Abstract
काफी प्रगति trypanosomes में mitochondrial आरएनए संपादन के तंत्र का पता लगाने में किया गया है. इसी तरह, काफी प्रगति आरएनए संपादन उत्प्रेरित कि editosome परिसर के घटकों की पहचान करने में किया गया है. हालांकि, यह उन प्रोटीन एक साथ कैसे काम अभी भी स्पष्ट नहीं है. Editosome के खिलाफ एक उच्च throughput स्क्रीन से प्राप्त रासायनिक यौगिकों संपादन चक्र में एक या एक से अधिक चरणों ब्लॉक या प्रभावित कर सकता है. इसलिए, नए रासायनिक यौगिकों की पहचान editosome समारोह और विधानसभा विदारक के लिए बहुमूल्य आणविक जांच उत्पन्न करेंगे. पिछले अध्ययनों में, इन विट्रो संपादन assays रेडियो लेबल शाही सेना का उपयोग किया गया. ये assays समय अक्षम और उच्च throughput उद्देश्यों के लिए अनुपयुक्त, उपभोग कर रहे हैं. इधर, एक समरूप प्रतिदीप्ति आधारित "मिश्रण और उपाय" शाही सेना संपादन की निगरानी के लिए हथौड़ा ribozyme इन विट्रो संवाददाता परख, प्रस्तुत किया है. केवल की शाही सेना संपादन का एक परिणाम के रूप मेंहथौड़ा ribozyme एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) oligoribonucleotide सब्सट्रेट दरार आए. इससे एक संकेत के उत्पादन पीने की वस्तु से फ्लोरोफोरे की जुदाई में यह परिणाम है. Editosome समारोह हिचकते है जब इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति संकेत बुझती किया जाएगा. इस विट्रो आरएनए संपादन या editosome समारोह को बाधित कर सकते हैं कि रसायनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग में नजर रखने के लिए आम तौर पर लागू किया जाना चाहिए कि एक बेहद संवेदनशील और सरल परख है.
Introduction
शाही सेना संपादन, एक के बाद transcriptional mRNA संशोधन की प्रक्रिया, पहली trypanosomatids 1 में खोज की थी. तब से पर्याप्त काम ट्रिपैनोसोमा ब्रुसे 2,3 में शाही सेना संपादन के पीछे तंत्र का अध्ययन करने में आयोजित किया गया है. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में, editosome, के बारे में 20 प्रोटीन का एक कोर परिसर, ऊर्जा पैदा oxidative phosphorylation प्रणाली के कई घटकों के लिए परिपक्व mitochondrial mRNAs बनाता है. उत्प्रेरक की घटनाओं का क्रम गाइड RNAs (gRNAs) द्वारा निर्धारित रूप में, endonucleolytic दरार, uridylate (यू) के अलावा या हटाने, और बंधाव है 4.
कोर editosome जटिल प्रोटीन के अलावा, सहायक कारकों की एक संख्या भी 5-7 पहचान की गई है. ये प्रोटीन ज्यादातर स्वतंत्र परिसरों में वर्गीकृत किया है देखा जाता है. हालांकि, कोर editosome परिसर में प्रोटीन विधानसभा के आदेश और सहायक के साथ कोर परिसर से बातचीत पैटर्नपरिसरों अभी तक निर्धारित किया है. Trypanosomatids में शाही सेना के संपादन की प्रक्रिया का लक्ष्य निर्धारण रासायनिक dissectors प्रदान कर सकता है कि editosome परिसर के विधानसभा और समारोह का अध्ययन करने में सहायता. इसके अलावा, कई editosome प्रोटीन पर कार्यात्मक अध्ययन दवा 8-12 लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता का संकेत है, विभिन्न चरणों जीवन भर अनिवार्यता से पता चला है. इसलिए, editosome का पाया inhibitors भी trypanosomatids के खिलाफ नेतृत्व यौगिकों के रूप में कार्य कर सकते हैं. Trypanosomatid के कारण बीमारियों के खिलाफ वर्तमान में उपलब्ध दवाओं, विषाक्त अक्षम और 13,14 महंगे हैं, क्योंकि यह समय पर है.
