De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
Orgelcultuur biedt een bruikbaar model dat de kloof tussen het complex, maar zeer relevante in-vivo-onderzoek en de handige maar bij benadering simulatie van cellijn modellen overbrugt. Bij de pancreas, is er geen cellijn volkomen gelijkwaardig pancreas voorlopercellen hoewel er getransformeerde cellijnen simuleren endocriene en exocriene cellen. De volwassen gehele alvleesklier kan niet worden gekweekt; endocriene geïsoleerde eilandjes kunnen worden gehandhaafd gedurende enkele weken zonder celproliferatie en weefselplakken kan in vitro worden gedurende enkele uren 5. Embryonale pancreas cultuur is op grote schaal gebruikt niet alleen om de ontwikkeling ervan te bestuderen, maar ook om epitheliale-mesenchymale interacties 4,6,7 onderzoeken, op de foto verwerkt 8 of chemisch bemoeien met hen 9. Twee orgelcultuur methoden worden voornamelijk gebruikt: de eerste bestaat uit het kweken van alvleesklier knoppen op fibronectine gecoate platen 2, dat is Convenient voor grafische doeleinden; de tweede optie is om de cultuur van de organen filters bij de lucht-water grensvlak 3,4 die het beste bewaart morfogenese. Hoewel nuttig, deze methoden leiden tot een zekere mate van afvlakking; de uitbreiding van voorlopercellen is zeer beperkt in vergelijking met de normale ontwikkeling en uitgangspopulatie complex omvattende alle typen pancreatische cellen en mesenchymale cellen.
De mogelijkheid om de cultuur en uitbreiden verspreide primaire cellen is waardevol voor lineage relaties bestuderen en ontdekken de intrinsieke eigenschappen van geïsoleerde celtypen 10. Sugiyama et al.. 11 kon pancreas voorlopercellen en endocriene voorouders dat een aantal functionele tekens bewaard gedurende 3-5 dagen in cultuur op de feeder lagen behouden. Pancreatospheres, verwant aan neurospheres 12 en mammospheres 13, zijn uitgebreid van volwassen eilandjes en ductale cellen, hoewel de aard van de voorlopers / stamcellendat deze sferen te genereren is niet duidelijk. Bovendien, in tegenstelling fysiologische ontwikkeling, de pancreatospheres bevatte neuronen 14,15. Bollen werden onlangs ook uit embryonale pancreas voorlopercellen 16,17 en regenererende pancreata 18 met goede voorlopercellen expansie en de daaropvolgende differentiatie, maar niet om morfogenese recapituleren.
3D-modellen van verspreide en vaak gedefinieerd cellen die zichzelf organiseren in geminiaturiseerde organen onlangs bloeide en simuleren van de ontwikkeling of volwassene omzet van meerdere organen zoals de darm 19,20, de maag 21, lever 22, de prostaat 23 en de luchtpijp 24. In sommige gevallen zijn ontwikkelings morfogenese en differentiatie zijn samengevat in 3D van ES-cellen, zoals bij optische koppen 25, 26 darm of de hersenen 27.
Hier hebben we desCribe een methode om gedissocieerde multipotente pancreas voorlopercellen uit te breiden in een 3D Matrigel steiger waar ze kunnen differentiëren en zichzelf te organiseren.
Grootschalige productie van functionele beta-cellen in vitro nog ineffectief 1. In deze uitdagende context kan ontwikkelingsbiologie studies helpen ontcijferen exacte signalen die vereist zijn voor de differentiatie van functionele beta-cellen. Dit protocol maakt het onderhoud, groei en differentiatie van embryonale pancreatische voorlopercellen in vitro. Dit omvat de vorming van insuline producerende beta-cellen die geen co-expressie andere endocriene hormonen, hebben hoge niveaus van Pdx1,…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door achtereenvolgens een NCCR Frontiers in Genetics pilot-award, de Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 en Grant 12-126875 van Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. De auteurs danken de Spagnoli lab voor het hosten van de video-opnamen.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |