Abstract
Betydande framsteg har gjorts för att bestämma mekanismen för mitokondriell RNA redigering i trypanosomer. På liknande sätt har betydande framsteg gjorts för att identifiera komponenterna i editosome komplexet som katalyserar RNA-redigering. Det är emellertid fortfarande oklart hur dessa proteiner fungerar tillsammans. Kemiska föreningar, erhållen från en hög genomströmning skärm mot editosome kan blockera eller påverka ett eller flera steg i redigeringscykeln. Därför kommer identifieringen av nya kemiska föreningar generera värdefulla molekylära sonder för att dissekera editosome funktion och montering. I tidigare studier har in vitro-redigering analyser utförs med hjälp av radioaktivt märkt RNA. Dessa analyser är tidsödande, ineffektiv och olämplig för high-throughput ändamål. Här, en homogen fluorescens-baserade "blanda och mät" reporter hammarhuvudribozym in vitro-analys för att övervaka RNA redigering, presenteras. Endast som en konsekvens av RNA-redigering avden hammarhuvudribozym en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) oligoribonukleotid substrat genomgår klyvning. Detta i sin tur resulterar i separation av fluoroforen från utsläckaren därigenom producera en signal. När däremot den editosome funktion hämmas, den fluorescenssignal kommer att släckas. Det här är en mycket känslig och enkel analys som ska vara tillämplig för övervakning in vitro-RNA-redigering eller hög throughput screening av kemikalier som kan hämma editosome funktionen.
Introduction
Processen för RNA-redigering, en post-transkription mRNA modifikation, upptäcktes först i trypanosomatids 1. Sedan dess har ett omfattande arbete genomförts för att studera mekanismen bakom RNA-redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en serie av enzymatiska reaktioner, den editosome, en kärna komplex av cirka 20 proteiner skapar mogna mitokondriella mRNA för flera komponenter i den energialstrande oxidativ fosforylering systemet. Ordningen på katalytiska händelser är endonukleolytisk klyvning, uridylat (U) tillägg eller strykningar, och ligation, som dikteras av styr RNA (gRNAs) 4.
Utöver kärn editosome komplexa proteiner, har en rad tillbehör faktorer också identifierats 5-7. Dessa proteiner är oftast ses grupperade i fristående komplex. Men ordningen på proteinaggregat i kärn editosome komplexa och interaktionsmönster kärn komplex med tillbehöretkomplexen är ännu inte fastställts. Inriktning RNA redigeringsprocessen i trypanosomatids kan ge kemiska dissectors att stöd i att studera montering och funktion editosome komplexet. Dessutom har funktionella studier på flera editosome proteiner visat essentialitet i olika livsstadier, vilket indikerar deras potential som läkemedelsmål 8-12. Därför kan de funna inhibitorer av editosome också fungera som blyföreningar mot trypanosomatids. Det här är rätt tid, eftersom läkemedel som för närvarande finns tillgängliga mot sjukdomar orsakade av trypanosomatid är giftiga, ineffektiva och dyra 13,14.
En effektiv och bekväm in vitro-analys är nödvändig för att undersöka den kemiska universum för specifika hämmare som blockerar RNA-redigering. Tre analyser har utvecklats och använts för att övervaka editosome aktiviteter: (a) fullständig runda i RNA redigering vitro 15, (b) i förväg klyvs i RNA redigering vitro 16,17, ennd (c) hammarhuvudribozym (HHR)-baserad analys 18. De första två analyser förlitar sig på direkt visualisering av den redigerade produkt (ATPas-6 mRNA) med hjälp av radioaktivitet. Den HHR-baserad analys använder en modifierad version av ATPas 6 mRNA som modelleras för att bete sig som en ribozym vid redigering. Den funktionella ribozym då specifikt klyver en radiomärkt RNA-substrat, som fungerar som en reporter. Nyligen Moshiri et al. Utvecklat en "blanda och mät" HHR-baserad i reporter vitro-analys för att övervaka RNA-redigering där den radiomärkta RNA-substrat är ersatt med en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-substratet 19. De huvudsakliga fördelarna med denna analys är följande: (a) det är ett snabbt och bekvämt blanda och mät typ av analys, som produktion av aktiv ribozym-och substratklyvning uppträda samtidigt i samma rör i låg volym (dvs 20 ul), (b ) den undviker användningen av radioaktivt märkta material, (c)-känslighet som är enfforded genom fluorescens instrumentering i en mikro-titer plattformat och (d) ett högt signal-brusförhållande. Med hjälp av denna analys, var effekten av kända RNA-redigering ligas hämmare mot renat editosome bekräftad 19. Detta experiment validerade analysen för snabb identifiering av RNA-redigering-hämmare, framför allt mot hela editosomes från T. brucei.
