Array Comparative Genomisk Hybridisering (Array CGH) for deteksjon av Genomiske Kopier nummer Varianter

Summary

Array CGH for påvisning av genomiske kopi antall varianter har erstattet G-bundet karyotype-analyse. Dette notatet beskriver teknologi og dens anvendelse i en diagnostisk tjeneste laboratorium.

Abstract

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Introduction

Det har vært kjent i mange år at slettinger eller ekstra kopier av kromosomsegmenter forårsaker utviklingshemming, dysmorfisme og congentical misdannelser, og i noen tilfeller forårsake genetiske syndromer ^en. Imidlertid er den eneste teknologien som er tilgjengelig frem til midten av 2000-tallet for genom-wide påvisning av disse endringene var G-banded kromosomanalyse, som har en oppløsning på rundt 5-10MB, avhengig av regionen og arten av ubalanse, og som ikke kan detektere abnormale kromosomer, hvor materialet er blitt erstattet med en region av et annet kromosom med samme båndmønster. Hjelpe cytogenetiske teknikker som fluorescens in situ hybridisering og multiplex ligation-spesifikk probe forsterkning har vært tilgjengelig for avhør av bestemte loci, ved mistanke om spesifikk syndrom ubalanse, men det var ikke før innføringen av matrisen komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH) til rutinemessig klinisk diagnostisk service ^2-5 som genom-wide deteksjon av kopitall varianter (CNVs) ble mulig på en kraftig økt oppløsning (typisk rundt 120KB). Klinisk service arbeid sammen med forskningsstudier har vist at CNVs for enkelte regioner er utbredt i normalbefolkningen ^6-7, mens andre CNVs, tidligere umulig å oppdage, er assosiert med neurodisabilities som autisme og epilepsi ^8-11.

Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen er brukt i vår UK National Health Service (NHS) klinisk diagnostisk laboratorium; vi bruker nye hybridisering strategier, batch testing og robotikk å minimere kostnadene i denne statlig finansiert tjeneste.

Før protokollen beskrevet nedenfor, bør høy kvalitet DNA bli ekstrahert fra hensiktsmessig utgangsmateriale, vanligvis blod, dyrkede celler eller vevsprøver. Spektrofotometri kan brukes til å måle konsentrasjonen (bør være> 50 ng / ul), og kontroller 260: 280 absorbans-forhold (b børe 1,8-2,0). Gelelektroforese kan brukes til å kontrollere at DNA er av høy molekylvekt uten signifikant nedbrytning.

Denne protokollen er laget for høyere gjennomstrømning laboratorier som er merking 96 prøver per kjøring bruker automatiserte væskehåndtering robotikk. Det kan imidlertid være innrettet for lavere gjennomstrømning laboratorier uten automatisering.

Protocol

1. Merking Reaction Før bruk, pre-delmengde cyanine 3 og 5-merkede dUTPs, umerkede nukleotider og tilfeldige primere på produsentens anbefalte konsentrasjoner i 96-brønners plater og butikk ved -20 C klar til bruk. Ved anvendelsen av denne protokollen, delmengde 10,5 mL av hensiktsmessig merket dUTP og 10,5 mL umerkede nukleotider og tilfeldige primere til hver brønn. Tine klar til bruk 96-brønns plate av nukleotider og primere ved 4 ° C i ca 1 time, beskyttet mot lys. Tint, likevekt…

Representative Results

Hver probe på en hybridiserte rekke visualiseres som en blanding av røde og grønne fluorokromer (se figur 1). Forholdet mellom rød til grønn fluorescerende signal for hver sonde er kvantifisert ved skanneren og tilhørende programvare plotter disse som log2 forhold i henhold til deres genomiske posisjon, og identifiserer områder som faller utenfor forhåndsinnstilte grenser. Den resulterende matrisen spor tillate tolkning av regioner identifisert som genomisk ubalansert. For eksempel, det spor fra…

Discussion

Array CGH vil ikke oppdage balanserte rearrangements eller ploidinummer abnormaliteter som triploidy. Videre kan lavt nivå mosaikk ubalanser ikke påvises. Imidlertid har matrise CGH en høyere oppløsning for CNV deteksjon enn G-banded kromosom analyse som det har erstattet i mange cytogenetikk laboratorier. Det er derfor dagens gullstandard for genome-wide CNV deteksjon. Det kan erstattes av neste generasjons sekvense teknologier i fremtiden, men for tiden, deres kostnader og tekniske kompleksiteten forbundet med å …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000