Abstract
实质性的进展已经取得了确定的线粒体RNA编辑在锥虫的机制。同样，相当大的进展已经取得了识别editosome络合物的催化RNA编辑的组件。但是，目前还不清楚这些蛋白质是如何协同工作。从对editosome高通量筛选获得的化学化合物可以阻止或影响在编辑周期的一个或多个步骤。因此，新化合物的鉴定将产生有价值的分子探针解剖editosome功能和组装。在以前的研究中， 在体外测定法的编辑进行了使用放射性标记的RNA。这些测定法是耗时，低效和不适合于高通量的目的。在这里，均匀的荧光为基础的“混合和计量”锤头状核酶体外记者分析监测RNA编辑，呈现。仅作为RNA编辑的结果锤头状核酶荧光共振能量转移（FRET）寡基板发生裂解。这反过来导致荧光团与猝灭剂，从而产生一个信号分离。与此相反，当editosome功能受到抑制，荧光信号会被淬灭。这是一个高度敏感和简单的分析，应该是普遍适用于体外 RNA编辑或化学物质，可以抑制editosome功能的高通量筛选监控。
Introduction
RNA编辑，转录后修饰的mRNA的过程中，首先被锥虫1发现。从那时起，大量的工作已经在后面学习中的RNA编辑布氏锥虫 2,3机制进行的。在一系列的酶反应中，editosome，约20蛋白核心复合物，产生成熟的mRNA线粒体的能量产生的氧化磷酸化系统的多个组件。催化事件的顺序是信使核糖核酸，尿苷酸（U）增加或删除，并结扎，所决定的指导的RNA（gRNAs）4。
除了 核心editosome复杂的蛋白质，一些辅助因子也已确定5-7。这些蛋白质大多见于分组独立的复合物。然而，蛋白质装配在芯editosome复杂的顺序和核心复合物与该配件的交互模式配合物尚未确定。针对RNA编辑的过程中锥虫可提供化学解剖，援助在研究editosome复杂的装配和功能。此外，在几个editosome蛋白质功能的研究表明在不同人生阶段的必要性，指出其潜在的药物靶点8-12。因此，editosome的发现抑制剂也可作为对锥虫的先导化合物。这是及时的，因为目前市面上所引致的锥虫病的药物是有毒的，低效和昂贵13,14。
一个高效，便捷的体外试验要探索的化学宇宙，阻止RNA编辑特异性抑制剂。三个实验已经开发并用于监视editosome活动：（a）全轮体外 RNA编辑分析15（二）预切割体外 RNA编辑实验16,17，一ND（三）锤头状核酶（HHR）为基础的检测18。前两个实验依靠编辑的产品（ATP酶6基因）与放射性的帮助下直接观察。该HHR基测定法使用了被建模的行为作为经编辑的核酶的ATP酶6 mRNA的修改版本。功能核酶则特异性切割放射性标记的RNA底物，作为一名记者。最近，MOSHIRI 等人开发了一种“混合，并测量”HHR-基于体外报告基因分析来监测RNA编辑其中的放射性标记的RNA底物被替换为荧光共振能量转移（FRET）底物19。该测定法的原理的优点是：（a）它是一种快速和方便的混合和测定法的测量类型，为生产活性核酶和底物裂解的同时出现在同一试管中低体积（ 即 20微升），（二）它避免了使用放射性标记的物质，（C）的灵敏度是一个通过荧光仪在微滴定板格式，以及（d）一个高信噪比fforded。使用这种测定法，对纯化的editosome已知的RNA编辑连接酶抑制剂的作用被证实19。这个实验验证了分析的快速鉴定RNA编辑酶抑制剂，主要针对来自T.整个editosomes 布氏 。
图1是一个详细的一步一步的示意性的基于荧光的体外 RNA编辑测定。这个协议可以被用于监测在体外 RNA编辑或很容易地适应用于筛选各种比例的化合物库。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
下面的协议描述了用于执行基于荧光的RNA编辑分析的过程。该测定法可以在一个单一的PCR管，96孔或384孔取决于实验的范围板来进行。随后的荧光信号可以读合适的实时PCR检测系统。这里在测定中的384 - 孔板的上下文中被描述。
1，培养T。布氏细胞
- 准备一个生长培养基为T。布氏 procyclic形式的细胞。 1 L培养基：
- 溶解25.4克SDM-79粉末在800毫升miliQ水。
- 添加2克的NaHCO 3和pH值至7.3，10 M氢氧化钠。
- 加超纯水至900毫升，过滤消毒的最终体积。
- 添加胎牛血清（FBS），青霉素 - 链霉素溶液和氯高铁血红素（2.5毫克/毫升）至终浓度为10％（体积/体积），分别为100单位/毫升和7.5毫克/升。