Figur 1 är en detaljerad steg-för-steg-schema av fluorescensbaserad i RNA redigering vitro analys. Detta protokoll kan antingen användas för övervakning av RNA-redigering in vitro eller enkelt anpassas för screening av substansbibliotek av olika skalor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet nedan beskriver en metod för genomförande av fluorescens-baserade RNA redigering analys. Analysen kan utföras i ett enda PCR-rör, 96-brunnars eller 384-brunnars plattor, beroende på tillämpningsområdet för försöket. Därefter fluorescenssignalen kan läsas på en lämplig realtids-PCR detektionssystem. Analysen här beskrivs i samband med 384-brunnsplattor.
1. Odling T. brucei Celler
- Förbered ett tillväxtmedium för T. brucei procyclic formulär celler. För 1 liter medium:
- Lös upp 25,4 g SDM-79 pulver i 800 ml MilliQ vatten.
- Tillsätt 2 g NaHCO 3 och pH-värdet till 7,3 med 10 M NaOH.
- Lägg nanorent vatten till en slutlig volym på 900 ml, filtrera sterilisera.
- Lägg fetalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin-lösning och hemin (2,5 mg / ml) till slutkoncentrationer av 10% (volym / volym), 100 U / ml och 7,5 mg / l respektive.
- Odla 300 ml T. <em> brucei 1.7A vildtyp (procyclic form)-celler vid 28 ° C under skakning med 70 rpm till en densitet av 1,5 x 10 7 celler / ml. OBS: Detta bör ge 3 ml aktiv editosome med ~ 0,5 mg totalprotein, tillräckligt för 600 redigeringsreaktioner.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 6000 x g under 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta pelleten med 50 ml kyld PBSG buffert (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl och 6 mM glukos) och spinn ner cellerna igen genom centrifugering vid 10000 x g under 10 min vid 4 ° C.
2. Isolering av rå Mitokondrier
NOTERA: Alla steg bör utföras på is eller vid 4 ° C för att bevara editosome aktivitet.
- Resuspendera de skördade cellerna i 30 ml av DTE-buffert (1 mM Tris-HCl pH 8,0 och 1 mM EDTA). Använd en 40 ml steril Dounce-homogenisator (pre-kyld) för att störa cellmembranet genom strök upp och ner åtminstone 10 gånger på is. Tillsätt omedelbart 4,3 ml av 60% sackaros (vikt / volym, det vill säga 1,75 M) till homogenatet till en slutlig koncentration av 0,25 M. Centrifugera vid 15.800 xg under 10 minuter vid 4 ° C, för att företrädesvis sänka mitokondrier.
- Resuspendera den mitokondriella pelleten i 4,6 ml STM-buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sackaros och 2 mM MgCl2). Lägg 13,8 | il av 0,1 M CaCl 2 och 4 | il RNas-fritt DNas I till slutkoncentrationer av 0,3 mM och 9 U / ml, respektive. Inkubera blandningen i 1 h på is.
