Трехмерная способ культивирования описано в данном протоколе повторяет развитие поджелудочной железы от дисперсных эмбриональных клеток-предшественников мышь поджелудочной железы, включая их существенного расширения, дифференцировки и морфогенеза в разветвленной органа. Этот метод поддается визуализации, функциональной вмешательства и манипуляции нише.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
Органная культура предоставляет полезную модель, мосты разрыв между комплекса, но весьма актуальны в естественных условиях исследований и удобный, но приблизительное моделирование моделей клеточных линий. В случае поджелудочной железы, нет клеточной линии совершенно эквивалентна поджелудочной железы предшественников хотя преобразуются клеточных линий, имитирующих эндокринных и экзокринных клетках. Весь поджелудочной железы взрослых не могут культивироваться; изолированные эндокринные островки может поддерживаться в течение нескольких недель без клеточной пролиферации и Срезы ткани могут быть сохранены в пробирке в течение нескольких часов 5. Эмбриональные поджелудочной железы культура была широко используется не только для изучения ее развитие, но и исследовать эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия 4,6,7, чтобы изображение обрабатывает 8 или химически мешать них 9. Два органа способы культивирования в основном используются: первый заключается в культивировании поджелудочной рецепторы на фибронектина покрытием пластин 2, что является удобnient для целей визуализации; Второй вариант заключается в культуре органы на фильтрах на воздух и жидкой фаз 3,4, который наилучшим образом сохраняет морфогенез. Хотя очень полезно, эти методы приводят к определенной степенью выравнивания; расширение предшественников очень ограничено по сравнению с нормальным развитием и исходного население комплекс, включающий все типы клеток поджелудочной железы и клеток мезенхимы.
Возможность культуры и расширить распределенных первичных клеток является ценным для изучения клональные отношения и раскрыть внутренние свойства изолированных типов клеток 10. Сугияма и др. 11. Может поддерживать поджелудочной железы предшественников и эндокринные клетки-предшественники, которые сохранили некоторые функциональные символы в течение 3-5 дней в культуре на фидерных слоях. Pancreatospheres, сродни нейросферы 12 и mammospheres 13, были расширены от взрослых островков и протоков клеток хотя природа прародителей / стволовых клеток, которые генерируют эти сферы не ясно. Кроме того, в отличие от физиологического развития, pancreatospheres содержится некоторые нейроны 14,15. Сферы были также недавно получены из эмбриональных поджелудочной железы предшественников 16,17 и регенерации поджелудочных желез 18 с хорошим расширением предшественников и последующего дифференцирования, но не повторять морфогенез.
3D модели от дисперсных и часто определенных клеток, которые самоорганизуются в миниатюрных органов в последнее время процветала и имитации развития или взрослых оборот нескольких органов, таких как кишечник 19,20, желудка 21, печень 22 простаты 23 и трахеи 24. В некоторых случаях, морфогенез развития и дифференциации были обобщены в 3D от ЭС клеток, как это имеет место в оптических чашек 25, 26 кишечник или головного мозга 27.
Здесь мы десывают способ расширить диссоциированные мультипотентные поджелудочной предшественники в эшафот 3D Matrigel, где они могут дифференцироваться и самоорганизовываться.
Крупномасштабное производство функциональных бета-клеток в пробирке остается неэффективной 1. В этом сложном контексте, развития биологические исследования могут помочь расшифровать точные сигналы, которые необходимы для дифференциации функциональных бета-клеток. Этот п…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась последовательно на НКРС границ в генетике пилотного премии, в отношении несовершеннолетних диабета исследовательский фонд Гранта 41-2009-775 и Грант 12-126875 от Det Фри Forskningsråd / Sundhed ог Sygdom. Авторы благодарят лабораторию Spagnoli за проведение видеосъемки.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |