻害剤の効果を監視します。現在提案されているアッセイは、RNA編集の欠失型に対する阻害剤の検出に限定される。このため、探索する別の道はRNA編集の挿入型に対する化合物の影響の監視を可能にするために提示アッセイの変更になります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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