- Lägg till 4,6 ml STE-buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sackaros och 2 mM EDTA) för att inaktivera DNas I. Centrifugera vid 15.800 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 400 | il lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 ug / ml pepstatin, 1 mM DTT, och 1 x fullständig EDTA-fri proteashämmare) och överföring till ett mikrofugrör.
- Lägg 10% Triton X-100 till en slutkoncentration av 1% pernd inkubera lysatet under 15 min vid 4 ° C på en tub rotator.
- Avmarkera mitokondriella lysatet genom centrifugering två gånger vid 17.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C; behålla rensas supernatanten varje gång.
3. Editosome Rening
- Häll 10 ml 10% -30% (volym / volym) linjär glycerolgradient (tabell 1) i ett ultracentrifugrör använda 2x HHE gradient buffert (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, och 2 mM EDTA) och en gradient tillverkare genom att följa bruksanvisningen.
- Avlägsna försiktigt 500 pl av lösning från den övre delen av glycerolgradient och försiktigt ladda 500 ul av den rensade mitokondriell lysatet. Centrifugering vid 178.000 xg under 6 h vid 4 ° C med användning av en ultracentrifug.
- Samla 500 pl fraktioner i följd från toppen till botten av gradienten vid 4 ° C. Då snäpp frysa fraktioner med användning av flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- Glödga respektive DNA-mall innehållande sekvens komplementär till T7-promotorsekvensen (tabell 2) med en T7-promotor-oligonukleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') i ett molförhållande av 1:1 genom upphettning vid 90 ° C under 3 min och kylning vid RT under åtminstone 10 min.
- Transkribera RNA med hjälp av en in vitro transkription kit genom att följa bruksanvisningen.
- Stoppa transkriptionsreaktionen genom att lägga lika stor volym 7 M urea färgämne (7 M urea, 0,05% Xylen Cynol, och 0,05% bromfenolblått). Kör på en filtersteriliserad 9% denaturerande polyakrylamidgel (9% akrylamid, 7 M urea, 1x TBE).
- Använd det ultravioletta (UV) skuggning med en kortvågig UV-lampa för att lokalisera och punktskatter respektive RNA. Placera exciderade gelpartiet i ett mikrofugrör och tillsätt 400 | il av gel elueringsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA och 0,25% SDS). Eluera över natten vid RT på en tub rotator.
- Precipitate den eluerade RNA genom att tillsätta 1 ml kall 100% etanol och inkubering antingen vid -80 ° C under 30 min eller -20 ° C över natten.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C för att pelletera ned RNA.
- Tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol. Centrifugera vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera RNA pelleten på lämpligt sätt i RNas-fritt vatten för att uppnå de önskade koncentrationerna, såsom visas i tabell 2.
5. Fluorescens-baserad RNA redigering analys
- För en enda reaktion, kombinera 1 pmol (1 | il) av preA6Rbz och 2,5 pmol (1 ^ il) av gA6Rbz (1:2,5 molförhållande) i ett mikrofugrör, inkubera vid 70 ° C under 3 min och låt stå vid RT under minst 10 min.
- Samtidigt förbereda en huvudblandning med hjälp av tabell 3, utan preA6Rbz och gA6Rbz för redigering reaktion innehållande 1x HHE buffert (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl och 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl2, 16 ng / ul av Torula jäst-RNA, 0,1% Triton X-100, och den renade editosome.
- Lägg glödgat preA6Rbz och gA6Rbz att slutföra Master Mix.
- Dispensera 18 | il av huvudblandning (tabell 3) i brunnar innehållande antingen 2 | il RNas-fritt vatten (brunnar utan föreningar) eller 2 ^ il av 200 pM kemiska föreningar och innefattar kontrollprover i plattan enligt figur 5.
- Förslut plattan med en plattförslutning och snurra plattan ner, för att avlägsna eventuella luftbubblor. Inkubera vid 28 ° C under 4 timmar.