एक कुशल और सुविधाजनक इन विट्रो परख शाही सेना संपादन ब्लॉक कि विशिष्ट inhibitors के लिए रासायनिक ब्रह्मांड का अन्वेषण करने के लिए आवश्यक है. तीन assays विकसित और editosome गतिविधियों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है: इन विट्रो आरएनए संपादन परख 15 (क) में पूरा दौर, (ख) इन विट्रो आरएनए संपादन परख 16,17, में पूर्व cleaved एकND (ग) हथौड़ा ribozyme (HHR) परख 18 के आधार पर. पहले दो assays रेडियोधर्मिता की मदद से संपादित उत्पाद (ATPase 6 mRNA) के प्रत्यक्ष दृश्य पर भरोसा करते हैं. HHR आधारित परख संपादन पर एक ribozyme के रूप में व्यवहार करने के लिए मॉडलिंग की है कि ATPase 6 mRNA का एक संशोधित संस्करण का उपयोग करता है. कार्यात्मक ribozyme तो विशेष रूप से एक पत्रकार के रूप में सेवारत एक radiolabeled शाही सेना सब्सट्रेट cleaves. हाल ही में, Moshiri एट अल. विकसित एक 'मिश्रण और उपाय' radiolabeled शाही सेना सब्सट्रेट एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) सब्सट्रेट 19 से बदला गया है जहां शाही सेना संपादन की निगरानी के लिए इन विट्रो संवाददाता परख में HHR आधारित. इस परख के सिद्धांत फायदे हैं: (क) यह सक्रिय ribozyme और सब्सट्रेट दरार का उत्पादन कम मात्रा (यानी 20 μl) में एक ही ट्यूब में एक साथ होते हैं, के रूप में एक तेजी से और सुविधाजनक मिश्रण और परख के उपाय प्रकार है, (ख ) यह radioactively लेबल सामग्री के प्रयोग से बचा जाता है, (ग) संवेदनशीलता कि एक हैप्रतिदीप्ति एक माइक्रो अनुमापांक थाली प्रारूप में इंस्ट्रूमेंटेशन, और (घ) शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत द्वारा fforded. इस परख का प्रयोग, शुद्ध editosome के खिलाफ ज्ञात आरएनए संपादन ligase inhibitors का प्रभाव 19 की पुष्टि की थी. इस प्रयोग मुख्य रूप से टी. से पूरे editosomes के खिलाफ, शाही सेना संपादन inhibitors की तेजी से पहचान के लिए परख मान्य ब्रुसे.
संख्या 1 के एक विस्तृत कदम दर कदम योजनाबद्ध है प्रतिदीप्ति आधारित इन विट्रो आरएनए संपादन परख में. इस प्रोटोकॉल या तो इन विट्रो में शाही सेना के संपादन की निगरानी या आसानी से विभिन्न तराजू के यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
नीचे प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति आधारित आरएनए संपादन परख प्रदर्शन के लिए प्रक्रिया का वर्णन है. परख एक भी पीसीआर ट्यूब, प्रयोग की गुंजाइश के आधार पर 96 अच्छी तरह से, या 384 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके बाद प्रतिदीप्ति संकेत एक उपयुक्त वास्तविक समय पीसीआर जांच प्रणाली पर पढ़ा जा सकता है. यहाँ परख 384 अच्छी तरह से प्लेटों के संदर्भ में वर्णित है.
1. संवर्धन टी. ब्रुसे प्रकोष्ठों
- टी. के लिए एक मध्यम विकास की तैयारी ब्रुसे फार्म कोशिकाओं procyclic. माध्यम के 1 एल के लिए:
- 800 मिलीलीटर miliQ पानी में 25.4 जी एसडीएम-79 पाउडर भंग.
- 10 एम NaOH के साथ 7.3 2 3 NaHCO जी और पीएच जोड़ें.
- 900 एमएल, बाँझ फ़िल्टर के अंतिम मात्रा को nanopure पानी जोड़ें.
- 10% का अंतिम सांद्रता भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान और hemin (2.5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें (v / v), 100 यू / एमएल और 7.5 मिलीग्राम / एल क्रमशः.
- टी. <की 300 मिलीलीटर के लिए आगे बढ़ेंउन्हें> 1.5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व को 70 rpm पर मिलाते हुए 28 डिग्री सेल्सियस पर ब्रुसे 1.7A जंगली प्रकार (procyclic फार्म) कोशिकाओं,. नोट: इस के साथ सक्रिय editosome के 3 मिलीलीटर का उत्पादन करना चाहिए ~ 600 संपादन प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त कुल प्रोटीन, 0.5 मिलीग्राम.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल
- ठंडा PBSG बफर के 50 एमएल (10 मिमी ना 2 4 HPO, 10 मिमी नाह 2 पीओ 4, 145 मिमी NaCl, और 6 मिमी ग्लूकोज) के साथ गोली धोने, और 10 मिनट में के लिए 10,000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को फिर से नीचे स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस
क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया के 2. अलगाव
नोट: सभी कदम editosome गतिविधि को संरक्षित करने के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए.