- 成长300毫升T. <中EM>布氏1.7A野生型（procyclic形式）细胞在28℃，在70转摇到1.5×10 7细胞/ ml的密度。注：这应该会产生3毫升活跃editosome与〜0.5毫克总蛋白，足够600编辑反应。
- 离心6000×g离心10分钟收集细胞，在4℃下
- 用50ml冷PBSG缓冲液（10mM的磷酸氢二钠，10mM的的NaH 2 PO 4，145 mM氯化钠，以及6毫米的葡萄糖）洗涤沉淀，并再次离心收集到的细胞通过离心分离以10,000 xg在10分钟4°C。
原油线粒体2。隔离
注意：所有的步骤应在冰上或4℃进行保存editosome活性。
- 重悬在30毫升的DTE缓冲液（1mM的Tris-HCl pH为8.0和1mM EDTA）中收获的细胞。用40毫升无菌Dounce匀浆（预冷）由抚摸着向上和向下的至少10倍于冰上，破坏细胞膜。 立即4.3毫升60％蔗糖（w / v的即 1.75 M）添加到匀浆至0.25米离心机的终浓度在15800×g下在4℃下10分钟，以优先减低线粒体。
- 重悬线粒体沉淀4.6毫升STM缓冲液（20mM的Tris-HCl pH值8.0，250mM的蔗糖和2mM的MgCl 2）。添加13.8微升的0.1M的CaCl 2和4微升不含RNA酶的DNA酶I至终浓度分别为0.3毫米和9 U /毫升。为1小时，在冰上孵育混合物。
- 添加4.6的STE缓冲液（20mM的Tris-盐酸pH值8.0，250mM的蔗糖和2mM EDTA）中在4℃以灭活DNA酶I。离心机在15800×g离心10分钟
- 重悬沉淀中加入400μl的裂解缓冲液（10mM的Tris-HCl（pH7.2）中的10mM的MgCl 2，100mM的氯化钾，1微克/毫升胃蛋白酶抑制素，1mM的DTT和1×完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂），并转移到离心管。
- 加10％的Triton X-100至1％的终浓度第二温育裂解物15分钟，在4℃下在管式旋转器。
- 离心两次在17000×g离心15分钟，在4℃下清除线粒体裂解液;每次保留清除上清液。
3。Editosome净化
- 倒入10ml的10％-30％（V / V）线性梯度甘油（ 表1）中使用2个HHE梯度缓冲液（40mM的HEPES pH值为7.9，20mM的镁（醋酸）2，100mM的氯化钾超速离心管中，并2 mM EDTA）中，并通过下面的说明书的梯度壶。
- 小心地从甘油梯度的顶部取出500微升的溶液，轻轻地加载500微升的清除线粒体裂解液。旋在178,000 xg离心6小时，在4℃下用超离心。
- 收集500μl的级分连续地从顶部到梯度的在4℃下然后将其卡冻结使用液氮和储存在-80℃直至使用的馏分。
- 退火含有互补序列的T7启动子序列（ 表2）与T7启动子的寡核苷酸（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）中，加热至90℃保持3分钟以1:1的摩尔比和冷却在RT相应DNA模板为至少10分钟。
- 使用体外转录试剂盒由以下的说明书转录的RNA。
- 停止转录反应通过加入7M尿素染料（7M尿素，0.05％二甲苯Cynol，和0.05％溴酚蓝）等体积。在消毒9％变性聚丙烯酰胺凝胶（9％丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE）过滤器运行。
- 使用紫外线（UV）遮蔽用短波紫外线灯进行定位和切除相应的RNA。将切下的凝胶块在一个离心管中，并加入400微升的凝胶洗脱缓冲液（20mM的Tris-HCl pH值7.5，250mM的醋酸钠，1mM EDTA和0.25％SDS）中。洗脱过夜在RT上一个管肩。
- PRECI通过加入1ml冰冷的100％乙醇并进行培养或在-80℃下30分钟或-20℃过夜pitate洗脱RNA。
- 离心机以16,000×g离心30分钟，在4℃，以沉淀下来的核糖核酸。
- 用1毫升75％乙醇洗涤沉淀。离心机以16,000×g离心20分钟，在4℃下
- 适当地重悬RNA沉淀在无RNA酶的水以达到所需的浓度，如表2所示。
5，基于荧光的RNA编辑含量
- 为一个单一的反应，结合1皮摩尔（1微升）preA6Rbz和2.5皮摩尔（1微升）gA6Rbz的（1:2.5摩尔比）在微量离心管中，孵育在70℃维持3分钟，并让其在室温下静置在至少10分钟。
- 同时使用表3中制备主混合物，而不preA6Rbz和gA6Rbz，对于含有1x HHE缓冲液（25mM HEPES pH值为7.9，10mM的镁（醋酸）2，50mM的氯化钾和10mM EDTA），1 mM的编辑反应ATP，5mM的氯化钙2，圆酵母RNA，0.1％的Triton X-100和纯化的editosome 16纳克/微升。