- Lägg 25 pmol (2 | il) av gA6Rbz konkurrent till varje brunn. Placera en färsk sealer, snurra plattan ner och placera den på en realtids-PCR-maskin. Programmera följande experiment:
Steg 1: 85 ° C under 5 min; Steg 2: 24 ° C under 10 min; Steg 3: Stoppa. - Lägg 15 pmol (1 pl) av FRET-substrat till varje brunn till en slutlig volym av 23 | il. Täta plattan med en fräsch sealer.Snabbt snurra plattan och placera den tillbaka på realtids-PCR-maskin.
- Programmera ett nytt experiment med följande steg:
Steg 1: 37 ° C under 1 min; Steg 2: Läs; Steg 3: Gå till steg 1, 40 gånger; Steg 4: Stopp. - Setup plattan genom att välja alla de brunnar som kräver läsning och välj FAM filtret. Ingångsvolym som 23 pl och starta körningen.
- Beräkna lutningen av de värden som erhålls från varje brunn / prov för att erhålla en kinetisk mätning genom plottning av backarna på ett stapeldiagram för analys. ANMÄRKNING: En kinetisk avläsnings förbättrar signal-till-brus-förhållande mellan provet och bakgrunden; som bakgrund provet skulle ha en lutning nära noll. En slutpunkt läsning har högre bakgrundsljud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa att de nödvändiga åtgärder som krävs för att sätta upp ett storskaligt skärm, figurerna 2-5 är representativa kontrollexperiment relaterade till kvaliteten på analysen. Dessa är viktiga kontrollförsök för en konsekvent analys över flera dagar av screening eller för jämförelse av olika skärmar.
Bedöma Fluorescens Signal-brusförhållande
För att säkerställa stabiliteten och kvaliteten på fluoresceinmärkta oligoribonukleotid substrat i en storskalig installation, var Z'-faktor, dvs skillnaden mellan analys bakgrunden och den maximala signalen beräknas med hjälp av aktiva ribozymmolekyl (A6Rbz). . Analyser med Z'-faktor> 0,5 anses vara godtagbart för hög genomströmning skärm Figur 2 visar representativa uppgifter med hjälp av FRET substrat märkt med 5 'fluorescein (FAM, emitter) och 3' N, N '-tetramethylrhodamine (TAMRA, släckare) (A6Rbz_F / T). Detta substrat producerade en Z'-faktor på 0,64 då beräknas med 72 replikat i närvaro och frånvaro av A6Rbz.
I denna analys ett alternativt substrat med användning Iowa svart mörk quencher (A6Rbz_F/Ib) kan ge ett bättre signal-till-brus-förhållande jämfört med TAMRA. Detta beror Iowa Svart, till skillnad TAMRA, avger absorberad energi som värme och inte ljus. Den Z'-faktor som erhålls genom att använda FAM / Iowa Black (F / Ib)-märkt substrat var 0,68. Förbättringen i Z'-faktorn för F / Ib-märkt substrat över TAMRA-märkt substrat är på grund av dess relativt lägre bakgrund. Dessa representativa resultat visar att båda substraten är genomförbara alternativ för användning i en hög genomströmning skärm.
Fastställande redigerings verksamhet glycerolgradient Bråk
För att bestämma och välja de mest aktiva editosome fraktioner för experiment, de glycerol gradientfraktioner testades för in vitro-redigering med hjälp av fluorescens-baserad analys (steg V). Dessa data visar (Figur 3) fraktionerna 7-12 som de mest aktiva fraktionerna (≥ 50% redigering verksamhet, med den mest aktiva fraktionen som 100%). Dessa fraktioner kan kombineras när det krävs mer editosome.