- DTE बफर के 30 मिलीलीटर (1 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0 और 1 मिमी EDTA) में काटा कोशिकाओं Resuspend. ऊपर पथपाकर और नीचे बर्फ पर कम से कम 10 बार से कोशिका झिल्ली को बाधित करने के लिए एक 40 मिलीलीटर बाँझ Dounce homogenizer (पूर्व ठंडा) का प्रयोग करें. Preferentially mitochondria नीचे लाने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,800 XG पर 0.25 एम. अपकेंद्रित्र की एक अंतिम एकाग्रता के लिए homogenate के लिए, तुरंत 4.3 मिलीलीटर 60 से% sucrose (यानी 1.75 एम डब्ल्यू / वी) जोड़ें.
- एसटीएम बफर (20 मिमी Tris-एचसीएल 8.0 पीएच, 250 मिमी sucrose और 2 मिमी 2 MgCl) के 4.6 मिलीलीटर में mitochondrial गोली Resuspend. मैं क्रमशः 0.3 मिमी और 9 यू / मिलीलीटर के अंतिम सांद्रता में 0.1 एम 2 CaCl की 13.8 μl और RNase मुक्त DNase की 4 μl जोड़ें. बर्फ पर 1 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,800 XG पर DNase मैं अपकेंद्रित्र को निष्क्रिय करने के लिए STE बफर के 4.6 मिलीलीटर (20 मिमी Tris-एचसीएल 8.0 पीएच, 250 मिमी sucrose और 2 मिमी EDTA) जोड़ें
- 400 lysis बफर के μl (10 मिमी Tris-एचसीएल 7.2 पीएच, 10 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी KCl, 1 ग्राम / एमएल pepstatin, 1 मिमी डीटीटी, और 1x पूरा EDTA मुक्त protease अवरोध) और एक को हस्तांतरण में गोली Resuspend microfuge ट्यूब.
- 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10% ट्राइटन X-100 जोड़ेंएन डी एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए lysate सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर दो बार centrifuging द्वारा mitochondrial lysate स्पष्ट; मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला हर समय बनाए रखना है.
3. Editosome शोधन
- डालो एक 10 मिलीलीटर 10% -30% (40 मिमी HEPES 7.9 पीएच, 20 मिमी मिलीग्राम (OAC) 2, 100 मिमी KCl 2x HHE ढाल बफर का उपयोग ultracentrifuge एक ट्यूब में (v / v) रैखिक ग्लिसरॉल ढाल (1 टेबल), और 2 मिमी EDTA) और अनुदेश मैनुअल का पालन करके एक ढाल निर्माता.
- ध्यान ग्लिसरॉल ढाल के ऊपर से समाधान के 500 μl निकालें और धीरे मंजूरी दे दी mitochondrial lysate के 500 μl लोड. Ultracentrifuge एक का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए 178.000 XG पर स्पिन.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ढाल के ऊपर से नीचे तक क्रमिक रूप से 500 μl भिन्न लीजिए तब उपयोग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान का उपयोग भिन्न फ्रीज तस्वीर.
- 3 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से एक 1:1 दाढ़ अनुपात में एक T7 प्रमोटर oligonucleotide (5'-TAATACGACTCACTATAGGG -3 ') के साथ T7 प्रमोटर अनुक्रम (तालिका 2) के लिए पूरक अनुक्रम युक्त और आरटी पर ठंडा संबंधित डीएनए टेम्पलेट पानी रखना कम से कम 10 मिनट के लिए.
- अनुदेश मैनुअल का पालन करते हुए इन विट्रो प्रतिलेखन किट का उपयोग आरएनए टाइप करना.
- 7 एम यूरिया डाई (7 एम यूरिया, 0.05% Xylene Cynol, और 0.05% Bromophenol नीला) के बराबर मात्रा जोड़कर प्रतिलेखन प्रतिक्रिया बंद करो. 9% polyacrylamide जेल (9% acrylamide, 7 एम यूरिया, 1x TBE) denaturing निष्फल एक फिल्टर पर चलाएँ.
- एक का पता लगाने में शॉर्टवेव यूवी दीपक और आबकारी संबंधित शाही सेना के साथ पराबैंगनी (यूवी) ग्रहण करें. एक microfuge ट्यूब में excised जेल टुकड़ा प्लेस और जेल क्षालन बफर के 400 μl (20 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 250 मिमी NaOAc, 1 मिमी EDTA और 0.25% एसडीएस) जोड़ें. एक ट्यूब रोटेटर पर आरटी पर रातोंरात Elute.
- Preciठंड 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 30 मिनट या -20 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या तो incubating द्वारा eluted आरएनए pitate.
- शाही सेना के नीचे गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र,.
- 75% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ गोली धोने. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र
- तालिका 2 में दिखाया गया है, वांछित सांद्रता को प्राप्त करने के लिए RNase मुफ्त पानी में उचित रूप से शाही सेना गोली Resuspend.