- 添加退火preA6Rbz和gA6Rbz完成主结构。
- 免除18微升主混合物（ 表3）的成包含2微升不含RNA酶的水（井用无化合物）或2微升200μM的化学化合物的井，并按照图5包括对照样品中的板。
- 密封板与板密封件和旋转盘下来，以消除任何气泡。孵化在28℃保温4小时。
- 添加25皮摩尔gA6Rbz竞争者（2微升）到每个孔中。放置一个新密封剂，向下旋转的板，并把它实时PCR仪上。程序如下实验：
第1步：85℃5分钟;第2步：24℃，10分钟;步骤3：停止。 - 加FRET底物的15皮摩尔（1微升）到每个孔中，以23微升的最终体积。用新鲜的封口机封板。快速旋转盘，并把它背在实时PCR仪上。
- 设定新的实验步骤如下：
第1步：37℃1分钟;第2步：阅读;第3步：进入步骤1，40倍;步骤4：停止。 - 安装板通过选择所有需要阅读和选择FAM过滤器的井。输入量为23微升并开始运行。
- 计算从每个孔/样品获得通过绘制的斜坡上的条形图进行分析，以获得动力学测量值的斜率。注：动能读提高了样品和背景之间的信号噪声比;作为背景样品将有一个斜率接近于零。结束点读具有较高的背景噪音。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以证明需要设立一个大型屏幕必要的步骤， 图2-5是与测定的质量代表对照实验。这些都是必不可少的对照实验为一致的测定过筛选的几天或不同的屏幕之间的对比。
评估荧光信号噪声比
以确保在一个大型安装的荧光素标记的寡核糖核苷酸底物的稳定性和质量，Z'因子，其定义为在测定背景和最大信号之间的差用的是活性核酶分子（A6Rbz）计算。 。测定与Z'因子> 0.5，被认为是可以接受的高通量筛选图2示出了使用标记5的FRET底物的代表性数据'荧光素（FAM;发射器）和3'N，N' -四甲thylrhodamine（TAMRA;淬灭剂）（A6Rbz_F / T）。该衬底产生的0.64 Z'-因子使用72次重复中A6Rbz的存在和不存在时计算。
在该试验中使用爱荷华黑色暗淬灭剂（A6Rbz_F/Ib）替代基板可以产生更好的信号噪声比相比，TAMRA。这是因为爱荷华州黑，不像TAMRA，发射吸收的能量作为热量而不是光。使用FAM /艾奥瓦州黑（F /磅）标记的底物获得的Z'因子为0.68。中的Z'因子超过TAMRA-标记的底物的F / Ib的标记的底物的改善是由于其相对较低的背景。这些有代表性的结果表明，这两种底物是可行的选择用于在高通量筛选中使用。
确定甘油梯度组分的编辑活动
要确定并选择最活跃的editosome分数的实验中，甘油升梯度级分进行了测试使用基于荧光的测定（步骤V） 的体外编辑。这些数据表明（ 图3）的级分7-12中最活跃的馏分（≥50％的编辑活动;最活跃的分数为100％）。这些组分可以在更editosome需要进行组合。
计算Z'-因子时Editosome馏分合并
以确定combinig的editosome馏分的作用，在0.6的Z'因子值进行了计算时，最活跃的部分（F8 + F9 + F10）作为editosome的来源。计算Z'-因子72次重复在editosome的存在和不存在（ 图4）进行测试。在F / Ib的衬底被用于本实验。这些数据表明，基于所述Z'因子，结合甘油梯度组分对测定的质量的影响最小。
屁股=“jove_content”> 代表控制实验的测定
比较不同的对照样品有代表性的数据被用来分析在测定中的变量。 如图5，反应缺少任何RNA编辑组件（反应1-4）不切割底物。衬底作为由荧光和相对的编辑活动测定裂解仅在编辑反应的所有组分在不存在抑制剂（反应5）或在所有的编辑组件的存在和非活性的化合物（反应的存在下观察到的6）。相反，抑制性化合物可以阻断RNA编辑，并且用作阳性对照（反应7）。这里，媒染剂黑（MRB）和C53化合物被用作阳性和阴性对照。
ghres.jpg“宽度=”500“/>