Beräkning av Z'-faktor när Editosome fraktioner kombinerades
För att bestämma effekten av combinig den editosome fraktion ades Z'-faktorvärde av 0,6 beräknas när de mest aktiva fraktionerna (F8 + F9 + F10) användes som källa för editosome. För att beräkna den Z'-faktor 72 replikat testades i närvaro och frånvaro av den editosome (Figur 4). F / Ib substrat användes i detta experiment. Dessa data visar att baserat på Z'-faktor, som kombinerar glycerol gradientfraktionerna har minimal effekt på kvaliteten på analysen.
ass = "jove_content"> Representant kontrollexperiment för analys
Representativa data som jämför olika kontrollprover användes för att analysera variabler i analysen. Såsom visas i fig 5, behöver reaktionerna missa någon RNA-redigering komponenter (reaktionerna 1-4) inte klyva substratet. Klyvning av substratet mätt med fluorescens och relativa redigering aktivitet endast observeras i närvaro av alla komponenter i redigeringsreaktioner i frånvaro av en hämmare (reaktion 5) eller i närvaro av alla redigerings komponenter och en inaktiv förening (reaktion 6). I motsats härtill kan en hämmande förening blockera RNA-redigering och används som en positiv kontroll (reaktion 7). Här gjordes Mordant svart (MrB) och C53 föreningar användes som positiva och negativa kontroller, respektive.
ghres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Hammarhuvudribozym-baserad i RNA redigering vitro. A) Steg-för-steg schematisk representation av fluorescensbaserad i redigering vitro analys: (a) hybridisering av pre-edited hammarhuvudribozym (pre-edited A6Rbz) med dess styr RNA (gA6Rbz). (B) Redovisning och växelverkan av RNA-duplex genom att den renade editosome komplex. (C) Borttagande RNA-redigering katalyseras av editosome. (D) dissociering av redigerad A6Rbz från editosome och gA6Rbz genom upphettning vid 85 ° C och tillsats av guide RNA konkurrent (gA6Rbz_comp). (E) Hybridisering av FRET-substratet med det aktiva A6 hammarhuvudribozym (aktiv A6Rbz). (F) Detektering av FAM-signaler efter klyvning av FRET-substratet med det aktiva ribozymet. B) pre-edited hammarhuvudribozym (pre-edited A6Rbz) visas i association med gA6Rbz som anger deletion av tre Us (dubbelpil arrow) från redigerings webbplats (ES). Som ett resultat av RNA-redigering i närvaro av funktionella editosome inaktivt ribozym redigeras till dess aktiva form (edited A6Rbz) som nu kan klyva FRET-substrat (klyvningsstället markeras med en pil). Den konserverade 5'-CUGA-3 'av den redigerade A6Rbz i den katalytiska kärnan väsentliga för ribozym aktivitet (redigerade plats) är markerat (Denna siffra har modifierats Moshiri 19). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Signal-till-brus jämförelse förhållandet mellan FRET substrat hyser olika släckare. Ribozyme (A6Rbz) aktivitet med hjälp av FAM / TAMRA (F / T) och FAM / Iowa Svart FQ (F / Ib) substrat. Y-axeln represents fluorescens godtycklig enhet (FAU) per minut.
Figur 3. RNA redigering aktivitet av utvalda fraktioner som erhålls från glycerol centrifugering av den mitokondriella lysatet. Fraktion # 9 (F9) har den högsta aktiviteten. Y-axeln representerar relativ redigering aktivitet i procent, med tanke på F9 som 100%.
Figur 4. Z'-faktor beräkning med de mest aktiva fraktionerna (F8 + F9 + F10) som editosome källa. Experimentell variation erhölls från 72 replikat av varje typ av reaktion. Z'-faktor beräknades som 0,6. Y-axeln representerar relativ redigering aktivitet.