5. प्रतिदीप्ति आधारित आरएनए संपादन परख
- एक भी प्रतिक्रिया के लिए, एक microfuge ट्यूब में preA6Rbz की 1 pmol (1 μl) और 2.5 pmol gA6Rbz (1 μl) (1:2.5 दाढ़ अनुपात) गठबंधन 3 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और उस पर के लिए आरटी पर बैठते हैं कम से कम 10 मिनट.
- इस बीच (25 मिमी HEPES 7.9 पीएच, 10 मिमी मिलीग्राम (OAC) 2, 50 मिमी KCl और 10 मिमी EDTA), 1 मिमी 1x HHE बफर युक्त संपादन प्रतिक्रिया के लिए, preA6Rbz और gA6Rbz बिना, 3 टेबल का उपयोग कर एक मास्टर मिश्रण तैयारएटीपी, 5 मिमी 2 CaCl, torula खमीर शाही सेना, 0.1% ट्राइटन X-100, और शुद्ध editosome की 16 एनजी / μl.
- मास्टर मिश्रण को पूरा करने के लिए annealed preA6Rbz और gA6Rbz जोड़ें.
- RNase मुक्त पानी के 2 μl (कोई यौगिकों के साथ कुओं) या 200 माइक्रोन रासायनिक यौगिकों के 2 μl जिसमें या तो कुओं में मास्टर मिश्रण (3 टेबल) का 18 μl बांटना और चित्रा 5 के अनुसार थाली में नियंत्रण के नमूने शामिल हैं.
- एक थाली मुहर के साथ प्लेट को सील करने और किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, नीचे प्लेट स्पिन. 4 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- प्रत्येक अच्छी तरह से gA6Rbz प्रतियोगी की 25 pmol (2 μl) जोड़ें. नीचे थाली स्पिन और एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर यह जगह है, एक ताजा मुहर रखें. निम्नलिखित प्रयोग कार्यक्रम:
चरण 1: 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 10 मिनट के लिए 24 डिग्री सेल्सियस; चरण 3: बंद करो. - 23 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए झल्लाहट सब्सट्रेट के 15 pmol (1 μl) जोड़ें. एक ताजा मुहर के साथ थाली सील.जल्दी से थाली स्पिन और रियल टाइम पीसीआर मशीन पर इसे वापस जगह है.
- निम्न चरणों के साथ एक नया प्रयोग कार्यक्रम:
चरण 1: 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: पढ़ें; चरण 3: 1, 40 बार कदम पर जाएं; चरण 4: बंद करो. - पढ़ने की आवश्यकता होती है और परिवार फिल्टर द्वारा चुने गए सभी कुओं का चयन करके सेटअप थाली. 23 μl और चलाने के लिए शुरू के रूप में इनपुट मात्रा.
- विश्लेषण के लिए एक बार ग्राफ पर ढलान की साजिश रचने के एक गतिज माप प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह / नमूना से प्राप्त मूल्यों के ढलान की गणना. ध्यान दें: एक गतिज पढ़ें नमूना और पृष्ठभूमि के बीच संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार; पृष्ठभूमि नमूना शून्य के करीब एक ढलान से होगा. एक अंत बिंदु पढ़ने उच्च पृष्ठभूमि शोर है.
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Representative Results
एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन की स्थापना के लिए आवश्यक आवश्यक कदम का प्रदर्शन, 2-5 परख की गुणवत्ता से संबंधित प्रतिनिधि नियंत्रण प्रयोगों हैं आंकड़े. ये स्क्रीनिंग के कई दिनों में एक अनुरूप परख के लिए या अलग स्क्रीन की तुलना के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रयोगों हैं.
प्रतिदीप्ति संकेत करने वाली शोर अनुपात का आकलन
एक बड़े पैमाने पर सेटअप में fluorescein लेबल oligoribonucleotide सब्सट्रेट की स्थिरता और गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, परख पृष्ठभूमि और अधिकतम संकेत के बीच अंतर के रूप में परिभाषित Z'कारक, सक्रिय ribozyme अणु (A6Rbz) का उपयोग कर की गणना की गई. . '(; Emitter परिवार) और 3 fluorescein' एन, एन 'tetrame Z'कारक के साथ assays> 0.5 उच्च throughput स्क्रीन के लिए स्वीकार्य माना जाता है चित्रा 2 झल्लाहट 5 के साथ लेबल सब्सट्रेट का उपयोग प्रतिनिधि डेटा से पता चलता हैthylrhodamine (Tamra, पेय) (A6Rbz_F / टी). A6Rbz की उपस्थिति और अनुपस्थिति में 72 replicates उपयोग कर की गणना करने पर यह सब्सट्रेट 0.64 की एक Z'कारक का उत्पादन किया.