图1。锤头状核酶为基础的体外 RNA编辑分析。的）步骤一步示意图基于荧光的体外实验编辑：预编辑的锤头状核酶（预编A6Rbz）与其导的RNA（gA6Rbz）（一）杂交。 （b）确认和纯化editosome复杂的RNA双链的互动。 （三）删除RNA编辑的editosome催化。 （四）从editosome和gA6Rbz加热至85℃，并加入导的RNA竞争剂（gA6Rbz_comp）所编辑的A6Rbz的解离。 （e）与主动A6锤头状核酶（活动A6Rbz）的FRET底的杂交。 （六）检测由活动核酶B）预编辑的锤头状核酶（预编A6Rbz）以下的FRET底物的裂解FAM信号显示在协会与gA6Rbz，指定删除我们三个（双头ARROW）从编辑网站（ES）。如RNA编辑功能editosome的存在而产生的非活性核酶被编辑成其活性形式（编辑A6Rbz）现在，可以裂解FRET底物（由箭头指示的切割位点）。保守的5'-CUGA-3'编辑A6Rbz的催化核心的核酶活性（编辑网站）必不可少的高亮显示（这个数字已经被修改MOSHIRI 19）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2，信号与噪声的FRET底物窝藏不同猝灭剂之间的比例比较 。使用FAM / TAMRA（F / T）和FAM /艾奥瓦州黑FQ（F /磅）衬底核酶（A6Rbz）的活性。 y轴represe每分钟NTS荧光任意单位（FAU）。
从线粒体裂解物中的甘油梯度离心。馏分＃9（F9）中得到的级分选的图3。RNA编辑活动具有最高的活性。 y轴表示单位为百分数相对编辑活动，考虑到F9为100％。
图4：采用目前最活跃的部分（F8 + F9 + F10）作为editosome源Z'因子的计算。实验的变化是从72个重复每个类型的反应获得。 Z'因子被计算为0.6。 Y轴表示相对的编辑活动。
图5代表性实验的基于荧光的RNA编辑测定。反应中，每孔和CFX384 TOUCHTM实时PCR检测系统20微升的最终体积中进行的用于测量荧光信号。该图展示除了包含用于测定（＃5）所有组件的完整的编辑反应各种控制。的荧光测定FRET底物的存在下单独（＃1），以评估基板的完整性。 ＃2试样是在没有editosome的执行之前编辑监视任何核酶活性。为了评估在所述基板上的变性editosome的效果，荧光测量在editosome和FRET底物的存在只（＃3）。为了测试指南指导编辑特异性，一个SAMPLE在没有gA6Rbz的是使用（＃4）。阿非抑制（C53，＃6）和抑制性化合物（MRB，＃7）被用来测试对编辑测定中的效果。而RNA编辑是由MRB显著抑制，C53具有不可忽视的作用。误差棒相当于一个实验性的变化（标准偏差）10次重复之间。 y轴表示单位为百分数相对编辑活动，考虑到反应完成（＃5）为100％。
| 10％ | 30％ | |
| 2X HHE梯度缓冲液 | 5毫升 | 5毫升 |
| 甘油 | 1毫升 | 3毫升 |
| DEPC H 2 O的 | 4毫升 | 2毫升 |
| 1 M DTT | 10微升 | 10微升 |
表1。10％和30％的甘油溶液（每次10ml）。
| 编辑前的A6核酶（preA6Rbz） | |
| preA6Rbz DNA模板 | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3' |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU-3' |
| RNA的股票浓。 | 1微米 |
| 指南A6核酶（gA6Rbz） | |
| gA6RBz DNA模板 | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3' |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3' |
| RNA的股票浓。 | 2.5微米 |
| 指南A6核酶竞争对手（gA6RBz_comp） | |
| gA6Rbz_comp DNA模板 | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3' |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3' |
| RNA的股票浓。 | 12.5微米 |
| 主动A6核酶（A6RBz） | |
| A6Rbz DNA模板 | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3' |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3' |
| RNA的股票浓。 | 1微米 |
| FRET底物 | |
| TAMRA淬灭 | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-TAMRA-3'（Eurogentec） |