Figur 5. Representativt experiment för fluorescens-baserad RNA-redigering assay. Reaktionerna utfördes i en slutlig volym av 20 | il per brunn och CFX384 TouchTM realtids-PCR detektionssystem användes för mätning av den fluorescenssignal. Diagrammet visar olika kontroller förutom en fullständig redigering reaktion som innehåller alla komponenter för analysen (nr 5). Fluorescensen mättes i närvaro av FRET-substratet ensamt (# 1) för att bedöma integriteten hos substratet. Prov # 2 utfördes i frånvaro av den editosome att övervaka någon ribozym aktivitet före redigering. För att bedöma effekten av denaturerat editosome på substratet var fluorescensen mättes i närvaro av editosome och FRET-substrat endast (# 3). För att testa guiden styrd redigering specificitet, en sampel i frånvaro av gA6Rbz användes (# 4). En icke-inhiberande (C53, # 6) och en hämmande förening (MrB, # 7) användes för att testa effekten på redigerings assay. Medan RNA redigering hämmas kraftigt av MrB, har C53 försumbar effekt. Felstaplarna motsvarar en experimentell variation (standardavvikelse) mellan 10 replikat. Y-axeln representerar relativ redigering aktivitet i procent, med tanke på fullständig reaktion (# 5) i form av 100%.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE gradientbuffert | 5 ml | 5 ml |
| Glycerol | 1 ml | 3 ml |
| DEPC H2O | 4 ml | 2 ml |
| 1 M DTT | 10 | il | 10 | il |
Tabell 1. 10% och 30% Glycerol lösning (10 ml vardera).
| Pre-edited A6 Ribozyme (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz DNA-mall | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3 ' |
| RNA lager konc. | 1 | iM |
| Guide A6 Ribozyme (gA6Rbz) | |
| gA6RBz DNA-mall | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 ' |
| RNA lager konc. | 2,5 pM |
| Guide A6 Ribozyme Konkurrent (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp DNA-mall | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 ' |
| RNA lager konc. | 12,5 ^ iM |
| Aktiv A6 Ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz DNA-mall | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 ' |
| RNA lager konc. | 1 | iM |
| FRET-substrat | |
| TAMRA quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3 '(Eurogentec) |
| Iowa Black quencher | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-Iowa Black-3 '(IDT) |
| RNA lager konc. | 15 | iM (för båda) |
Tabell 2. DNA-mallar och RNA-substrat.
| Komposition | Redigering reaktion (il) |
| 10x HHE | 1,5 |
| 0,1 M CaCl 2 | 1 |
| 100 mM ATP | 0,2 |
| 10% TritonX-100 | 0,2 |
| 500 ng / mikroliter Torula jäst-RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNas-fritt H2O | 7,1 |
| 1 pM preA6Rbz | 1 |
| 2,5 pM gA6Rbz | 1 |
| Totalt | 18 |
Tabell 3. Reaktion Sammansättning och Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny high-throughput screening metod för att identifiera inhibitorer mot RNA redigering komplex av trypanosomer presenterades, vilket ger ett nytt verktyg för läkemedelsutveckling för att motverka sjukdomar orsakade av trypanosomatids. FRET-baserade ribozym analys har använts i stor utsträckning för olika ändamål från 20 till 22; dock har vi använt kapacitet FRET-baserade ribozym analys för in vitro övervakning av RNA-redigering aktivitet 19. Denna analys skulle kunna anpassas till andra typer av RNA-redigering i eukaryoter, såsom nukleotidsubstitution redigering av nucleus-kodat RNA av däggdjur 23.