इस परख में आयोवा काला अंधेरा पेय (A6Rbz_F/Ib) का उपयोग करते हुए एक वैकल्पिक सब्सट्रेट Tamra की तुलना में एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्ति कर सकते हैं. आयोवा काले, Tamra विपरीत उत्सर्जन गर्मी और प्रकाश के रूप में नहीं ऊर्जा अवशोषित इसका कारण यह है. परिवार / आयोवा काला (एफ / आईबी) लेबल सब्सट्रेट का उपयोग कर प्राप्त Z'कारक 0.68 था. Tamra लेबल सब्सट्रेट पर एफ / आईबी लेबल सब्सट्रेट के लिए Z'कारक में सुधार की वजह से इसकी अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि का है. ये प्रतिनिधि परिणाम दोनों substrates के एक उच्च throughput स्क्रीन में उपयोग के लिए व्यवहार्य विकल्प हैं कि दिखा.
ग्लिसरॉल ढाल भागों के संपादन क्रियाएँ निर्धारण
, प्रयोगों के लिए ग्लिसरो सबसे सक्रिय editosome अंशों का निर्धारण और चयन करने के लिएएल ढाल भिन्न प्रतिदीप्ति आधारित परख (चरण वी) का उपयोग इन विट्रो संपादन के लिए परीक्षण किया गया. ये आंकड़े सबसे ज्यादा चर्चित भिन्न के रूप में (चित्रा 3) भिन्न 7-12 शो (≥ 50% संपादन गतिविधि, 100% के रूप में सबसे अधिक सक्रिय अंश के साथ). अधिक editosome आवश्यक है जब ये भिन्न जोड़ा जा सकता है.
Editosome भिन्न संयुक्त थे Z'कारक की गणना करना
सबसे ज्यादा चर्चित भिन्न (F8 + F9 + F10) editosome के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया जब editosome अंश combinig के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, 0.6 की Z'कारक मूल्य की गणना की गई. 72 replicates editosome की उपस्थिति और अनुपस्थिति (चित्रा 4) में परीक्षण किया गया Z'कारक की गणना करने के लिए. एफ / आईबी सब्सट्रेट इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था. इन आंकड़ों ग्लिसरॉल ढाल भिन्न संयोजन Z'कारक, के आधार पर परख की गुणवत्ता पर कम से कम प्रभाव है कि दिखा.
गधा = "jove_content"> परख के लिए प्रतिनिधि नियंत्रण प्रयोग
विभिन्न नियंत्रण नमूनों की तुलना प्रतिनिधि डेटा परख में चर का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा 5 में दिखाया गया है, किसी भी शाही सेना संपादन घटक (प्रतिक्रियाओं 1-4) लापता प्रतिक्रियाओं सब्सट्रेट फोड़ना नहीं है. प्रतिदीप्ति और रिश्तेदार संपादन गतिविधि द्वारा मापा सब्सट्रेट की दरार केवल एक अवरोध करनेवाला (प्रतिक्रिया 5) के अभाव में या सभी संपादन घटक की उपस्थिति और एक निष्क्रिय यौगिक (प्रतिक्रिया में संपादन प्रतिक्रियाओं के सभी घटकों की उपस्थिति में मनाया जाता है 6). इसके विपरीत, एक निरोधात्मक यौगिक आरएनए संपादन ब्लॉक कर सकते हैं और एक सकारात्मक नियंत्रण (प्रतिक्रिया 7) के रूप में प्रयोग किया जाता है. इधर, रंगस्थापक काले (MRB) और C53 यौगिकों क्रमशः, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया.