| 爱荷华黑色淬灭剂 | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA衣阿华黑色-3'（IDT） |
| RNA的股票浓。 | 15μM（两个） |
表2 DNA模板和RNA底物。
| 组成 | 编辑反应（微升） |
| HHE 10倍 | 1.5 |
| 0.1M的氯化钙 | 1 |
| 100毫摩尔ATP | 0.2 |
| 10％TritonX一100 | 0.2 |
| 500毫微克/μL圆酵母RNA | 1 |
| Editosome | 5 |
| 无RNase H 2 O的 | 7.1 |
| 1微米preA6Rbz | 1 |
| 2.5微米gA6Rbz | 1 |
| 总 | 18 |
表3。反应组合物和母液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
一种新型的高通量筛选方法来确定对锥虫的RNA编辑复杂的抑制剂已提交，为药物发现的新工具来对抗引起的锥虫病。基于FRET的核酶法已被广泛地用于不同的用途20-22;然而，我们动用的体外监测RNA编辑活动19 FRET为基础的核酶分析的能力。该测定可能适用于其他类型的RNA编辑在真核生物，如哺乳动物23的核编码的RNA的核苷酸替换编辑。
该测定中的新颖之处在于不是在建立基于FRET的测定核酶本身，而是在发展，结合本技术成RNA的编辑测定是适合于化学物质的抵抗editosome高通量筛选的方法。核酶分析为基础的方法比其他屏幕和屁股几大优势目前用于此目的AYS。具体而言，该技术提供了敏感和可再现的“混合-测量”测定法依赖于荧光底物，而不是放射性标记1，由此使得适合用于高通量筛选19。荧光信号的实时监控，而不是一个简单的终点信号加入底物后，能够更准确地确定测定化合物19的IC 50值。此外，它允许化合物在全editosome复杂的，而不是个别的重组蛋白质的抑制效果的测试。给定的蛋白质复合物内相互作用的动态特性，它可以被认为，该方法允许在一个多种生物识别代表针对editosome蛋白抑制剂的设置24。此外，针对全editosome复杂提供了一个机会，有可能阻止RNA编辑的进展在各种瞬态步骤，但没有预先确定的。因此，该技术将允许获得一个更好的角度来，是至关重要的RNA编辑的过程中相互作用和活动。这种方法已经被证明是成功的，在过去的例证原核生物的核糖体复杂的装配和使用抗生素，如紫霉素和红霉素功能的阐明，作为复杂24,25抑制剂。
为确保顺利完成的方法，在协议的某些调整可能是必要的。首先，选择适当的甘油梯度线粒体提取物馏分的是至关重要的。这里，将级分7到11中，对应于梯度的〜20S区域，显示出最高的编辑活动，以分数9表现出最大活性。虽然这部分被选定为所有提出的测试，必须事先测试所有部分，以便其在森林资源评估，评估CTION编辑活动的高峰。第二，验证馏分选择，关键是要进行初步测试通过计算Z'-因子值来评估信号 - 噪声比。如果适当的线粒体提取物甘油梯度分离已经完成，0.6的Z'值才能实现。接下来，建议必要线粒体提取物通过滴定19，以达到最大的编辑活动的重新评价的反应体积。
本文所提出的技术中的一个重要的限制是有关的线粒体提取甘油梯度分馏通过该editosome复杂的纯化19的费力和耗时的过程。尽管有这些缺点，该技术被优先地提出取得鉴于其低的成本与产量潜力粗editosome馏分，从而限定它施用于高通量筛选。与此相反，其它方法如TAP-标签普rification，它能够给予更纯化editosome馏分，是可取的低到中等通量测定，例如在次级测定法的情况下。此外，为了确保化合物的特定的抑制效果，这是必要的，包括控制在不存在editosome来测试它们对核酶（A6Rbz）的活性。但应注意的是，以前的研究已经强调，这种方法可能是无效的，由于在高浓度的化合物19中的可能的干扰计算用于染料类化合物的IC 50值。
为了进一步提高对HTS技术提出，开发涉及预切割的预编辑核酶类似的基于荧光的测定的灵敏度是有益的。这将允许通过绕过在editosome复杂的核酸内切酶催化的速率限制核酸内切裂解步骤。这个修改后的试验的另一个优点是应用程序作为辅助筛选工具监测通过对ExoUase，TUTase和结扎催化活性的初级筛选中鉴定的抑制剂的效果。目前建议的测定限于抑制剂的检测对RNA编辑的缺失型。因此，另一种途径，探索将是展示实验的修改，使监测对RNA编辑的插入式复合效应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