Nyheten med denna analys är inte etablera FRET-baserade ribozym analyser per se, utan i att utveckla en metod som innefattar denna teknik i en RNA-redigering assay som är mottaglig för high-throughput screening av kemikalier mot editosome. Ribozymet assay baserad metod har flera fördelar jämfört med andra skärmar och assays för närvarande utnyttjas för detta ändamål. Specifikt erbjuder den teknik som en känslig och reproducerbar "mix-and-åtgärd"-analys att förlita sig på ett fluorescerande substrat i motsats till en radiomärkt en, vilket gör den lämplig för high-throughput screening 19. Realtidsövervakning av en fluorescenssignal efter tillsättning av substratet i stället för en enkel ändpunktssignalen gör det möjligt att mer exakt bestämma IC50-värdena för analyserade föreningar 19. Vidare tillåter det testning av de inhiberande effekterna av föreningarna på hel-editosome komplexet i motsats till enskilda rekombinanta proteiner. Med tanke på den dynamiska karaktären i samspelet inom proteinkomplex, kan det föreslås att denna metod gör det möjligt att identifiera hämmare mot editosome proteiner på ett mer biologiskt representativ inställning 24. Dessutom riktar hela-editosome komplex ger en möjlighet att eventuellt stoppa utvecklingen av RNA-redigeringvid olika transienta steg som inte tidigare har identifierats. Således kommer tekniken tillåter få ett bättre perspektiv på interaktioner och aktiviteter som är avgörande för processen för RNA-redigering. Denna strategi har visat sig vara framgångsrika i det förflutna som exemplifieras av att klarlägga prokaryota ribosomkomplexet montering och funktion som är antibiotika, såsom viomycin och erytromycin, i egenskap av hämmare av komplexa 24,25.
För att säkerställa ett framgångsrikt slutförande av metoden, kan vissa justeringar av protokoll vara nödvändigt. För det första är valet av rätt glycerolgradient mitokondrie extrakt fraktion avgörande. Här, fraktioner 7 till 11, motsvarande den ~ 20S regionen av lutning, visade den högsta redigeringsverksamhet, med fraktion 9 uppvisar maximal aktivitet. Även denna fraktion valdes för alla tester som presenteras, är det viktigt att testa alla fraktioner i förväg för att kunna bedöma i vilken fraInsatser nämnda redigeringsaktivitetstoppar. För det andra, för att validera fraktion val, är det viktigt att utföra preliminära prov för att utvärdera signal-till-brusförhållandet genom att beräkna Z'-faktorvärde. Om korrekt mitokondriell extrakt glycerolgradient fraktionering har slutförts, kan uppnås en Z'-värde på 0,6. Därefter rekommenderas att omvärdera reaktionsvolymen av mitokondriell extrakt krävs för att uppnå maximal redigering aktivitet via titrering 19.
En viktig begränsning av tekniken som presenteras i detta dokument avser arbets-och tidskrävande process av mitokondriell extrakt glycerolgradient fraktionering genom vilken editosome komplexet renas 19. Trots dessa nackdelar, är denna teknik företrädesvis föreslagit att erhålla råa editosome fraktioner tanke på dess låga kostnader kontra avkastningspotential och därmed kvalificera det för tillämpning på high-throughput screening. Däremot andra metoder såsom TAP-taggen purification, vilket kan ge mer renade editosome fraktioner, är lämpligt för låga till medel genomströmning analyser såsom i fallet med sekundära analyser. Dessutom, för att säkerställa specifika inhiberande effekten av föreningar, är det nödvändigt att inkludera kontroller för att testa dem mot aktiviteten av ribozymet (A6Rbz) i frånvaro av editosome. Det bör noteras att tidigare studier har visat att denna metod kan vara ineffektivt vid beräkning av IC50-värden för färgämnesliknande föreningar förorsakade av eventuella störningar vid höga koncentrationer av förening 19.
För att ytterligare öka känsligheten av tekniken HTS presenterade, att utveckla en liknande fluorescensbaserad analys involverar pre-klyvda pre-edited ribozym är fördelaktigt. Detta skulle göra det möjligt att kringgå det hastighetsbegränsande endonukleolytisk klyvning steg katalyseras av endonukleaser i editosome komplex. En annan fördel med denna modifierade analys skulle vara programmet som en sekundär screening verktygför att övervaka effekten av inhibitorerna identifierade genom den primära skärmen på ExoUase, TUTase och ligering katalytiska aktiviteter. Den nu föreslagna analysen är begränsad till upptäckten av inhibitorer mot strykningen typ av RNA-redigering. Därför skulle en annan möjlighet att pröva att en ändring av den presenterade analysen för att möjliggöra övervakning av sammansatta effekter på insättnings typ av RNA-redigering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