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चित्रा 1. हथौड़ा ribozyme आधारित इन विट्रो आरएनए संपादन परख में. का) कदम दर कदम योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रतिदीप्ति आधारित इन विट्रो संपादन परख में: अपने गाइड आरएनए (gA6Rbz) के साथ पहले से संपादित हथौड़ा ribozyme (पूर्व संपादित A6Rbz) (क) संकरण. (ख) मान्यता और शुद्ध editosome परिसर से शाही सेना डुप्लेक्स की बातचीत. Editosome द्वारा उत्प्रेरित (ग) हटाने की शाही सेना संपादन. (घ) 85 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग और गाइड आरएनए प्रतियोगी (gA6Rbz_comp) के अलावा द्वारा editosome और gA6Rbz से संपादित A6Rbz की हदबंदी. (ई) सक्रिय A6 हथौड़ा ribozyme (सक्रिय A6Rbz) के साथ झल्लाहट सब्सट्रेट के संकरण. (च) सक्रिय ribozyme. बी) पूर्व संपादित हथौड़ा ribozyme (A6Rbz पूर्व संपादित) द्वारा झल्लाहट सब्सट्रेट की दरार निम्न परिवार संकेतों का पता लगाने के लिए तीन हमसे का विलोपन (दो सिरों Arro निर्दिष्ट करता है कि gA6Rbz के सहयोग से दिखाया गया हैसंपादन साइट (ते) से पश्चिम). कार्यात्मक editosome की मौजूदगी में शाही सेना संपादन का एक परिणाम के रूप में निष्क्रिय ribozyme अब झल्लाहट सब्सट्रेट (एक तीर द्वारा संकेत दरार साइट) फोड़ना सकता है कि अपनी सक्रिय रूप (संपादित A6Rbz) में संपादित किया है. 5'-CUGA -3 'ribozyme गतिविधि (संपादित साइट) के लिए आवश्यक उत्प्रेरक कोर में संपादित A6Rbz की (यह आंकड़ा Moshiri 19 से संशोधित किया गया है) पर प्रकाश डाला है संरक्षित. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. सिग्नल के लिए शोर अलग quenchers शरण झल्लाहट substrates के बीच अनुपात तुलना. परिवार / Tamra (एफ / टी) और परिवार / आयोवा काले FQ (एफ / आईबी) substrates का उपयोग ribozyme (A6Rbz) गतिविधि. Y-अक्ष represeप्रति मिनट एनटीएस प्रतिदीप्ति मनमाना इकाई (FAU).
Mitochondrial lysate के ग्लिसरॉल ढाल centrifugation. भिन्न # 9 (F9) से प्राप्त की चुनिंदा अंशों की चित्रा 3. आरएनए संपादन गतिविधि उच्चतम गतिविधि है. Y-अक्ष 100% के रूप में F9 पर विचार, प्रतिशत में रिश्तेदार संपादन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 4. Editosome स्रोत के रूप में सबसे अधिक सक्रिय भिन्न (F8 + F9 + F10) का उपयोग Z'कारक गणना. प्रायोगिक भिन्नता प्रतिक्रिया के प्रत्येक प्रकार के 72 replicates से प्राप्त हुई थी. Z'कारक 0.6 के रूप में गणना की गई. Y-अक्ष के सापेक्ष संपादन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 5. प्रतिदीप्ति आधारित आरएनए संपादन परख के लिए प्रतिनिधि प्रयोग. प्रतिक्रियाओं अच्छी तरह से और CFX384 TouchTM वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने प्रणाली के अनुसार 20 μl के अंतिम मात्रा में प्रदर्शन किया गया प्रतिदीप्ति संकेत को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ग्राफ परख (# 5) के लिए सभी घटकों में शामिल है कि एक पूर्ण संपादन प्रतिक्रिया के अलावा विभिन्न नियंत्रणों प्रस्तुत करता है. प्रतिदीप्ति लड़की (# 1) सब्सट्रेट की अखंडता का आकलन करने के लिए झल्लाहट सब्सट्रेट की उपस्थिति में मापा गया था. नमूना # 2 पूर्व संपादन करने के लिए किसी भी ribozyme गतिविधि पर नजर रखने के लिए editosome के अभाव में प्रदर्शन किया गया था. सब्सट्रेट पर विकृत editosome के प्रभाव का आकलन करने के लिए, प्रतिदीप्ति editosome और झल्लाहट सब्सट्रेट की उपस्थिति में मापा गया था केवल (# 3). गाइड का निर्देशन संपादन विशिष्टता, एक सैम परीक्षण करने के लिएमिसाल gA6Rbz के अभाव में (# 4) का इस्तेमाल किया गया था. एक गैर निरोधात्मक (C53, # 6) और एक निरोधात्मक यौगिक (MRB, # 7) संपादन परख पर प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. शाही सेना संपादन MRB से काफी हिचकते हैं, वहीं C53 नगण्य प्रभाव पड़ता है. त्रुटि सलाखों 10 replicates के बीच एक प्रयोगात्मक भिन्नता (मानक विचलन) के अनुरूप हैं. Y-अक्ष 100% के रूप में पूरा प्रतिक्रिया (# 5), विचार प्रतिशत में रिश्तेदार संपादन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है.
| 10% | 30% | |
| 2x HHE ढाल बफर | 5 मिलीलीटर | 5 मिलीलीटर |
| ग्लिसरोल | 1 मिलीलीटर | 3 मिलीलीटर |
| DEPC एच 2 हे | 4 मिलीलीटर | 2 मिलीलीटर |
| 1 एम डीटीटी | 10 μl | 10 μl |
तालिका 1. 10% और 30% ग्लिसरॉल समाधान (10ml प्रत्येक).
| पूर्व संपादित A6 ribozyme (preA6Rbz) | |
| preA6Rbz डीएनए टेम्पलेट | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT सीसी CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| preA6Rbz आरएनए | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA UCAAAUGU -3 ' |
| शाही सेना स्टॉक सान्द्र. | 1 माइक्रोन |
| गाइड A6 ribozyme (gA6Rbz) | |
| gA6RBz डीएनए टेम्पलेट | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC सीसी CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz आरएनए | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU -3 ' |
| शाही सेना स्टॉक सान्द्र. | 2.5 माइक्रोन |
| गाइड A6 ribozyme प्रतियोगी (gA6RBz_comp) | |
| gA6Rbz_comp डीएनए टेम्पलेट | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| gA6Rbz_comp आरएनए | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC -3 ' |
| शाही सेना स्टॉक सान्द्र. | 12.5 माइक्रोन |
| सक्रिय A6 ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz डीएनए टेम्पलेट | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC सीसी CTATAGTGAGTCGTATTA -3 ' |
| A6Rbz आरएनए | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU -3 ' |
| शाही सेना स्टॉक सान्द्र. | 1 माइक्रोन |
| सब्सट्रेट झल्लाहट | |
| Tamra पेय | 5'-परिवार GAUCUAUUGUCUCACA-Tamra -3 '(Eurogentec) |
| आयोवा काले पेय | 5'-परिवार GAUCUAUUGUCUCACA आयोवा ब्लैक -3 '(IDT) |
| शाही सेना स्टॉक सान्द्र. | 15 माइक्रोन (दोनों के लिए) |
तालिका 2. डीएनए टेम्पलेट्स और आरएनए substrates.
| रचना | संपादन प्रतिक्रिया (μl) |
| 10x HHE | 1.5 |
| 0.1 एम 2 CaCl | 1 |
| 100 मिमी एटीपी | 0.2 |
| 10% TritonX-100 | 0.2 |
| 500 एनजी / torula खमीर शाही सेना μl | 1 |
| Editosome | 5 |
| RNase मुक्त एच 2 ओ | 7.1 |
| 1 माइक्रोन preA6Rbz | 1 |
| 2.5 माइक्रोन gA6Rbz | 1 |
| संपूर्ण | 18 |
तालिका 3. रिएक्शन संरचना और गुरु मिक्स.
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Discussion
Trypanosomes की शाही सेना संपादन जटिल खिलाफ inhibitors की पहचान के लिए एक उपन्यास उच्च throughput स्क्रीनिंग विधि trypanosomatids के कारण बीमारियों का मुकाबला करने के लिए दवाओं की खोज के लिए एक नया उपकरण उपलब्ध कराने, प्रस्तुत किया गया था. झल्लाहट आधारित ribozyme परख बड़े पैमाने पर विभिन्न प्रयोजनों 20-22 के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, हम शाही सेना संपादन गतिविधि 19 की इन विट्रो निगरानी के लिए झल्लाहट आधारित ribozyme परख की क्षमता का उपयोग किया है. यह परख संभावित स्तनधारियों की 23 नाभिक इनकोडिंग RNAs के न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन संपादन के रूप में eukaryotes में शाही सेना संपादन के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस परख की नवीनता से प्रति झल्लाहट आधारित ribozyme assays स्थापित करने में नहीं है, लेकिन editosome के खिलाफ रसायन के उच्च throughput प्रदर्शन करने के लिए उत्तरदायी है कि एक शाही सेना संपादन परख में इस तकनीक को शामिल किया गया है कि एक विधि विकसित करने में. ribozyme परख आधारित पद्धति अन्य स्क्रीन और गधे पर कई फायदे हैंays वर्तमान में इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया. विशेष रूप से, तकनीक, जिससे यह उच्च throughput स्क्रीनिंग 19 के लिए फिट हैं, जिससे एक radiolabeled एक विरोध के रूप में एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट पर निर्भर एक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य "मिश्रण और उपाय" परख प्रदान करता है. बजाय एक साधारण अंत बिंदु संकेत के सब्सट्रेट के अलावा के बाद एक प्रतिदीप्ति संकेत के वास्तविक समय की निगरानी के लिए यह संभव अधिक सही assayed यौगिकों 19 के आईसी 50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए बनाता है. इसके अलावा, यह व्यक्ति पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए विरोध के रूप में पूरे editosome परिसर पर यौगिकों के निरोधात्मक प्रभाव का परीक्षण परमिट. प्रोटीन परिसरों के भीतर बातचीत के गतिशील प्रकृति को देखते हुए, यह इस पद्धति एक अधिक biologically प्रतिनिधि में editosome प्रोटीन के खिलाफ inhibitors की पहचान 24 स्थापित करने की अनुमति देता है कि सुझाव दिया जा सकता है. इसके अलावा, पूरे editosome परिसर को निशाना बनाने संभवतः शाही सेना संपादन की प्रगति की गिरफ्तारी के लिए एक अवसर प्रदान करता हैविभिन्न क्षणिक चरणों में है कि पहले से पहचान नहीं की गई है. इस प्रकार, तकनीक आरएनए संपादन की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं कि बातचीत और गतिविधियों के रूप में एक बेहतर परिप्रेक्ष्य पाने के लिए अनुमति देगा. यह दृष्टिकोण जटिल 24,25 के inhibitors के रूप में अभिनय, प्रोकार्योटिक राइबोसोम जटिल विधानसभा और समारोह ऐसे viomycin और इरिथ्रोमाइसिन के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग की व्याख्या के उदाहरण के रूप में अतीत में सफल होना पाया गया है.
विधि के सफल समापन सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में कुछ समायोजन आवश्यक हो सकता है. सबसे पहले, उचित ग्लिसरॉल ढाल mitochondrial निकालने अंश का चयन महत्वपूर्ण है. इधर, ढाल की ~ 20S क्षेत्र के लिए इसी 11 के माध्यम से भिन्न 7, अंश 9 अधिकतम गतिविधि प्रदर्शन के साथ, उच्चतम संपादन गतिविधि दिखाया. इस अंश प्रस्तुत परीक्षणों के सभी के लिए चयनित किया गया था, यह जो FRA में आकलन करने के क्रम में पहले से सब भिन्न परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैसंपादन गतिविधि चोटियों ction. दूसरा, अंश चयन मान्य करने के लिए, यह Z'कारक मूल्य की गणना के द्वारा संकेत करने वाली शोर अनुपात का आकलन करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. उचित mitochondrial निकालने ग्लिसरॉल ढाल fractionation पूरा हो चुका है, तो 0.6 की एक Z'-मूल्य प्राप्त किया जा सकता है. अगला, यह अनुमापन 19 के माध्यम से अधिक से अधिक संपादन गतिविधि को प्राप्त करने के लिए आवश्यक mitochondrial निकालने का फिर से मूल्यांकन प्रतिक्रिया मात्रा की सिफारिश की है.
इस अखबार में प्रस्तुत तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा editosome जटिल 19 शुद्ध होता है जिसके द्वारा mitochondrial निकालने ग्लिसरॉल ढाल fractionation की श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रक्रिया का सवाल है. इन नुकसान होने के बावजूद, इस तकनीक preferentially जिससे उच्च throughput प्रदर्शन करने के लिए आवेदन के लिए यह योग्यता, उपज क्षमता बनाम अपनी कम लागत को देखते हुए कच्चे तेल editosome भिन्न प्राप्त करने के लिए सुझाव दिया है. ऐसे नल टैग पु के रूप में इसके विपरीत, अन्य तरीकों मेंrification, अधिक शुद्ध editosome भिन्न दे पा रहे हैं ऐसे माध्यमिक assays के मामले में के रूप में मध्यम throughput assays के लिए कम के लिए उचित हैं जो. इसके अलावा, यौगिकों के विशिष्ट निरोधात्मक प्रभाव को सुनिश्चित करने के क्रम में, यह editosome के अभाव में ribozyme (A6Rbz) की गतिविधि के खिलाफ उन्हें परीक्षण करने के लिए नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. यह पिछले अध्ययनों में इस विधि के कारण उच्च यौगिक सांद्रता 19 में संभावित हस्तक्षेप करने के लिए डाई की तरह यौगिकों के लिए IC50 मूल्यों की गणना में अप्रभावी हो सकता है कि प्रकाश डाला है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
आगे पूर्व cleaved पूर्व संपादित ribozyme से जुड़े एक समान प्रतिदीप्ति आधारित परख विकासशील प्रस्तुत एचटीएस तकनीक, की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए भी फायदेमंद है. इस editosome परिसर में endonucleases द्वारा उत्प्रेरित दर सीमित endonucleolytic दरार कदम को दरकिनार अनुमति होगी. इस संशोधित परख का एक अन्य लाभ यह है कि एक माध्यमिक प्रदर्शन उपकरण के रूप में आवेदन किया जाएगाExoUase, TUTase और बंधाव उत्प्रेरक की गतिविधियों पर प्राथमिक स्क्रीन के माध्यम से पहचान inhibitors के प्रभाव पर नजर रखने के लिए. वर्तमान में प्रस्तावित परख शाही सेना संपादन का विलोपन प्रकार के खिलाफ inhibitors का पता लगाने के लिए सीमित है. इसलिए, पता लगाने के लिए एक और अवसर आरएनए संपादन की प्रविष्टि प्रकार पर मिश्रित प्रभाव की निगरानी को सक्षम करने के लिए प्रस्तुत परख का संशोधन किया जाएगा.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
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